DB51∕T 3184-2024 醫(yī)用供體豬 基因鑒定通則

DB51I本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定科學院?四川省人民醫(yī)院、四川泰康醫(yī)院、南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院、海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院、華愛迪眼科醫(yī)院、四川省機械研究設計院（集團）有限公司、四川省實驗動物學會醫(yī)用豬專業(yè)委員王毅、杜嘉祥、陳剛、蔣子敬、竇科峰、楊恒鈺、鐘浩、姚曉明、莊1醫(yī)用供體豬基因鑒定通則本文件規(guī)定了醫(yī)用供體豬基因鑒定的總體原則及鑒GB/T30989高通量基因測GB/T33681.1高通量基因測序樣本預處理方法第1部分：動GB/T35537高通量基因測序結GB/T38477基因表達的測定基因修飾geneticmodif基因組結構變異genomestructuralv2注：基因組結構變異包括長片段序列插入或刪除、串聯(lián)重復、染色體倒位、染色體內部或染色體之間的序列易位、高通量測序high-throughpu123455.1有效性評價樣本DNA提取可選用符合要求的市售試劑盒進行提取，也可由實驗室自配試劑進行提取。引物設判定目標基因的是否敲除，應將符合預期的條帶回收，進行測序（見結果判定3a)出現(xiàn)目標條帶，則判定基因整合有效。檢測方法跡法、免疫組化/免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸附技術、流式細胞術等方法進行檢測。建議根據(jù)不同生產工藝選擇合適的檢測方法，蛋白免疫印跡法可作為基礎方法選用，蛋白免疫印跡法檢測及判定方法可參考蛋白免疫印跡法結果判定a)成像圖片本底干凈，能觀察到轉印膜均勻的輕微背景輪廓，目標條帶清晰且不過曝，即可判b)基因整合類應有目標基因蛋白表達，敲除類應無目標基因蛋白表達。5.2遺傳穩(wěn)定性檢測醫(yī)用供體豬群體每代個體均應進行基因型鑒定和基因表達檢測，方法見5.1，應連續(xù)監(jiān)測3代以上。染色體結構變異預期基因片段插入、序列缺失、倒置、異位，則認為在醫(yī)用4脫靶檢測使用Cas-OFFinder（CRISPRRGENTools()）或類似算法模型工息和基因組參考序列一致，則認為沒有脫靶，反之則5PERVhumanmembranecofactorproteintransgenic(hCD46-tg)humandecay-acceleratingfactortransgenic(hCD55-tg)humanmembraneinhibitorofreactivelysistransgenic(hCD59-tg)humancomplement-regulatoryproteinC1inhibitortransgenic(hC1-INH-tg)HLA-E/humanbeta2-microglobulintransgenic(HLA-E/B2M-humansignalregulatoryproteinalphatransgenic(hCD47-tg)humanCTLA4-Igtransgenic(hCTLA4-Ig-porcineCTLA4-Igtransgenic(pCTLA4-Ig-tg)humandominant-negativemutantclassIItransactivatortransgenhumanthrombomodulintransgenic(hTBM-tg)humanendothelialproteinCreceptortransgenic(hEPCR-tg)humantissuefactorpathwayinhibitortransgenic(hTFPI-tg)humanectonucleosidetriphosphatediphosphohydrolase-1transgenic(hCD39-tg)humanecto-5′-nucleotidasetransgenic(hCD73-tg)humantumournecrosisfactorα–inducedprotein3(TNFAIP3)humanhaemeoxygenase1trasolublehumanTNFRI-Fctransgenic(sh6血液采集：使用紫色采血管，采集豬全血3mL～5mL。LEA29Y上游引物：5’-GTACCCACCGCCATACTAC2×酶緩沖液KODBuffer1×2注：反應體系中的各組分可根據(jù)不同最終反應體系進行區(qū)分，但是需保持所最后68℃延伸5min；反應完成后在4℃保存。7制備1%的瓊脂糖凝膠并加入染色劑，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。將10檢驗過程中分別設陽性對照、陰性對照、空白對照。采用含有LEA29Y基因的質粒作為陽性對照，WT豬的DNA作為陰性對照，采用與模板等體積a)空白對照：無PCR擴增產物條帶；在符合B.1.5的情況下，被檢樣品在573bp大小處可見PCR擴增條帶則判為陽性，LEA29Y基因整合至豬基因組上；在573bp大小處未見PCR擴增條帶利用LEA29Y蛋白與LEA29Y抗體的特異性結合，檢測抗體酶標物或標記熒光來間接鑒定LEA29Y取適量豬胰腺組織，加入100μLRIPA裂解液，冰上裂解30min。獲得胰腺組織蛋白液，取少量細胞裂解液測定蛋白濃度（可用BCA蛋白濃度測定將PVDF膜浸泡到甲醇中進行活化1min；將3張轉膜用濾紙于轉移緩沖液中浸泡5min；將轉膜夾放于盛有1×轉膜緩沖液的盤中，白板（陽極）在上，黑板（陰極）在下，由下向上依次放置1塊海綿、2層濾紙、SDS-凝膠、PVDF膜、1層濾紙，注意PVDF膜和SDS-凝膠之間不應有氣泡，最后合上轉膜夾,將其放置于轉膜槽中。轉膜槽中加入4℃冰箱預冷30min的1×轉膜液，加入冰袋，蓋上轉膜蓋。然后將轉膜槽放置于泡沫箱中，加入冰水混合物，以8在180mA恒流（或90V恒壓）條件下，轉移時間為1.5h。轉膜結束后，若Marker清晰可見，證明轉膜將PVDF膜浸入封閉液（含5%脫脂奶粉的TBST）于平板搖床上搖動封閉1h?將PVDF膜浸入含適當比例一抗的稀釋液中，在室溫下孵育1h?取出PVDF膜，浸入TBST在搖床上洗滌4次，每次5min?將PVDF膜浸入含適當比例二抗的稀釋液中，在室溫下孵育1h?孵育完成后取出PVDF膜，浸入TBST在搖床上洗滌4次，每次5min?達；若實驗組與對照組均無目的條帶，則蛋并冷凍，并儲存在-70℃。用冰凍切片機作冰凍切片風干后用丙酮固定10min～15min。用0.3%過氧化氫甲醇溶液或1%鹽酸酒精37℃作用30min。PBS漂洗3次，每次5min。5%小牛血清或1：10稀釋的正常馬血清，37℃濕盒中作用30min。9加適當稀釋的已知單抗或抗血清，37℃濕盒中作用1h后4℃過夜。PBS洗3次，每次5min。加適當稀釋的第二抗體酶結合物，37℃盒作用1h。PBS洗3次，每次5min。新鮮配制的DAB溶液顯色5min～10min后用PBS漂洗3次，每次5min。對照片本底清晰,背景無非特異著染,被檢物呈黃至棕褐色著染,即可冰凍切片取出，室溫放置使其干燥后，用冷丙酮于4℃固定10min。切片用0.01mol/LPBS清洗后加入1.2%雙氧水作用30min，以除去非特異染色。0.01mol/LPBS清洗，洗3次，每次10min。加入熒光抗體IgG，室溫育2h。0.01mol/LPBS清洗，洗3次，每次10min。用10mL注射器從豬的前腔靜脈采集8mL全血。取6mL保存在促凝采血按照酶聯(lián)免疫試劑盒所述操作步驟對待測試樣(液)進行根據(jù)待測樣本中目的蛋白的含量,選擇一個合適的質控標準,以確定試驗過程的操按照試劑盒說明書提供的計算方法,根據(jù)標準品質量濃度與吸光度變化關系繪制標準按照試劑盒說明書提供的計算方法,將待測樣品吸光度代人B.所獲得標準工作曲線,計算待測血液采集：使用紫色采血管，采集豬全血3mL～5mL。GGTA1下游引物：5’-GATCCTAATTGGGTTTGCTG2×酶緩沖液KODBuffer1×2最后68℃延伸5min；反應完成后在4℃保存。制備1%的瓊脂糖凝膠并加入染