藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)載體docorppt課件

1、.,1,藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)載體-ABC類載體,.,2,一、 ABC類轉(zhuǎn)運(yùn)體 ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette，ABC)類物質(zhì)外排轉(zhuǎn)運(yùn)載體。 這類轉(zhuǎn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)各種類型的底物如糖、氨基酸、金屬離子、多肽、蛋白質(zhì)以及各種脂溶性物質(zhì)外排式跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。 ABC類載體是許多生命過程必須的，缺陷可以引起多種疾病或與多種疾病有關(guān)如囊性纖維化、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、視網(wǎng)膜變性、膽固醇和膽汁轉(zhuǎn)運(yùn)缺失、貧血癥和藥物反應(yīng)異常等。,.,3,特點(diǎn)： 1。與ATP結(jié)合，利用ATP跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)。底物分子轉(zhuǎn)運(yùn)是單向的，通常是泵出細(xì)胞外。 2。結(jié)構(gòu)上：ATP-結(jié)合域, 稱之為核苷結(jié)合包( NBF) 和跨膜(TM)域。該域一般

2、由6個-螺旋段組成。NBF 含3個保守區(qū)域Walker A、Walker B和Walker C。在Walker A和B存在ATP結(jié)合點(diǎn)，而Walker C 為一簽名區(qū), 位于Walker B 的上游，C 區(qū)是相應(yīng)ABC載體特有性的。 3。典型的ABC 載體有兩個NBF 和兩個TM域, NBF 存在于胞漿側(cè)。,.,4,發(fā)現(xiàn)48 個ABC 載體。 這些基因根據(jù)區(qū)域的構(gòu)成和氨基酸的同組關(guān)系分成7個亞型。 許多ABC載體在脂質(zhì)層的功能維持、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和類固醇類轉(zhuǎn)運(yùn)方面有重要的作用。 已發(fā)現(xiàn)14種與人類疾病相關(guān)的ABC基因,.,5,ABCC2（Abcc2）基因突變：與Dubin-Johnson 綜合征有

3、關(guān)。 ABCC2 蛋白存在于肝細(xì)胞的管側(cè)面膜上調(diào)節(jié)有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)。在多有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體（TR-）的缺陷的大鼠中，該大鼠已用作Dubin-Johnson 綜合征的動物模型。 ABCB7基因的錯義與成高鐵紅細(xì)胞貧血癥和失調(diào)（XLSA/A）相關(guān)。,.,6,CFTR 蛋白為氯離子通道，與所有外分泌有關(guān)，缺陷導(dǎo)致膽囊纖維病變。 ABCC8 是磺酰脲受體，對磺酰脲藥物有高度的親和力?；酋ｋ孱愃幬餅橹委煼且葝u素依賴性糖尿病，主要促進(jìn)胰島素的分泌。 ABCC8基因突變可能type II 糖尿病有關(guān) 。,.,7,二、多藥耐藥（藥物外排載體） 所有ABC的外排在體均存在于細(xì)胞膜上， 參與各種結(jié)構(gòu)類型的藥物、代謝

4、物和化合物的外排。根據(jù)結(jié)構(gòu)類型，藥物外排載體分為四大類 。,.,8,ABC家族藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體的預(yù)測二級結(jié)構(gòu)。NBD, （ATP）核苷結(jié)合點(diǎn), IN, 細(xì)胞內(nèi),OUT 細(xì)胞外,.,9,藥物載體在極性細(xì)胞（包括組織內(nèi)皮或上皮細(xì)胞）中的定位。,.,10,1. MDR1 P-糖蛋白(MDR1 P-glycoprotein) ABCB1. 又稱為MDR1，P-GP 或PGY1。,人,MDR1,MDR3,藥物,藥物，脂質(zhì),MDR基因,MDR基因,Mdr1a/mdr1b,mdr2,藥物,藥物，脂質(zhì),.,11,P-GP 有兩個相似和對稱的半載體組成,每個半載體有一個ATP結(jié)合點(diǎn)和6個TM域。兩個半載體只有43%

5、氨基酸序列是一致的。,.,12,先與ATP結(jié)合，再水解是藥物轉(zhuǎn)運(yùn)必需的。,不同的底物轉(zhuǎn)運(yùn)需要的ATP分子是不同的，每轉(zhuǎn)運(yùn)一個藥物分子出細(xì)胞,需要0.3-3個分子的ATP。,.,13,P-gp 催化循環(huán). 藥物和 ATP與Pgp 結(jié)合,.,14,P-GP轉(zhuǎn)運(yùn)柔紅霉素(DNR) 跨膜兩步過程。環(huán)孢素A (CsA), XR9576 (XR) 和長春堿 (VL)在細(xì)胞漿側(cè)面阻斷, 維拉帕米(VER)在細(xì)胞外側(cè)阻斷(優(yōu)先占領(lǐng)).,.,15,2. P-GP 底物 P-GP有各種類型的底物如秋水仙堿阿霉素、長春堿、脂質(zhì)、類固醇、化學(xué)異物和多肽等. 似乎無共性 1）多數(shù)底物是兩性分子 2)化合物脂溶性和氫鍵的

6、數(shù)目決定底物與P-GP親和力的重要參數(shù)。 脂溶性大或氫鍵數(shù)目多，P-GP的親和性高. 電子供體基團(tuán)間距離有一定范圍是識別P-GP結(jié)合點(diǎn)必需的，至少其中一個2.5 0.3，另一個為4.6 0.6,.,16,MDR1 P-GP 抑制劑 第一代P-GP抑制劑如維拉帕米、環(huán)孢素 A 第二代或第三代抑制劑 PSC 833, GF120918,.,17,P-GP生理功能 1) 腫瘤細(xì)胞 耐藥原因之一 誘導(dǎo)性 2）正常體內(nèi)：生理性屏障（腸上皮、腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽小管上皮細(xì)胞、胎盤合胞體滋養(yǎng)細(xì)胞）,.,18,1) 血腦屏障 在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞腔側(cè)面表達(dá)豐富的P-GP, 成為許多藥物難以通過血腦屏障的原因;,.,

7、19,.,20,.,21,.,22,一些疾病如癲癇誘導(dǎo)P-GP表達(dá), 成為頑固性癲癇的原因之一 炎癥下調(diào)P-GP表達(dá),導(dǎo)致血腦屏障的通透性顯著增加.,.,23,Fig. Western blot showed expression of P-gp from the cerebral cortex of normal rats and PTZ-kindled rats. n=3. (*p0.01 vs Normal),.,24,Fig. P-gp functional activity in hippocampus and cerebral cortex of normal rats and P

8、TZ-kindled rats. Samples of 60min after a single dose of 0.2mg/kg Rh123. n=4. (*p0.05, *p0.01 vs Normal),.,25,Fig . Distribution of PB in brain tissues of normal rats, kindled rats and kindled rats treated with CsA(5 mg/kg). Samples of 60min after a single dose of 10mg/kg PB. Data were expressed as

9、ratio values as meanSD ( n=4). (*p0.05, *p0.01 vs normal rats, #p0.05, #p0.01 vs kindled rats).,.,26,.,27,2)在肝-膽和腸中作用 生物利用度的原因,.,28,(1) 保護(hù)機(jī)制 防止毒物由胃腸道進(jìn)入體內(nèi)。 (2）腸上皮細(xì)胞中P-GP分泌功能成為許多藥物吸收差的原因之一, 成為藥物口服吸收的障礙。,.,29,野生型小鼠灌胃 50 mg/kg 紫衫醇約有95%的藥物原型從糞中排泄. 同時口服P-GP抑制劑環(huán)孢素A( 50 mg/kg), PSC 833(50 mg/kg), GF120918(2

10、5 mg/kg), LY335979(80mg/kg) 或R101933(80 mg/kg) , 顯著降低糞中原型藥物的排謝分?jǐn)?shù)，分別為32.4%, 12.5%, 6.2%, 34.9%和73.6%。 在mdr1a/1b基因敲除小鼠，糞中原型排泄分?jǐn)?shù)只有6%。,.,30,3) P-gP介導(dǎo)的藥物外排,符合載體轉(zhuǎn)運(yùn)的特點(diǎn)，存在飽和特性 某些底物的M-M常數(shù),.,31,不同底物和劑量腸道P-GP的作用是不同的。 A. 地高辛通常劑量是0.5到1mg，腸內(nèi)的濃度不到10mol/l，低于Km 58 mol/l。P-Gp 在吸收方面有重要的意義，可能是該藥物吸收程度地和變異大的主要原因。 B. 劑量大于

11、50mg，腸內(nèi)藥物濃度達(dá)到mmol/l 水平， 可能超過相應(yīng)藥物的Km 值，P-GP的活性處于飽和，P-GP對藥物吸收的貢獻(xiàn)不大。,.,32,Indinavir：P-GP的底物，劑量高達(dá) 800mg，腸內(nèi)濃度超過 1 mmol/L, 遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Km 140 mol/L， p-GP的作用對貢獻(xiàn)不大。仍然有好的生物利用度,.,33,C.一些藥物如環(huán)孢素（200700mg）、紫杉醇（100200 mg），盡管劑量很高，由于這些藥物的溶解度和釋放度低，腸內(nèi)的濃度低于Km值，但P-GP對吸收的影響仍然很大。 D. 某些藥物吸收程度隨劑量增加而增加如(S)-()-talinolol計(jì)量校正的AUC 由 12

12、.5 mg 劑量的18 g .h/l 增加到 200 mg 劑量的36g .h/l。,.,34,4) 腸中P-GP也是機(jī)體重要保護(hù)機(jī)制之一，免受各種腸中毒素的侵害。如Mdr1a缺陷小鼠產(chǎn)生一種大腸炎癥，類似人類的腸內(nèi)部炎。正常情況下，腸中的P-GP 阻止毒素進(jìn)入腸壁內(nèi). 復(fù)雜性和注意問題: 抑制胃腸道上P-GP功能, 必然降低屏障功能,增加毒物(素)進(jìn)入體內(nèi)!,.,35,腸不同部位P-GP的表達(dá)不同. 圖6. 人腸中不同部位P-gp和villin IOD ratio比值平均和變異.1/2代表十二指腸/近端空腸，3/4, 5/6, 和7/8 分別代表中段至遠(yuǎn)端空腸，近端回腸支遠(yuǎn)端回腸。,.,36

13、,3) 胎盤 屏障 P-GP 存在于胎盤合胞體滋養(yǎng)層頂側(cè)面膜。類似于血腦屏障，防止有毒物質(zhì)從母體進(jìn)入胎兒。 在P-GP缺陷或基因敲除動物，avermectin, 地高辛, saquinavir和紫杉醇通透性增加1020倍。 對于多數(shù)治療藥物而言，在胎盤上的低通透性當(dāng)然是需要的，但在有些情況下，成為治療上的障礙。如對于HIV治療，希望在嬰兒出生前，有一個合適的“負(fù)荷劑量”，降低在出生過程中母-嬰HIV感染的頻率,.,37,乳腺癌耐藥蛋白(BCRP),1.乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein ,BCRP, ABCG2）。BCRP 只有一個NBF 和TM域

14、，為半ABC 載體。,.,38,BCRP mRNA 最早發(fā)現(xiàn)于胎盤中。BCRP 首先是從乳腺癌細(xì)胞中分離得到的，稱之為乳腺癌耐藥蛋白。 第一次在耐阿霉素的MCF7乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7/AdrVp)中克隆到BCRP。鼠類命名為Bcrp1 BCRP 是細(xì)胞株對絲裂霉素、阿霉素和柔紅霉素抗癌藥物等產(chǎn)生耐藥的主要原因。 BCRP主要在細(xì)胞膜上，存在于細(xì)胞的頂側(cè)面上.,.,39,2. BCRP/Bcrp1 介導(dǎo)的耐藥 BCRP 的底物與P-GP, MRP1和MRP2的底物間有較大的重疊性 細(xì)胞株對絲裂霉素, 拓樸替康, 9-氨基喜樹堿, 柔紅霉素, SN-38, flavopiridol, 吲哚咔唑

15、, 拓樸酶抑制劑( NB-506 和 J-107088) , 細(xì)胞染料如羅丹明123, Lysotracker綠 , BBR3390以及熒光素-BODIPY-prazosin. 對長春新堿, 紫杉醇和順鉑等抗癌藥無耐藥性,.,40,不同藥物誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果往往存在差異。某些藥物誘導(dǎo)表達(dá)BCRP細(xì)胞株對蒽醌類有很高的耐藥性, 而另一些藥物誘導(dǎo)BCRP表達(dá)的細(xì)胞株, 相對絲裂霉素而言，則對蒽醌類幾乎沒有耐藥性。 有些誘導(dǎo)表達(dá)BCRP細(xì)胞株對拓樸替康的耐藥性相當(dāng)高, 但另一些誘導(dǎo)表達(dá)BCRP細(xì)胞株的耐藥很低,.,41,存在兩種突變株： 野生型 482 位上的氨基酸為Arg 兩種突變型:Thr和Gly。

16、 不同的BCRP對底物的作用不同。,.,42,野生型與突變型比較 野生型 突變型 482 位A Arg Thr或Gly 底物 葉酸及其衍生物 + - 羅丹明123 - + LysoTracker 綠 - + 柔紅霉素 - + 絲裂霉素 + + bodipy-prazosin + + Hoechst 33342 + + 抑制劑新生霉素 + -,.,43,3. BCRP/Bcrp1 抑制劑 （1）GF120918 ; P-GP 抑制劑，也是有效的BCRP/Bcrp1 抑制劑; 抑制藥物外排泵BCRP和P-GP （2）fumitremorgin C (FTC), 是有效的BCRP-抑制劑,但在體有神

17、經(jīng)毒性， 其中兩種類似物Ko132和 Ko134) 活性比FTC大，Ko134 細(xì)胞毒性很低，在體可以用很高劑量, 可以顯著增加小鼠口服拓?fù)涮婵档纳锢枚?。,.,44,（3）某些HIV 蛋白酶抑制劑強(qiáng)效的BCRP抑制劑.z在表達(dá)野生型BCRP的HEK細(xì)胞株中，ritonavir,saquinavir 和nelfinavir 是有效地抑制 BCRP介導(dǎo)的絲裂霉素轉(zhuǎn)運(yùn)，其IC50 分別為19.5, 19.5 和 12.5 mol/l。,.,45,（4）植物酚類化合物 ：5,7-二羥黃酮(Chrysin) 和biochanin A ，silymarin, 橙皮素（hesperetin）, 櫟精（

18、quercetin）, 黃豆苷（daidzein）, stilbene resveratrol。 （5）香豆霉素抗生素：新生霉素 （6）酪氨酸激酶抑制劑 ：STI-571(imatinib mesylate), ZD1839 (Iressa; gefitinib) 和 N-4-(3-溴苯)胺-6-喹唑啉-2-丁胺 (EKI-785),.,46,4. BCRP/Bcrp1 組織分布 在人的胎盤中，BCRP mRNA 表達(dá)非常高，而在鼠類胎盤相對弱。 相反，在小鼠的腎臟表達(dá)最高，而在人的腎臟表達(dá)低表達(dá)。 BCRP 在胎盤合胞體滋養(yǎng)層膜的母體側(cè)、在肝細(xì)胞的膽管側(cè)、腸的腔面?zhèn)饶?，與MDR1 P-GP的

19、定位相似。BCRP 也存在與乳腺的小葉和排泄管的頂側(cè)面。,.,47,BCRP 高表達(dá)于鼠原始造血干細(xì)胞中。分化的造血干細(xì)胞系中，幾乎不表達(dá)，但前紅細(xì)胞和自然殺傷淋巴細(xì)胞可以表達(dá)Bcrp1。 在人中，BCRP表達(dá)與鼠相類似，在干細(xì)胞中有較高的表達(dá)，而在起源細(xì)胞表達(dá)降低，只有在自然殺傷細(xì)胞和成紅血球細(xì)胞表達(dá)，而在其他分化的細(xì)胞中沒有表達(dá) BCRP 在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞高度表達(dá), 表達(dá)量高于MDR和MRP1.,.,48,3. BCRP/Bcrp1藥理生理作用 1） BCRP分布與P-GP有重疊性 提示BCRP/Bcrp1 的作用類似P-GP 。,.,49,2）保護(hù)機(jī)制 阻止從胃腸吸收毒物吸收,促進(jìn)排泄

20、脫鎂葉綠(甲酯-)酸 A（PHA）是葉綠素一種降解產(chǎn)物，為一種光毒性成分。PHA在體內(nèi)外排轉(zhuǎn)運(yùn)是BCRP介導(dǎo)的，為ABCG2的特異性底物。 一項(xiàng)研究顯示Bcrp1/ 小鼠對的PHA光毒敏感性是的野生鼠100 倍以上，在敏感性增加的同時，伴隨隨高的血藥濃度。與正常食物比較，喂養(yǎng)含PHA 或含20%紫花苜蓿食物后，血藥濃度分別增加17和24倍，而野生鼠喂養(yǎng)任何食物，血漿中PHA濃度都在檢測濃度以下.,.,50,3）血腦屏障的重要組成部分之一。 與野生型鼠比較, mdr1a缺陷小鼠和野生型小鼠,長春堿腦攝取增加2倍,但哌唑嗪攝取不變不影響,絲裂霉素的攝取反而有所降低。 合用GF120918使哌唑嗪和

21、絲裂霉素轉(zhuǎn)運(yùn)增加2.1和3倍, 但GF120918不影響長春堿的轉(zhuǎn)運(yùn)。 在野生型鼠，PSC833增加長春堿的腦攝取, 但不影響和絲裂霉素的攝取。合用GF120918使哌唑嗪和絲裂霉素?cái)z取分別增加1.5和2倍, GF120918也使長春堿的攝取增加。 abcg2 mRNA 主要在腦微血管中表達(dá)，約是皮層的700 倍。,.,51,（4）在骨髓細(xì)胞的 “傍細(xì)胞群” （side population，SP）中作用。 從骨髓中分離到一類細(xì)胞，這類細(xì)胞用Hoechst 33342染色，結(jié)合雙波長熒光顯示淺紅色和淺藍(lán)色熒光，用維拉帕米預(yù)處理，淺著色細(xì)胞消失。這類細(xì)胞稱之為傍細(xì)胞群。 ？ 淺著色提示細(xì)胞內(nèi)Ho

22、echst 33342濃度低，研究顯示在SP細(xì)胞中表有BCRP/Bcrp1，促進(jìn)Hoechst 33342外排所致. SP中富含未分化的干細(xì)胞，而在分化的干細(xì)胞系中BCRP/Bcrp1表達(dá)低或缺乏。類似SP也出現(xiàn)在骨骼肌和胚胎等其他組織干細(xì)胞, 伴隨Bcrp1 的高表達(dá). BCRP/Bcrp1高表達(dá)可能是各種干細(xì)胞的一般特性.,.,52,功能？ ABCG2 基因缺陷引起骨髓中和骨骼肌中SP細(xì)胞數(shù)降低，用轉(zhuǎn)染BCRP（-/-）骨髓細(xì)胞移植小鼠內(nèi)導(dǎo)致細(xì)胞再注入（repopulation）能力降低，造血細(xì)胞對絲裂霉素敏感性增加 ,與正常小鼠比較，Mdr1a/1b 和 Bcrp1缺陷小鼠研究的各種造血

23、功能正常，在SP幾乎消失.血祖先細(xì)胞對絲列霉素的敏感性增加。 用 Bcrp+/+ 和Bcrp-/- 小鼠祖先細(xì)胞研究顯示，在正常氧功能條件下，兩種細(xì)胞的克隆數(shù)相同，但缺氧條件下，Bcrp-/- 小鼠祖先細(xì)胞的克隆數(shù)下降。阻斷BCRP功能顯著降低Bcrp+/+ 在缺氧條件下的生存力 。,.,53,ABCG2 mNRA 在造血干細(xì)胞（SP, 34+/38-. 34+/KDD+細(xì)胞群）中表達(dá)高，而在定向分化的祖細(xì)胞（34+/33+, 34+/10+）中表達(dá)顯著下降。在大多數(shù)成熟細(xì)胞中, 表達(dá)低, 但在自然殺傷細(xì)胞和成紅血球細(xì)胞表達(dá)高。ABCG2可能對造血干細(xì)胞中SP形成起重要的貢獻(xiàn)。 在定向分化階段，ABCG2 下調(diào)，暗示該基因可能在多能干細(xì)胞方面有獨(dú)特的生理功能.,.,54,P-GP, MRP1和 MRP 2 的協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn),1. 協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn) 許多ABC載體能同時轉(zhuǎn)運(yùn)多種不同底物，可能存在協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)，增加轉(zhuǎn)運(yùn)效率。 MRP1轉(zhuǎn)運(yùn)長春新堿和依托甙需要還原型GSH參與。GSH 促進(jìn) MRP1依賴性的依托甙或長春新堿轉(zhuǎn)運(yùn)，長春新堿和依托甙也刺激MRP1-依賴性的GSH.,.,55,用轉(zhuǎn)染的MRP2的Sf9細(xì)胞膜囊攝取試驗(yàn)顯示不同物質(zhì)對MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)雌二醇-17-葡萄糖醛酸甙作用不同，4種類型：1