中藥指紋圖譜研究技術(shù)--周玉新（中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)）.ppt

1、中藥指紋圖譜 研究技術(shù),中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)中藥化學(xué)分會(huì)委員 周玉新,內(nèi) 容,一、中藥指紋圖譜技術(shù)概述 二、中藥指紋圖譜研究指導(dǎo)原則 三、指紋圖譜研究的相似度計(jì)算 四、中藥指紋圖譜的研究方法與思路 五、中藥指紋圖譜研究示例演示（實(shí)驗(yàn)）,一、中藥指紋圖譜技術(shù)概述,（一） 中藥指紋圖譜與中藥質(zhì)量 （二） 中藥指紋圖譜研究方法學(xué) （三） 中藥指紋圖譜技術(shù)的發(fā)展,指 紋 圖 譜,穩(wěn) 定 性,可 控 性,安 全 性,有 效 性,1. 中藥指紋圖譜與中藥安全、有效、穩(wěn)定的關(guān)系,（一） 中藥指紋圖譜與中藥質(zhì)量,2. 國(guó)內(nèi)中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)現(xiàn)狀,植物學(xué)方法： 原植物鑒定，顯微鑒定等 植物化學(xué)方法： 理化鑒定 分析化學(xué)方法

2、： 儀器分析，色譜分析等 藥理學(xué)方法： 生物鑒定法，生物等效等 分子生物學(xué)方法: DNA指紋鑒定,3. 國(guó)外植物藥質(zhì)量評(píng)價(jià)概況,標(biāo)準(zhǔn)制劑： 銀杏 人參 西洋參 五味子 甘草 黃芪 貫葉連翹 定量測(cè)定結(jié)合主成分比例 固定產(chǎn)地以生產(chǎn)質(zhì)量恒定制劑 多種分析手段和方法包括藥材、中間體等指紋圖譜,4. 中藥指紋圖譜的意義,是全面反應(yīng)中藥所含內(nèi)在化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而反映中藥的質(zhì)量，尤其在現(xiàn)階段中藥的有效成分絕大多數(shù)沒有明確，采用中藥指紋圖譜的方式，將有效地表征中藥質(zhì)量和穩(wěn)定性 有利于中藥及其產(chǎn)品進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng),5. 中藥指紋圖譜建立的原則,系統(tǒng)性： 指紋圖譜所反映的化學(xué)成分，應(yīng)包括中藥有效部位 所含大

3、部成分的種類，或指標(biāo)成分的全部 特征性： 指紋圖譜中反映的化學(xué)成分信息（具體 表現(xiàn)為保留 時(shí)間或位移值）是具有高度選擇性的，是這些信息 的綜合結(jié)果 穩(wěn)定性： 指紋圖譜在規(guī)定的方法與條件下應(yīng)能作出相對(duì)一致 的指紋圖譜 色譜特征的穩(wěn)定性： 特征峰 特征區(qū) 特征參數(shù) 色譜條件穩(wěn)定性： 不同儀器的驗(yàn)證 不同實(shí)驗(yàn)室的驗(yàn)證 不同操作者的驗(yàn)證, 品種鑒別-真?zhèn)?基源鑒別-產(chǎn)地 藥用部位的鑒別-根、莖、葉、花、 果 提取工藝 藥材炮制 限量成分的控制 一致性-不同批次的產(chǎn)品.,6. 指紋圖譜研究目的,品種多、產(chǎn)地多;采收、加工不一致 化學(xué)組分與含量不同 （產(chǎn)品品質(zhì)優(yōu)劣不同） 有效組分種類繁多、含量相對(duì)少；非有

4、效組分成 分復(fù)雜、含量高 分析檢測(cè)困難 （質(zhì)量控制指標(biāo)不統(tǒng)一） 基礎(chǔ)研究薄弱 藥材GAP建設(shè)滯后,7. 建立中藥指紋譜所面臨的問題,8. 對(duì) 策,加強(qiáng)GAP藥材種植基地建設(shè) 加強(qiáng)中藥種植與加工、炮制的規(guī)范化 加強(qiáng)中藥化學(xué)成分的基礎(chǔ)研究 應(yīng)用現(xiàn)代分析技術(shù)手段進(jìn)行中藥指紋圖譜研究,儀 器 設(shè) 備 技 術(shù) 人 員 研 究 經(jīng) 驗(yàn) 系統(tǒng)性問題 穩(wěn)定性問題 特征性問題,9. 中藥指紋譜研究過程中面臨的問題,色譜法 1. 液相色譜法（LC） 2. 氣相色譜法（GC） 3. 薄層掃描法（TLC） 4. 毛細(xì)管電泳法（CE） 其它 1. 質(zhì)譜法（MS）及色譜與質(zhì)譜聯(lián)用 2. X-衍射法 3. 近紅外法（NIR

5、）等,（二） 中藥指紋圖譜研究方法學(xué),（三） 中藥指紋圖譜技術(shù)的發(fā)展,應(yīng)用范圍 儀器設(shè)備與軟件 指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn),二、 中藥指紋圖譜研究指導(dǎo)原則,（一）目的和要求 （二）中藥指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)起草說明 （三）中藥指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的建立,中藥質(zhì)量研究和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)重要內(nèi)容 加強(qiáng)中藥質(zhì)量管理、提高中藥質(zhì)量、保證藥品安全、有效、穩(wěn)定、可控 固定原料藥（中藥材）品種、產(chǎn)地和采收季節(jié)的前提下，需制定原料藥(中藥材)和注射劑的指紋圖譜,（一）目的和要求,（二）中藥指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)起草說明,1. 名稱、漢語(yǔ)拼音,2. 來(lái)源（產(chǎn)地、采收期、炮制）,按中藥的命名原則制定,藥 材：產(chǎn)地、采收期、炮制 中間體：提取工藝或提取物的來(lái)

6、源,3. 供試品溶液的制備 有效成分(專屬性成分、指標(biāo)性成分)的理化性投 質(zhì)并結(jié)合檢測(cè)方法的要求 提取工藝 參照物溶液的制備 對(duì)照品 內(nèi)標(biāo)物 標(biāo)準(zhǔn)提取物,中藥指紋圖譜檢測(cè)方法的驗(yàn)證 （1）檢測(cè)方法 測(cè)定方法、 儀器 、 試劑 、 測(cè)定條件 （2） 驗(yàn)證 專屬性 （空白試驗(yàn)） 精密度試驗(yàn)（RSD3%） 重復(fù)性與重現(xiàn)性試驗(yàn)（S0.95） 穩(wěn)定性試驗(yàn)（S0.95） 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 6. 指紋圖譜的相關(guān)性,（三）中藥指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的建立,注意事項(xiàng) （1）所有成分應(yīng)在2小時(shí)左右洗脫，并提供2小時(shí)的指紋圖譜 （2）可建立各個(gè)組分的指紋圖譜 （3）可建立多種方法的指紋圖譜 （4）可選擇典型樣品的指紋圖譜，或標(biāo)

7、準(zhǔn)提取物的指紋圖譜， 或具有代表性的勾兌樣品的指紋圖譜作為標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜,2. 指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的建立 （1）藥材、中間體指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)為企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，列入 起草說明 （2）10批供試品 （3）標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定：供試品的指紋圖譜與對(duì)照提取物（標(biāo)準(zhǔn)提取物的指紋圖譜一致；或供試品的指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜（標(biāo)準(zhǔn)圖譜）一致；或通過對(duì)各特征峰的位置（相對(duì)保留時(shí)間、比移值等）、豐度（積分面積或峰高）及相對(duì)豐度、光譜特性（顏色）等綜合參數(shù)的描述予以確定。,指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)書寫格式,液相色譜法 【指紋圖譜】 照高效液色譜法（中國(guó)藥典一部附錄VI D），結(jié)合指紋圖譜的要求測(cè)定。 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 如以對(duì)照品做系統(tǒng)適用性試

8、驗(yàn)，則參照中國(guó)藥典書寫格式。如以隨行對(duì)照提取物做系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，則只書寫所用儀器、色譜柱型號(hào)及有關(guān)參數(shù)和各項(xiàng)具體試驗(yàn)條件。 對(duì)照品溶液的制備 如有對(duì)照品則照中國(guó)藥典書寫格式。 供試品溶液的制備 精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液（或?qū)φ沼锰崛∥锶芤海└?XX ml，分別流入液相色譜儀，測(cè)定。 本品指紋圖譜的主要特征 供試品指紋圖譜與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對(duì)照指紋圖譜（或隨行對(duì)照提取物指紋圖譜）經(jīng)計(jì)算軟件計(jì)算，相似度大于 XX，符合要求（或相似度小于 XX，不符合要求）。,三、指紋圖譜研究的相似度計(jì)算,（一）、指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)原則與方法 （二）、指紋圖譜相似度計(jì)算原理 （三）、指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件,（一

9、）、指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)原則與方法,原則： 整體性、模糊性、特征性 方法： 直接觀察、計(jì)算機(jī)輔助相似性計(jì)算,1. 引用參數(shù) 2. 數(shù)據(jù)獲取途徑 3. 相似度算法,（二）、指紋圖譜相似度計(jì)算原理,1. 引 用 參 數(shù), 保留時(shí)間(RT) 峰高(Height) 峰面積(Area) 峰面積百分比（Area%） 相對(duì)保留時(shí)間（Ratio of Retention Time, RRt） 積分相對(duì)比值（Ratio of Area, RA）,2. 數(shù) 據(jù) 獲 取 途 徑,（1）圖形/圖像轉(zhuǎn)化成ASCII數(shù)據(jù) （2）截片數(shù)據(jù) （3）色譜數(shù)據(jù),3. 相 似 度 算 法,夾角余弦算法,相關(guān)系數(shù)算法,優(yōu) 化 算 法,

10、1. 軟件開發(fā)原則 2. 市售/常用軟件簡(jiǎn)介 3. 相似度軟件使用過程中應(yīng)注意的問題,（三）、指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件,1. 軟 件 開 發(fā) 原 則,系統(tǒng)獨(dú)立性 (2) 計(jì)算方法的科學(xué)性 (3) 數(shù)據(jù)接口通用性 (4) 操作過程及應(yīng)用的實(shí)用性,2. 市售/常用軟件簡(jiǎn)介,浙江大學(xué) 陳一宇教授 中南大學(xué) 梁逸增教授 沈陽(yáng)藥科大學(xué) 畢開順教授 西北大學(xué) 李華教授 二軍大 Waters,3. 相似度軟件使用過程中應(yīng)注意的問題,數(shù)據(jù)接口與數(shù)據(jù)類型 數(shù)據(jù)的校正 算法的選擇,四、中藥指紋圖譜的研究方法與思路,（一）、研究方案設(shè)計(jì) （二）、樣品的選擇與收集 （三）、供試品的制備 （四）、指紋圖譜色譜條件研究的思

11、路 （五）、相似度值的研究與指紋特征,（一）、研究方案設(shè)計(jì),資料收集與整理 文獻(xiàn)、工藝資料、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 方案的設(shè)計(jì) （1）研究對(duì)象-有效成分 （2）研究方法的選擇-色譜法(HPLC GC TLC)及其它方法 （3）研究?jī)?nèi)容-根據(jù)技術(shù)要求的規(guī)定：包括“名稱、來(lái)源、制備、檢測(cè)方法、標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定及起草說明”,（二）、樣品的選擇與收集,要求： 10個(gè)批次 道地藥材與GAP基地藥材 典型性與代表性 離散樣品的剔除,（三）、供試品的制備,依據(jù)： 有效組分的物理化學(xué)性質(zhì) 生產(chǎn)或提取工藝 檢測(cè)方法的需要,（四）、指紋圖譜色譜條件研究的思路,高效液相色譜法 HPLC 氣相色譜法 GC,（1） 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 （簡(jiǎn)）

12、（2） 柱溫的選擇 （略） （3） 進(jìn)樣量 （簡(jiǎn)） （4） 色譜柱的選擇 （重點(diǎn)） （5） 檢測(cè)成分的選擇 （重點(diǎn)） （6） 流動(dòng)相（梯度表）的選擇 （重點(diǎn)）,1. 高 效 液 相 色 譜 法 HPLC,示例：蜂膠(Bee Propolis),（1） 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇,=280nm,=360nm,=254nm,=210nm,波長(zhǎng)選擇：=280nm,（4） 色譜柱的選擇,選用市場(chǎng)上較常見的填料所填充的色譜柱，例如：Eka-Nobel的Kromasi C18 (5mm)，其分離效果好、性能穩(wěn)定，無(wú)論是國(guó)產(chǎn)填充的Kromasi色譜柱，還是國(guó)外公司填充的Kromasi色譜柱，在分離效果上基本相同。因此對(duì)

13、于大多數(shù)中藥注射劑，可選用Kromasi色譜柱。 如選用乙腈-緩沖溶液，應(yīng)根據(jù)緩沖溶液的特點(diǎn)，選用相應(yīng)的色譜柱： 如為酸性緩沖溶液，可選用Zorbax SB-C18色譜柱（pH6）。 示例：不同的色譜柱對(duì)三七總皂苷的分離效果,Lichosorb,Polaris,Kromasil,Diamonsil,Carbosorb,（5） 檢測(cè)成分的選擇 （重點(diǎn)）,示例：何首烏,何首烏生品的液相色譜圖（全局圖）,何首烏生品的液相色譜圖（局部放大圖）,圖9 上海制首烏指紋圖譜,北京良方藥業(yè)制首烏,北京金象藥店制首烏,北京壽春堂藥店制首烏指紋圖譜,（6） 流動(dòng)相（梯度表）的選擇,主要影響因素 1. 起始濃度 2

14、. 梯度速率 3. 流速,* 為體積百分比（V/V）,指紋圖譜流動(dòng)相梯度優(yōu)化,* 為體積百分比（V/V）,梯 度 表,初始色譜條件,初始色譜條件的設(shè)定依據(jù)及目的,依據(jù)：化合物極性大小。如未知時(shí)，假設(shè)有效組分中包含各種極性的成分。 目的：快速確定主要或大部分化合物被洗脫時(shí)流動(dòng)相的組成，為優(yōu)化條件的選擇提供依據(jù)。,優(yōu)化條件的選擇,選擇依據(jù)：初始色譜圖、梯度洗脫表及一定的經(jīng)驗(yàn) 示 例：（1）淫羊藿總黃酮（40%）提取物 （2）鉤藤總生物堿 （3）黃連藥材 （4）知母總皂苷,淫羊藿提取物在初始條件下的色譜圖,淫羊藿提取物第一次優(yōu)化后的色譜圖,梯度速率： 初始：100/60min=1.7 /min 優(yōu)化

15、：01.7,CH3CN%,CH3CN%,Min,Min,初始條件,CH3CN%,Min,三七 人參 西洋參,CH3CN%,Min,起始濃度： 根據(jù)初始色譜圖中主要色譜峰被 洗脫時(shí)的流動(dòng)相組成，相應(yīng)減少 20%。 流 速： 0.52.0 ml/min,2. 氣 相 色 譜 法,（1）影響色譜峰分離程度的因素 色譜柱的類型 載氣流速 起始柱溫 升溫速率,（2）研究示例 樣品：廣藿香油指紋圖譜研究過程,方案設(shè)計(jì),檢測(cè)方法 （1）色譜方法 廣藿香油為廣藿香藥材經(jīng)水蒸汽蒸餾而得到的揮發(fā)油，均為易揮發(fā)組分，擬采用氣相色譜法（GC）。 （2）儀器： Agilent 6890 GC （3）色譜柱的選擇 可供選

16、擇的色譜柱：極性非極性中等極性 （4）進(jìn)樣方式的確定 手動(dòng) 自動(dòng) 頂空,2. 供試品溶液的制備 取廣藿香油適量，加醋酸乙酯溶解，即得。,注：對(duì)于非極性毛細(xì)管色譜柱，如供試品溶液中含少量的少，最好干燥后進(jìn)樣。,2. 色譜條件的摸索 （1）對(duì)梯度速率及流速進(jìn)行微調(diào)-由粗到精,初始條件 流 速：3.0 ml/min 進(jìn)樣口溫度：250 檢測(cè)口溫度：280 初 始 柱 溫：50 升溫 速 率：30/min,第一次優(yōu)化 流 速：2.0 ml/min 進(jìn)樣口溫度：250 檢測(cè)口溫度：280 初 始 柱 溫：50 升溫 速 率：20/min,第二次優(yōu)化 流 速：1.0 ml/min 進(jìn)樣口溫度：250 檢測(cè)

17、口溫度：280 初 始 柱 溫：50 升溫 速 率：10/min,第三次優(yōu)化 流 速：1.0 ml/min 進(jìn)樣口溫度：250 檢測(cè)口溫度：280 初 始 柱 溫：50 升溫 速 率：5/min,第四次優(yōu)化 流 速：0.5 ml/min 進(jìn)樣口溫度：250 檢測(cè)口溫度：280 初 始 柱 溫：50 升溫 速 率：5/min,（2）選擇細(xì)化的初始條件-由細(xì)到精,初始條件 流 速：1.0 ml/min 進(jìn)樣口溫度：250 檢測(cè)口溫度：280 初 始 柱 溫：50 升溫 速 率：1.0/min,第一次優(yōu)化 流 速：1.0 ml/min 進(jìn)樣口溫度：250 檢測(cè)口溫度：280 初 始 柱 溫：150

18、升溫 速 率：1/min,（3）根據(jù)初始條件（由粗到精）下的色譜圖，計(jì)算 大多數(shù)色譜峰出峰時(shí)的柱溫范圍，確定第一次 優(yōu)化時(shí)柱溫的梯度變化范圍。,初始條件,結(jié)果： RT=7min后，基本沒有色譜峰；RT=8min后，基線平直。 主要色譜峰被洗脫時(shí)的RT：4min7min 主要色譜峰被洗脫時(shí)的柱溫范圍：170250,第一次優(yōu)化 流 速：1.0 ml/min 進(jìn)樣口溫度：250 檢測(cè)口溫度：280 初 始 柱 溫：100 升溫 速 率：5/min,第二次優(yōu)化 流 速：0.5 ml/min 進(jìn)樣口溫度：250 檢測(cè)口溫度：280 初 始 柱 溫：100 升溫 速 率：5/min,結(jié) 論 對(duì)本供試品中的組分的分離，升溫速率是主要影