《分子熒光光度法》PPT課件.ppt

1、分 子 熒 光 光 度 法,第一節(jié) 概 述 一、光致發(fā)光 物質(zhì)分子吸收特定波長的光能后，由基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)。處于激發(fā)態(tài)的物質(zhì)分子是不穩(wěn)定的，可能通過輻射（發(fā)光）或非輻射的形式放出多余的能量，由激發(fā)態(tài)重新回到基態(tài)。物質(zhì)分子吸收外來光被激發(fā)后所產(chǎn)生的發(fā)光現(xiàn)象，叫光致發(fā)光。 熒光 10-910-6s 實(shí)用 磷光 10-310s 不實(shí)用 二、熒光光度法 利用測量熒光強(qiáng)度而建立起來的一類測定物質(zhì)含量的分析方法，稱為熒光光度法，即熒光法。,優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，10-710-9g/ml，比紫外分光光度法靈敏度高101000倍。 第二節(jié) 基本原理 一、熒光的產(chǎn)生 基態(tài) 激發(fā)光 激發(fā)態(tài) 去激發(fā) 基態(tài) （一）激發(fā) 處

2、于基態(tài)的物質(zhì)分子吸收光能時，其電子對中的一個電子被激發(fā)到某一較高能級。 基態(tài)單重態(tài) 所有電子都自旋配對的分子電子態(tài)。 激發(fā)態(tài) 激發(fā)單重態(tài) S1 S2 激發(fā)三重態(tài) T1 T2 (二)去激發(fā) 指分子中處于激發(fā)態(tài)的電子以輻射或非輻射方式回到基態(tài)的過程。,輻射躍遷 熒光 去激發(fā) 磷光 振動馳豫 無輻射躍遷 內(nèi)轉(zhuǎn)移 （熱的形式） 體系間跨越 外轉(zhuǎn)移 1、振動馳豫 同一電子能級中，電子由高振動能級躍遷到低振動能級，并將能量以熱的形式傳遞給溶劑分子，這一過程稱振動馳豫。 2、內(nèi)轉(zhuǎn)移 兩個相鄰電子能級相距較近，以致其振能級重疊時，電子由高電子能級躍遷至低電子能級，同時將能量以熱的形式傳遞給溶劑分子。,意義：無

3、論分子中的電子最初被激發(fā)至哪一激發(fā)單重態(tài)（如S1、S2、S3)，它都能通過內(nèi)轉(zhuǎn)移和振動馳豫到達(dá)S1的最低振動能級上。 一般情況下，S1與S0之間很難發(fā)生內(nèi)轉(zhuǎn)移；T1與S0之間發(fā)生內(nèi)轉(zhuǎn)移的幾率要大些。 3、體系間跨越 電子由激發(fā)單重態(tài)向激發(fā)三重態(tài)的無輻射躍遷稱為體系間跨越。常見于含重原子(I、Br)的有機(jī)分子中。 4、外轉(zhuǎn)移 激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)相互作用，以熱的形式失去多余的能量回到基態(tài)，這一過程叫分子的外轉(zhuǎn)移。外轉(zhuǎn)移后，分子的熒光或磷光減弱或消失，稱“猝滅”或“熄滅”。磷光壽命長，發(fā)生外轉(zhuǎn)移機(jī)率大，所以室溫下很難見到磷光。,5、熒光發(fā)射 電子由第一激發(fā)單重態(tài)S1（最低振動能級）躍遷至

4、基態(tài)S0而發(fā)射的光叫熒光。 6、磷光發(fā)射 電子由第一激發(fā)三重態(tài)T1躍遷至基態(tài)S0而發(fā)射的光叫磷光。 躍遷方式 時間 振動馳豫 10-12 10-14 S 內(nèi)轉(zhuǎn)移 10-11 10-13 S 熒光 10-6 10-9 S 磷光 10-4 10 S,二、影響熒光的因素 熒光效率： f = 發(fā)射熒光的分子數(shù) 被激發(fā)的分子總數(shù) 熒光效率越大，表示分子產(chǎn)生熒光的能力越強(qiáng)。 1、分子結(jié)構(gòu) (1)*躍遷能產(chǎn)生較強(qiáng)熒光。產(chǎn)生熒光的主要躍遷類型 (2)含-共軛體系的有機(jī)分子，電子共軛程度越大，熒光效率越大。 (3)剛性結(jié)構(gòu)和共平面效應(yīng)：隨分子的剛性和共平面性增加，電子共軛程度亦增加，熒光效率增大。 (4)取代基

5、效應(yīng)：斥電子基f 吸電子基 f 重原子f,2、環(huán)境因素 (1)溫度 溫度熒光效率 (2)溶劑 極性 熒光 (3)溶液pH值 影響熒光物質(zhì)存在形式。因此要嚴(yán)格控制溶液pH值。 (4)熒光熄滅劑（鹵素離子、重金屬離子等等） 3、熒光物質(zhì)濃度 自熄滅：當(dāng)熒光物質(zhì)高到一定濃度時，熒光分子間碰撞增多，使熒光強(qiáng)度減弱的現(xiàn)象。,原理圖 熒光測量應(yīng)在垂直激發(fā)光方向上進(jìn)行。 一、光源 特點(diǎn)：光強(qiáng)度大，適用范圍寬。 常用：高壓汞燈，氙燈，溴鎢燈，激光，脈沖激光 二、單色器 干涉濾光片，光柵 三、樣品池 石英杯 四、檢測器 光電倍增管,第三節(jié) 熒光光度計(jì),日立850型熒光分光光度計(jì),第四節(jié) 定量分析方法 原理：一定

6、條件下，熒光強(qiáng)度（If)與濃度(c)呈線性關(guān)系。 If = Kc 定量分析的依據(jù) 方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)對比法,第五節(jié) 分析條件的選擇 線性范圍、激發(fā)光波長、熒光波長、散射光的排除 一、線性范圍的選擇 熒光物質(zhì)濃度較低時，熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度呈線性關(guān)系。 二、選擇激發(fā)波長和熒光波長 1、激發(fā)波長的選擇 激發(fā)光譜： 將光源發(fā)射的激發(fā)光用單色器單色后照射物質(zhì)，連續(xù)改變激發(fā)光波長，固定熒光發(fā)射波長，測定相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，所得熒光強(qiáng)度-激發(fā)波長圖譜，稱激發(fā)光譜。 一般選擇最大激發(fā)波長作為激發(fā)光波長。,2、熒光波長的選擇 熒光光譜：用最大激發(fā)波長的激發(fā)光照射熒光物質(zhì)時，依次測定所發(fā)射的各波長的熒光強(qiáng)度，所得熒光強(qiáng)度-熒光波長圖譜，稱為熒光光譜。 一般選擇熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的波長作為測定波長。 三、散射光干擾的排除 1、散射光 當(dāng)用一束光照射溶液時，大部分光被吸收和透過，還有小部分被溶劑分子碰撞而向四面八方散射，這種光稱散射光。 瑞利散射光 波長與激發(fā)光波長一樣 拉曼散射光 波長比激發(fā)光波長長,2、消除方法 （1）選擇適宜的激發(fā)光波長 用不同波長的激發(fā)光照射某一熒光物質(zhì)，所產(chǎn)生的熒光峰位波長相同 ，但產(chǎn)生的拉曼散射光峰位各不相同。所以，可通過選擇某一適宜的激發(fā)波長，使產(chǎn)生的拉曼散射光峰位遠(yuǎn)離熒光峰位而不干擾。 （2）選擇合適的溶劑 拉曼散射光主要來源于溶劑。不同溶劑產(chǎn)生的拉曼散射光波長不同，所以，通過