動(dòng)物組織中氯丙嗪的殘留測(cè)定-酶聯(lián)免疫吸附法

PAGE4PAGE3動(dòng)物組織中氯丙嗪的殘留測(cè)定-酶聯(lián)免疫吸附法范圍本文件規(guī)定了動(dòng)物肌肉、肝臟、腎臟和禽蛋中氯丙嗪殘留量的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法。本文件適用于動(dòng)物肌肉、肝臟、腎臟和禽蛋中氯丙嗪殘留量的快速篩選測(cè)定。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法試樣制備采集的動(dòng)物組織應(yīng)保存于-18℃的冰柜中，用前恢復(fù)至室溫，備用。原理本方法是酶聯(lián)免疫法中的競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定法，其主要原理是：樣品中游離的氯丙嗪與酶標(biāo)板上固定的氯丙嗪抗原競(jìng)爭(zhēng)特異性抗體再通過(guò)酶標(biāo)Ⅱ抗的反應(yīng)，洗掉游離的酶標(biāo)物，再通過(guò)酶的專一性顯色劑顯色，根據(jù)顯色的深淺來(lái)判斷樣品中氯丙嗪的含量，根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)性原理，樣品中游離的氯丙嗪少，則酶標(biāo)Ⅱ抗結(jié)合多，顯色就深，相反，則顯色淺。結(jié)果可以通過(guò)在450nm處測(cè)定吸收值計(jì)算，顏色變化的程度反映樣品中氯丙嗪的含量，在一定濃度范圍內(nèi)吸光度的高低與樣品中氯丙嗪的含量成反比。試劑和材料除非另有說(shuō)明，本法所用試劑均為分析純，水符合GB/T6682二級(jí)水的規(guī)定。競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)免疫法氯丙嗪試劑盒，2℃～8℃冰箱中保存。微孔板：包被有氯丙嗪抗原。氯丙嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液：0ng/mL、0.1ng/mL、0.3ng/mL、0.6ng/mL、1.25ng/mL、5.00ng/mL。酶標(biāo)物凍干粉：1瓶。酶標(biāo)物稀釋液：13mL，1瓶。酶標(biāo)物溶液：臨用前取酶標(biāo)物凍干粉，準(zhǔn)確加入酶標(biāo)物稀釋液12mL，搖勻。顯色劑：13mL，1瓶。終止液：13mL，1瓶。樣品稀釋液：用水10倍稀釋廠商提供的濃縮樣本稀釋液。清洗液：用水10倍稀釋廠商提供的濃縮洗滌液。氫氧化鈉。甲醇。氫氧化鈉甲醇溶液：稱取0.1g氫氧化鈉,用甲醇溶解定容至100mL。儀器和設(shè)備酶標(biāo)儀（配備450nm濾光片）。振蕩器。離心機(jī)，不低于6000r/min。分析天平：感量0.00001g，感量0.001g，感量0.01g。組織勻漿機(jī)，不低于10000r/min。氮吹儀。微量加樣器及配套吸頭：?jiǎn)蔚?0μL，50μL，100μL，1000μL，多道50μL～300μL。測(cè)定步驟樣品處理稱取2.0+0.05g均質(zhì)后的組織樣本于50ml離心管中，分別加入2ml2.5%三氯乙酸，6m乙腈，渦動(dòng)5min，4000g以上，離心5min，取2ml上層液于50ml離心管中加入2ml的3M氫氧化鈉溶液，再加入4.5ml的正已烷，渦動(dòng)5min，4000g以上，離心5min，取上層有機(jī)相3ml于干凈離心管管中，50-60℃水浴氮?dú)獯蹈?，加?.5ml復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動(dòng)1min，溶解干燥的殘留物，取50μL進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)試程序測(cè)定在室溫20℃～25℃條件下操作，測(cè)定之前將試劑盒以及所有試劑在室溫（20℃～25℃）下放置1h～2h。將足夠標(biāo)準(zhǔn)和樣品所用數(shù)量的微孔條插入微孔架，標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，記錄下標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。分別在各孔中加50μL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液。分別在各孔中加100μL的酶標(biāo)物溶液。蓋好蓋板膜，輕輕晃動(dòng)反應(yīng)板數(shù)秒，25±2℃反應(yīng)10min。傾出微孔中的液體，加250μL清洗液，輕輕振蕩30s，傾出微孔中的洗滌液，在吸水紙上拍打，徹底清除微孔中的殘留液和氣泡，重復(fù)上述操作3遍。立即在每孔中加入100μL顯色劑。蓋好蓋板膜，輕輕晃動(dòng)反應(yīng)板數(shù)秒，25±2℃反應(yīng)10min。每孔加100μL終止液（推薦使用多通道加樣器），輕輕振蕩混勻，10min內(nèi)在450nm下檢測(cè)吸光度。結(jié)果判定和表述按下式計(jì)算百分吸光度值：百分吸光度值（%）=×100％………（1）式中：B—為標(biāo)準(zhǔn)溶液或供試樣品的平均吸光度值；Bo—為零標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)溶液平均吸光度值；用專業(yè)計(jì)算機(jī)軟件求出供試樣品中氯丙嗪的濃度，乘以稀釋系數(shù)即得檢測(cè)結(jié)果。或計(jì)算出的標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)吸光度值繪成為一個(gè)對(duì)應(yīng)濃度（ng/mL）的半對(duì)數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖，校正曲線在0.1ng/mL～5ng/mL范圍內(nèi)應(yīng)當(dāng)成為線性。相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度（ng/mL）可以從校正曲線上讀出。檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度靈敏度本方法在動(dòng)物肌肉、肝臟、腎臟和禽蛋等組織中的檢出限為0.5μg/kg。準(zhǔn)確度本方法在100μg/kg