《DNA重組的載體》課件

DNA重組的載體什么是DNA重組？1基因工程DNA重組是基因工程的核心技術(shù)，指的是將不同來源的DNA片段連接在一起，形成新的重組DNA分子。2目標(biāo)基因?qū)⒛康幕虿迦氲捷d體中，形成重組載體，再將重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，實現(xiàn)目的基因的復(fù)制、表達(dá)和功能研究。3新DNA分子通過DNA重組技術(shù)可以創(chuàng)造出新的基因型，改變生物體的性狀，例如，將抗蟲基因?qū)胫参?，培育抗蟲作物。DNA重組的原理1識別和切割使用限制性內(nèi)切酶識別并切割特定DNA序列，生成帶有黏性末端的DNA片段。2連接通過DNA連接酶將帶有相同黏性末端的DNA片段連接起來，形成重組DNA分子。3轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞將重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞，例如細(xì)菌或酵母菌，使其復(fù)制和表達(dá)。DNA重組的目的和應(yīng)用目的DNA重組技術(shù)允許科學(xué)家改變生物體的遺傳物質(zhì)，以改善其特征或創(chuàng)造具有新功能的生物體。應(yīng)用DNA重組技術(shù)的應(yīng)用廣泛，包括藥物開發(fā)，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，環(huán)境保護(hù)等。載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)兼容性載體應(yīng)該與宿主細(xì)胞兼容，能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和表達(dá)外源基因。大小載體的尺寸應(yīng)適合于克隆的外源基因，同時要保持宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。多克隆位點載體應(yīng)該具有多個限制性內(nèi)切酶位點，以便能夠在特定位置插入外源基因。選擇標(biāo)記載體應(yīng)該帶有選擇標(biāo)記基因，用于篩選含有重組載體的宿主細(xì)胞。質(zhì)粒載體質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞中獨立于細(xì)菌染色體之外的環(huán)狀雙鏈DNA分子，能在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，并能穩(wěn)定地遺傳下去。質(zhì)粒載體是指經(jīng)過改造，可以作為外源DNA片段的運載工具的質(zhì)粒。質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)質(zhì)粒載體是環(huán)狀的雙鏈DNA分子，通常含有以下幾個關(guān)鍵區(qū)域：復(fù)制起點（ori）：使質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中復(fù)制。選擇標(biāo)記基因（selectionmarker）：用于篩選含有質(zhì)粒的細(xì)菌，通常是抗生素抗性基因。多克隆位點（MCS）：多個限制酶識別位點，用于插入外源DNA片段。啟動子（promoter）：控制外源基因的表達(dá)。終止子（terminator）：終止外源基因的轉(zhuǎn)錄。質(zhì)粒復(fù)制機(jī)制1自主復(fù)制質(zhì)粒具有獨立于宿主染色體的復(fù)制起點，可以自主復(fù)制。2復(fù)制方式質(zhì)粒主要采用滾環(huán)復(fù)制或θ復(fù)制方式進(jìn)行復(fù)制。3復(fù)制頻率質(zhì)粒復(fù)制頻率與復(fù)制起點和復(fù)制起始蛋白有關(guān)。質(zhì)粒選擇標(biāo)記質(zhì)粒選擇標(biāo)記使我們能夠識別和選擇包含重組質(zhì)粒的細(xì)菌。通過選擇標(biāo)記基因編碼的抗性，僅攜帶質(zhì)粒的細(xì)菌才能在含有抗生素的培養(yǎng)基中存活。常用的選擇標(biāo)記包括抗生素抗性基因，如氨芐青霉素抗性基因（AmpR）和卡那霉素抗性基因（KanR）。質(zhì)粒與外源DNA的連接1限制性內(nèi)切酶切割特定序列2連接酶連接DNA片段3載體運載外源DNA噬菌體載體噬菌體載體是利用噬菌體（病毒）的基因組作為載體，將外源DNA片段插入噬菌體基因組中，并利用噬菌體的感染和復(fù)制過程將外源DNA片段擴(kuò)增和傳播的一種基因克隆載體。噬菌體載體具有感染效率高、包裝能力大、克隆容量大等優(yōu)點，在基因克隆和基因表達(dá)中具有廣泛的應(yīng)用。噬菌體載體的結(jié)構(gòu)特點噬菌體載體通常由頭部、尾部和衣殼蛋白組成。頭部包含噬菌體的遺傳物質(zhì)DNA或RNA，尾部用于吸附宿主細(xì)菌并注入遺傳物質(zhì)。噬菌體載體具有以下結(jié)構(gòu)特點：擁有自己的復(fù)制起點，可以獨立復(fù)制能夠包裝成病毒顆粒，易于傳播載體容量較大，可以容納較大的外源DNA片段噬菌體生活周期吸附噬菌體通過其尾部纖維特異性地吸附到宿主細(xì)菌表面的受體上。侵入噬菌體通過尾部鞘的收縮將自身的DNA注入宿主細(xì)菌體內(nèi)。復(fù)制噬菌體的DNA進(jìn)入宿主細(xì)菌后，利用宿主細(xì)胞的物質(zhì)和能量進(jìn)行復(fù)制，產(chǎn)生大量的子代噬菌體DNA和蛋白質(zhì)。組裝復(fù)制出來的噬菌體DNA和蛋白質(zhì)組裝成新的噬菌體顆粒。裂解新組裝的噬菌體顆粒裂解宿主細(xì)菌，釋放出來，感染新的宿主細(xì)菌。噬菌體DNA克隆策略1整合型將外源DNA整合到噬菌體基因組中2替換型用外源DNA替換噬菌體基因組的部分片段3附加型將外源DNA插入噬菌體基因組的非必需區(qū)域人工染色體載體酵母人工染色體(YAC)包含酵母染色體復(fù)制起始點，著絲粒和端粒，可容納大型DNA片段細(xì)菌人工染色體(BAC)基于細(xì)菌F因子，適用于克隆大型基因組片段，穩(wěn)定性高人工染色體的分類酵母人工染色體(YAC)用于真菌基因組研究，可克隆大片段DNA。細(xì)菌人工染色體(BAC)穩(wěn)定遺傳，適用于大型基因組的物理圖譜構(gòu)建。P1人工染色體(PAC)介于質(zhì)粒和BAC之間，可克隆100-300kb的DNA片段。酵母人工染色體酵母細(xì)胞酵母是一種單細(xì)胞真菌，是基因工程中常用的宿主細(xì)胞。人工染色體酵母人工染色體(YAC)是一種基因工程載體，可以承載大片段外源DNA。細(xì)菌人工染色體細(xì)菌人工染色體（BAC）是一種人工構(gòu)建的染色體載體，通常以大腸桿菌為宿主。BAC的結(jié)構(gòu)類似于細(xì)菌的天然染色體，包含一個復(fù)制起點，一個選擇標(biāo)記，以及一個插入外源DNA片段的區(qū)域。BAC的大小通常為100-300kb，能夠容納較大的外源DNA片段，使其成為克隆和分析大型基因組片段的理想工具。人工染色體的優(yōu)缺點優(yōu)點可以克隆更大的DNA片段。適合克隆大型基因組，例如真核生物的基因組。優(yōu)點可以進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控。人工染色體可以整合到宿主細(xì)胞的基因組中，從而對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。缺點構(gòu)建過程比較復(fù)雜。需要進(jìn)行大量的基因工程操作。缺點穩(wěn)定性可能不如天然染色體。人工染色體在宿主細(xì)胞中可能不穩(wěn)定，容易丟失。其他類型的載體病毒載體病毒載體具有較大的插入片段容量，可用于構(gòu)建基因治療載體，并能高效地將基因傳遞到宿主細(xì)胞。人工酵母染色體人工酵母染色體（YAC）可承載更大的DNA片段，適用于基因組克隆和基因表達(dá)研究。轉(zhuǎn)座子載體轉(zhuǎn)座子載體能隨機(jī)插入宿主基因組，用于基因突變、基因插入和基因功能研究。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)1高效大腸桿菌生長迅速，易于培養(yǎng)，并且能夠高效地表達(dá)外源基因。2成本低大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建和操作成本相對較低，適合大規(guī)模生產(chǎn)。3成熟大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)展成熟，積累了豐富的經(jīng)驗和技術(shù)。酵母表達(dá)系統(tǒng)高效酵母表達(dá)系統(tǒng)效率高，可以產(chǎn)生大量的目標(biāo)蛋白。易于操作酵母培養(yǎng)和操作相對簡單，適合大規(guī)模生產(chǎn)。成本低酵母培養(yǎng)成本低，適合商業(yè)化生產(chǎn)。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)蛋白質(zhì)修飾哺乳動物細(xì)胞可以進(jìn)行復(fù)雜蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，如糖基化和磷酸化，這對于某些蛋白質(zhì)的功能至關(guān)重要。人體相關(guān)性哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)更接近于人體環(huán)境，因此更適合研究人體蛋白質(zhì)和藥物。應(yīng)用范圍廣泛應(yīng)用于藥物研發(fā)、疫苗生產(chǎn)、生物材料和診斷試劑等領(lǐng)域。選擇合適的重組載體實驗?zāi)康牟煌妮d體適用于不同的實驗?zāi)康?，例如基因表達(dá)、基因敲除或基因沉默。宿主細(xì)胞類型載體應(yīng)該與宿主細(xì)胞相容，確保外源基因能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)和復(fù)制。載體類型質(zhì)粒、噬菌體或人工染色體等載體類型應(yīng)根據(jù)實驗需求選擇。外源基因的大小載體的容量應(yīng)足夠容納外源基因，并保證其功能的完整性。載體的構(gòu)建和測試1構(gòu)建載體2連接外源DNA3轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞4篩選和鑒定載體的擴(kuò)增和保存1擴(kuò)增在構(gòu)建載體并測試其功能后，需要大量擴(kuò)增載體以用于后續(xù)的基因克隆實驗。2保存為了防止載體降解和污染，需要將載體保存在合適的條件下，例如低溫保存。3方法常用的擴(kuò)增方法包括細(xì)菌培養(yǎng)和質(zhì)粒提取，保存方法包括低溫凍存和干燥保存。載體的轉(zhuǎn)化方法1化學(xué)轉(zhuǎn)化法2電轉(zhuǎn)化法3噬菌體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化化學(xué)轉(zhuǎn)化法是利用化學(xué)試劑處理細(xì)菌，使其細(xì)胞壁暫時變得通透，從而使載體DNA進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞。電轉(zhuǎn)化法則是利用電脈沖短暫地改變細(xì)菌細(xì)