培養(yǎng)基的制備與滅菌.ppt

第二章 培養(yǎng)基的制備與滅菌,1、培養(yǎng)基的組成？如何選擇培養(yǎng)基？ 2、如何對(duì)制備培養(yǎng)基？ 3、如何對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌？,第一節(jié) 培養(yǎng)基的原材料,一、培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分及用途 光 光能自養(yǎng) 自養(yǎng)菌 氫、硫、氨 化能自養(yǎng) 1.能源 亞硝酸鹽、亞鐵鹽 碳水化合物等有機(jī)物 石油天然氣和石油化工產(chǎn)品（如醋酸） 異養(yǎng)菌 功能：生長、繁殖需要；,碳酸氣 2.碳源 淀粉水解糖、糖蜜、亞硫酸鹽紙漿廢液等 石油、正構(gòu)石蠟、天然氣 醋酸、甲醇、乙醇等石油化工產(chǎn)品 功能：提供能量、構(gòu)成菌體、代謝產(chǎn)物的物質(zhì)基礎(chǔ)；,有機(jī)氮：黃豆餅粉、花生餅粉、玉米漿、蛋白胨、 3.氮源 酵母粉、魚粉、發(fā)酵菌絲體、酒糟水等 無機(jī)氮： 尿素、硫酸銨、氨水、硝酸鹽 功能：構(gòu)成菌體、含氮代謝物；,磷酸鹽、鉀鹽、鈣鹽等礦物鹽 4.無機(jī)鹽 鐵、錳、鈷等微量元素 功能：構(gòu)成菌體，參與酶的組成，維持酶活性，調(diào)節(jié)滲透壓，調(diào)節(jié)pH值，維持氧化還原電位；,5.特殊生長因子：硫胺素、生物素、對(duì)氨基苯甲酸、肌醇等 功能：酶的輔助部分，維持生命活動(dòng)；,6發(fā)酵的促進(jìn)劑與抑制劑 發(fā)酵培養(yǎng)基中某些成分的加入有利于調(diào)節(jié)產(chǎn)物的形成，而并不促進(jìn)微生物的生長，這些物質(zhì)包括前體、促進(jìn)劑和抑制劑,1）、前體：指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程中結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而其自身的結(jié)構(gòu)沒有多大的變化，但產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入前體而有較大的提高。 如：在青霉素生產(chǎn)中加入玉米漿，青霉素產(chǎn)量可從20u/mL增加到100u/mL，研究發(fā)現(xiàn)玉米漿中的苯乙胺被有限結(jié)合到青霉素分子中，從而提高了青霉素G的產(chǎn)量。,2）、促進(jìn)劑：指那些既不是營養(yǎng)物又不是前體，但卻能提高產(chǎn)量的添加劑。 比如在酶制劑發(fā)酵過程中，加入誘導(dǎo)物、表明活性劑及其它一些產(chǎn)酶促進(jìn)劑（比如吐溫80、植酸、洗衣粉等）,3）、抑制劑：在發(fā)酵過程中加入抑制劑會(huì)抑制某些代謝途徑的進(jìn)行，同時(shí)會(huì)使另外一些代謝途徑活躍，從而獲得人們所需要的某種產(chǎn)物或使正常代謝的某一代謝中間物積累起來。 例如：微生物發(fā)酵生產(chǎn)甘油中，例如亞硫酸氫鈉，它與代謝過程中的乙醛生成加成物。,7.水分 功能：生化反應(yīng)均在水溶液中進(jìn)行,二、培養(yǎng)基的類型,1.依營養(yǎng)物質(zhì)的來源分類 天然培養(yǎng)基； 合成培養(yǎng)基，也稱組合培養(yǎng)基（多用于定量研究）； 半合成培養(yǎng)基，（用的最多，在部分天然有機(jī)碳源、氮源、生長因子的基礎(chǔ)上，適當(dāng)加入一些化學(xué)藥品）；,2.依培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來分： 1）固體培養(yǎng)基 A、凝固培養(yǎng)基 ：即遇熱可融化，冷卻后則凝固的固體培養(yǎng)基 B、非可逆性凝固培養(yǎng)基：指有血清凝固成的固體培養(yǎng)基或由無機(jī)硅膠配成的凝固后即不能再融化的固體培養(yǎng)基 C、天然固體培養(yǎng)基：由天然固體狀基質(zhì)直接制成的培養(yǎng)基，如麩皮，米糠，木屑等 D、濾膜：是一種堅(jiān)韌且?guī)в袩o數(shù)微孔的醋酸纖維薄膜，把它制成圓片狀覆蓋再營養(yǎng)瓊脂或浸有培養(yǎng)液的纖維襯墊上，就形成了具有固體培養(yǎng)基性質(zhì)的培養(yǎng)條件。,2）半固體培養(yǎng)基 再配置號(hào)的液體培養(yǎng)基中加入0.5%左右的瓊脂作為凝固劑，形成的培養(yǎng)基稱之微半固體培養(yǎng)基。 主要用于菌種鑒定，觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng)特征及噬菌體的效價(jià)測(cè)定等,3）液體培養(yǎng)基； 培養(yǎng)基中8090%是水。,3.依培養(yǎng)基的用途來分 1）、孢子培養(yǎng)基 2）、種子培養(yǎng)基 3) 、 發(fā)酵培養(yǎng)基 4）、補(bǔ)料培養(yǎng)基 5）、加富培養(yǎng)基 6）、選擇培養(yǎng)基 7）、鑒別培養(yǎng)基 8）、增殖和保存培養(yǎng)基 9）、富集培養(yǎng)基 10）、測(cè)定培養(yǎng)基,三、發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇,一）、配置培養(yǎng)基的原則 1、根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配置不同的培養(yǎng)基 2、注意各營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和配比 3、調(diào)節(jié)適宜的物理化學(xué)條件 4、根據(jù)培養(yǎng)微生物的目的配置 5、盡量使用廉價(jià)易得的原料,1、生態(tài)模擬 2、查閱文獻(xiàn) 3、借助優(yōu)選法或正交試驗(yàn)法精心設(shè)計(jì)培養(yǎng)基配方 4、實(shí)驗(yàn)比較 實(shí)驗(yàn)的規(guī)模一般由定性到定量，由小到大。 發(fā)酵培養(yǎng)基的用途與要求、成分、配比經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定，配制時(shí)兼顧原料來源、成本及工藝管理；,二）、配置培養(yǎng)基的方法,培養(yǎng)基配方舉例,牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(常用的細(xì)菌培養(yǎng)基) 牛肉膏5克 蛋白胨10克 NaCl5克 水1000毫升 pH7.27.4 (瓊脂1520克) 高氏一號(hào)培養(yǎng)基(常用的放線菌培養(yǎng)基) 可溶性淀粉20克 KNO31克 K2HPO40.5克 MgSO40.5克 NaCl 0.5克 FeSO40.01克水1000毫升瓊脂1520克pH7.47.6,察氏培養(yǎng)基(培養(yǎng)霉菌用) 蔗糖 20克 NaNO33克 K2HPO41克 KCl1克 MgSO40.5克 FeSO40.01克 瓊脂20克 水1000毫升自然pH 無氮培養(yǎng)基(培養(yǎng)自生固氮菌用) 葡萄糖 10克 NaCl0.2克 KH2PO40.2克 CaSO42H2O0.1克 MgSO40.2克 CaCO35克 瓊脂 20克水1000毫升自然pH 伊紅-美藍(lán)培養(yǎng)基(檢查腸道細(xì)菌用) 蛋白胨 10克 K2HPO42克乳糖10克瓊脂25克，水1000毫升，pH7.6 2伊紅水溶液2毫升0.5美藍(lán)水溶液2毫升將乳糖、伊紅、美藍(lán)分別滅菌后，加入滅菌的培養(yǎng)基中搖勻，倒平板。,四、原料轉(zhuǎn)換及意義 1、節(jié)約原料，減低單耗，提高發(fā)酵單位和總收率； 2、開拓新的原料資源和微生物資源：野生植物淀粉、植物纖維、木屑水解物、石蠟、醋酸、乙醇,第二節(jié) 淀粉水解糖的制備,一、淀粉水解糖的制備方法 1、酸解法： 定義：以酸（無機(jī)酸或有機(jī)酸）為催化劑，在高溫高壓下將淀粉水解為葡萄糖的方法. 優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備要求簡(jiǎn)單，水解時(shí)間短（20min），設(shè)備生產(chǎn)能力大 缺點(diǎn)：高溫高壓下進(jìn)行，設(shè)備要求耐腐蝕、耐高溫、耐高壓，副反應(yīng)多，對(duì)原料要求嚴(yán)格，淀粉顆粒不宜過大，淀粉乳濃度不能過高。,2、酶解法：（雙酶水解法） 定義：用淀粉酶將淀粉水解為葡萄糖的過程。一般分為兩步：第一步是利用淀粉酶將淀粉液化轉(zhuǎn)為糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，這個(gè)過程稱為液化。第二步是利用糖化酶將糊精或低聚糖進(jìn)一步水解，轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟堑倪^程，稱為糖化。也稱雙酶法,-淀粉酶（液化） 葡萄糖淀粉酶（糖化） 優(yōu)點(diǎn)：1、反應(yīng)條件溫和。 2、酶的專一性強(qiáng)，副反應(yīng)少 3、可在較高的淀粉乳濃度下水解 4、糖液的營養(yǎng)物質(zhì)豐富 5、糖液色澤淺，無苦味，有利于糖液的精制 缺點(diǎn)：時(shí)間長（23）天，要求的設(shè)備多，糖液過濾困難。,3、酸酶結(jié)合法 酸酶法 酶酸法,二、淀粉酸水解理論基礎(chǔ),淀粉水解成葡萄糖的反應(yīng)過程中同時(shí)發(fā)生這：水解反應(yīng)、復(fù)合反應(yīng)、分解反應(yīng)；其中水解反應(yīng)是主要的。 復(fù)合反應(yīng)：葡萄糖分子間經(jīng)1-6糖苷鍵結(jié)合成龍膽二糖（有苦味）、異麥芽糖和其他低聚糖（合稱復(fù)合低聚糖）。 分解反應(yīng)：葡萄糖 羥甲基糠醛 有機(jī)酸、色素等,淀粉的水解反應(yīng) 1.淀粉水解過程 顏色變化：藍(lán)色 暗紫 紫 紅褐 暗紅 紅 淺紅,2、淀粉酸水解反應(yīng)動(dòng)力學(xué),屬于單分子一級(jí)反應(yīng)類型： K：反應(yīng)速度常數(shù)，由反應(yīng)條件（如溫度、酸度等）而定 C：淀粉濃度,3、影響酸水解的因素 酸的種類 主要因素 濃度（酸的濃度、淀粉的濃度） 水解溫度,（二）、葡萄糖的復(fù)合反應(yīng)及其影響因素 復(fù)合反應(yīng)：在淀粉的酸糖化過程中，水解生成的葡萄糖受酸和熱的影響，葡萄糖分子之間通過糖苷鍵相聚合，生成二糖、三糖及其他低聚糖。,影響復(fù)合反應(yīng)的因素： 1、淀粉濃度的影響（用DE值表示葡萄糖純度）： DE值還原糖/干物質(zhì)100 2.、酸的影響：,（三）葡萄糖的分解反應(yīng)及其影響因素,葡萄糖 5-羥甲基糠醛 乙酰丙酸、蟻酸、有色素物質(zhì)； 影響因素：濃度、溫度、pH值；,第三節(jié) 糖蜜前處理,一、糖蜜的來源與特點(diǎn) 二、糖蜜前處理的方法 1、加酸通風(fēng)沉淀法（冷酸通風(fēng)處理法）：糖蜜加水稀釋到500Bx 加入0.20.3濃硫酸，通入壓縮空氣1h 靜置澄清8h，取上清液。,2、加熱加酸沉淀法（熱酸通風(fēng)沉淀法）： 糖蜜加水稀釋到40 加適量硫酸調(diào)節(jié)pH值到44.5 放入澄清槽加熱至8090，通風(fēng)30min 保溫 7080 812 小時(shí)，取上清液。,3、添加絮凝劑澄清處理法： 糖蜜稀釋至3040 Bx 加硫酸調(diào)pH 33.8 加熱至90 添加8ppm聚丙烯酰胺（PAM），攪拌均勻 靜置1小時(shí)，取上清液。,三、谷氨酸發(fā)酵糖蜜前處理,1.糖蜜預(yù)處理法 活性炭處理法 樹脂處理法 亞硝酸處理法 2.添加化學(xué)藥劑處理法 添加青霉素法 添加表面活性劑 添加抗氧劑法 3.追加糖蜜法 4. 營養(yǎng)缺陷型變異株法,第四節(jié) 其他原料的處理,一、纖維素及發(fā)酵廢液的處理 （一）、利用纖維素廢料生產(chǎn)SCP 稻草、麥稈、玉米的莖和葉、甘蔗渣、廢紙等 流程如下：,纖維原料,粉碎,水解,中和,澄清,過濾,發(fā)酵罐培養(yǎng),分離,廢液,種子,營養(yǎng)鹽,菌體,濃縮,磨碎,干燥,成品,（二）利用檸檬酸中和濾液生產(chǎn)酵母,酵母菌種,斜面,一級(jí)種子,二級(jí)種子,離心分離,中和廢液,鹽酸調(diào)pH3.5,發(fā)酵,干燥,粉碎,包裝,二次廢液,用于發(fā)酵培養(yǎng)基 的配置等,二、亞硫酸鹽廢液的處理 （一）亞硫酸鹽制漿廢液生產(chǎn)酒精和蛋白質(zhì) 1、亞硫酸鹽紙漿廢液生產(chǎn)酒精 2、亞硫酸鹽紙漿廢液發(fā)酵生產(chǎn)蛋白質(zhì) 3、亞硫酸銨法非木材制漿廢液培養(yǎng)SCP （二）亞硫酸鹽廢液發(fā)酵生產(chǎn)乳酸 三、木屑水解液發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸,第五節(jié) 培養(yǎng)基滅菌,一、消毒與滅菌在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用 消毒：指用物理和化學(xué)方法殺死物料、容器、器具內(nèi)外的病源微生物。一般只能殺死營養(yǎng)細(xì)胞而不能殺死細(xì)菌芽孢。 滅菌：用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物，包括營養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽孢和孢子。 消滅雜菌和防止雜菌污染,二、滅菌方法：干熱滅菌、濕熱滅菌、物理滅菌（射線、微波等）、化學(xué)滅菌（各種化學(xué)藥品）； 1、干熱滅菌法 灼燒滅菌、在電熱或紅外線在設(shè)備內(nèi)加熱 主要用于保持干燥的物料、器具等,2、濕熱滅菌法 借助蒸汽釋放的熱使微生物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、酶和核酸分子內(nèi)部的化學(xué)鍵，特別是氫鍵受到破壞，引起不可逆的變性，使微生物死亡。 優(yōu)點(diǎn)：1）蒸汽來源容易，操作費(fèi)用低廉，本身無毒 2)蒸汽具有很強(qiáng)的穿透力，滅菌易于徹底 3）蒸汽均有很大的潛熱，冷凝后的水分有利于濕熱滅菌 4）蒸汽輸送可借助本身的壓強(qiáng)，調(diào)節(jié)方便，技術(shù)管理容易 缺點(diǎn)：1)設(shè)備費(fèi)用高 2）不能用于怕受潮的物料滅菌,3、射線滅菌 紫外線、高速電子流的陰極射線、X射線和Y射線 化學(xué)藥品滅菌法 （1）第一大類：表面消毒劑 高錳酸鉀溶液：0.10.25%、漂白粉 、75的酒精、新潔爾滅和杜滅芬、甲醛 37、戊二醛、過氧乙酸、焦碳酸二乙酯、酚類,（2）第二大類：抗代謝藥物 化學(xué)結(jié)構(gòu)與微生物必須的代謝物類似 例如：磺胺類化合物取代氨基苯甲酸 （3）第三大類：抗生素,三、加熱滅菌的原理,1.、微生物的熱阻：微生物對(duì)熱的抵抗力； 致死溫度、致死時(shí)間 2、微生物的熱致死動(dòng)力學(xué)：對(duì)數(shù)殘留定律,一級(jí)反應(yīng)： 用N表示殘留活菌個(gè)數(shù)，則活菌的減少率（死亡率），與N呈線性關(guān)系，即： 式中，K是反應(yīng)速度常數(shù)，對(duì)滅菌來講，是活菌的比熱致死速率常數(shù)，單位是min-1 ，其值與菌的種類和加熱溫度有關(guān)，需通過實(shí)驗(yàn)才能測(cè)定。,積分邊界條件：N0N；t0=0,式中， 滅菌時(shí)間（s）； N0 滅菌開始時(shí)，培養(yǎng)基中雜菌個(gè)數(shù)（個(gè)）； N 經(jīng)過滅菌時(shí)間后，殘存的活菌數(shù)（個(gè)）。,3、熱致死反應(yīng)的速度常數(shù)K K是表達(dá)微生物耐熱性的特征常數(shù) ，與微生物的種類和滅菌溫度有關(guān)。K越小，微生物越耐熱,4、滅菌溫度的選擇 式中 E為菌體死滅反應(yīng)的活化能（J/mol），它是菌體死滅反應(yīng)的特征常數(shù)，所以，不同菌其熱死滅反應(yīng)的E不同。,四、影響培養(yǎng)基滅菌的其他因素,培養(yǎng)基成分、pH值、培養(yǎng)基中的顆粒、泡沫,五、分批滅菌與連續(xù)滅菌,一）、分批滅菌的操作過程（實(shí)罐滅菌） 1）培養(yǎng)基的預(yù)熱 培養(yǎng)基先加熱到8090，然后再導(dǎo)入蒸汽升溫到120180。 目的：1）防止直接導(dǎo)入蒸汽時(shí)由于培養(yǎng)基與蒸汽的溫度過大而產(chǎn)生大量的冷凝水使培養(yǎng)基稀釋 2）防止直接導(dǎo)入蒸汽所造成的泡沫急劇上升而引起的物料外溢。 方法：先將排氣閥打開,2）培養(yǎng)基滅菌 從各路通入蒸汽（進(jìn)氣口、排料口、取樣口），溫度升到120130，保溫30min,2、分批滅菌的注意事項(xiàng) 1）各路蒸汽進(jìn)口要暢通，防止短路逆流；罐內(nèi)液體翻動(dòng)要?jiǎng)×?，以使罐?nèi)物料達(dá)到均一的滅菌溫度。 2）排氣量不宜過大，以節(jié)約蒸汽 3）滅菌將要結(jié)束時(shí)，應(yīng)立即引入無菌空氣以保持罐壓，然后開夾套或蛇管冷卻，以避免罐壓迅速下降產(chǎn)生負(fù)壓而吸入外界空氣，或引起發(fā)酵罐破壞。 4）在引入無菌空氣前，罐內(nèi)壓力必須