蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)及其在鼻咽癌臨床分型研究中的應(yīng)用.doc

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)及其在鼻咽癌臨床分型研究中的應(yīng)用陳艷，田道法（湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410007）摘要：蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用日益廣泛，并在向臨床實(shí)際應(yīng)用發(fā)展，包括臨床標(biāo)本的檢測(cè)性研究及相關(guān)疾病的診斷與分型等。本文對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)及其在鼻咽癌臨床分型研究中的應(yīng)用情況進(jìn)行綜述，以介紹并推進(jìn)該類技術(shù)在腫瘤臨床上的應(yīng)用。鼻咽癌是來源于鼻咽上皮組織的惡性腫瘤，其死亡率約占全部惡性腫瘤死亡率的2.81，居第八位；在頭頸部惡性腫瘤中，鼻咽癌的發(fā)病率則居首位。早期轉(zhuǎn)移是鼻咽癌的顯著臨床特征之一，是由鼻咽癌細(xì)胞的特殊生物學(xué)特性所決定的，是造成患者病情惡化的主要原因。盡管人們一直在探索鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制，但鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制還不十分清楚。大量的研究結(jié)果表明2-3，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因參與、多階段發(fā)展的病理過程,涉及大量不同種類和性質(zhì)蛋白質(zhì)的功能活性。腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中,細(xì)胞惡變前后的蛋白質(zhì)組表達(dá)情況發(fā)生了非常復(fù)雜的變化，普通生化分析技術(shù)很難把握其全貌。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)分析比較腫瘤發(fā)生過程中的蛋白質(zhì)組變化,就可以比較全面地分析某一時(shí)間斷面相關(guān)蛋白質(zhì)總體變化趨勢(shì)，有利于發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)特異性蛋白質(zhì),不僅為腫瘤診斷提供分子標(biāo)志,也可能為腫瘤的治療和藥物開發(fā)提供可靠靶標(biāo)。蛋白質(zhì)組是指某一物種、個(gè)體、器官、組織或者細(xì)胞基因組的全部蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達(dá)譜，或稱一種細(xì)胞內(nèi)存在的全部蛋白質(zhì)。澳大利亞的兩位學(xué)者Wilkins和Williams在1994年首先提出了蛋白質(zhì)組(proteome)的概念，即基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)，是細(xì)胞、組織或機(jī)體在特定時(shí)間和空間上表達(dá)的所有蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是研究細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的組成及其規(guī)律的科學(xué)。蛋白質(zhì)組學(xué)研究已廣泛應(yīng)用于腫瘤生物學(xué)標(biāo)記物的篩選和鑒定、腫瘤分類、治療及腫瘤發(fā)生機(jī)制等領(lǐng)域。利用功能蛋白質(zhì)資料，可以解釋腫瘤的癌變機(jī)理，且對(duì)篩查可疑病例、早期診斷、病情監(jiān)測(cè)、預(yù)后評(píng)估具有很大的臨床意義。比較正常細(xì)胞與疾病細(xì)胞之間的差異表達(dá)蛋白質(zhì)譜，尋找與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，有助于深人探討疾病的發(fā)生機(jī)制；通過質(zhì)譜分析等技術(shù)確認(rèn)差異蛋白質(zhì)，可以為疾病提供早期診斷標(biāo)志物。一蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)的核心在于大規(guī)模地對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行綜合分析,通過對(duì)某一物種、個(gè)體、器官、組織或細(xì)胞的全部蛋白質(zhì)生物學(xué)特性(包括表達(dá)水平、結(jié)構(gòu)、翻譯后修飾、細(xì)胞內(nèi)定位、蛋白質(zhì)相互作用)的研究,可以對(duì)蛋白質(zhì)所執(zhí)行的生理性、病理性活動(dòng)作出精細(xì)、準(zhǔn)確、本質(zhì)性的闡述4。蛋白質(zhì)組學(xué)最有價(jià)值的優(yōu)勢(shì)，是它可以在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中觀察一個(gè)完整的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞型在特定的時(shí)間下,其生理或病理狀態(tài)中所發(fā)生的相應(yīng)的變化5。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容包括:針對(duì)已知基因及轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)庫的生物體、組織及細(xì)胞,建立相應(yīng)蛋白質(zhì)組或亞蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(蛋白質(zhì)表達(dá)譜)及其蛋白質(zhì)組連鎖群；識(shí)別執(zhí)行關(guān)鍵生命功能的多種蛋白質(zhì)復(fù)合物并分析控制這些多蛋白質(zhì)復(fù)合物的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的特征；以重要的生命過程或人類一些重大疾病為對(duì)象,進(jìn)行重要的生理和病理體系或過程的研究,即比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究；蛋白質(zhì)組學(xué)支撐技術(shù)平臺(tái)和生物信息學(xué)的研究。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一般過程，首先是獲取細(xì)胞或組織樣品，然后進(jìn)行樣品制備；通過二維凝膠電泳(2DPAGE)對(duì)樣品蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模的群體分離，借助計(jì)算機(jī)輔助分析軟件，確認(rèn)2DPAGE圖譜上的差異表達(dá)蛋白質(zhì)；繼而利用準(zhǔn)確的切取技術(shù)，獲得2DE膠上感興趣的差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，再對(duì)此凝膠塊進(jìn)行酶解消化，分離純化蛋白質(zhì)，在質(zhì)譜儀上進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得肽指紋圖及其相關(guān)數(shù)據(jù)；然后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，對(duì)蛋白質(zhì)種類及相關(guān)理化特性和功能活性進(jìn)行鑒定；最后分析蛋白質(zhì)在細(xì)胞與組織中的表達(dá)及其生物學(xué)意義。常用樣品來源有：體外培養(yǎng)細(xì)胞、活體組織標(biāo)本、血清和體液等等。樣品制備與蛋白質(zhì)分離：雙向凝膠電泳2-DE于1975年由Ofarrll等6創(chuàng)立，主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)的大規(guī)模分離。2D-PAGE主要過程包括樣品制備、水化與等電聚焦、膠條的平衡及SDS-PAGE等步驟。其基本原理，是先從組織和細(xì)胞中獲得蛋白質(zhì)，通過pH梯度(immobilizedpHgradient)凝膠電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)電荷差異分離出不同pI值的蛋白質(zhì)條帶，再將此膠條經(jīng)過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，按蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大小而加以分離。固相pH梯度凝膠電泳技術(shù)的發(fā)展，使得2-DE的穩(wěn)定性和可重復(fù)性得到明顯改善7。SDS-PAGE運(yùn)行結(jié)束后，蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過雙向電泳而得以分離，然后就要凝膠進(jìn)行染色，再于凝膠圖象分析儀上進(jìn)行蛋白質(zhì)分離結(jié)果的分析。常用染色方法有考馬斯亮藍(lán)染色、銀染色。染色完畢后，利用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)2-DE凝膠圖像進(jìn)行分析，如PD-QUEST軟件、LIPS、HERMES、GEMINI等，并對(duì)凝膠圖像上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行匹配，經(jīng)過對(duì)圖像進(jìn)行的數(shù)字化處理等程序，最后獲得差異表達(dá)蛋白質(zhì)的相關(guān)數(shù)據(jù)，然后就可以對(duì)感興趣的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析。生物質(zhì)譜分析：對(duì)于雙向電泳中感興趣的差異表達(dá)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，可以將其從聚丙烯酰胺凝膠中切下，經(jīng)過酶解純化后，采用生物質(zhì)譜進(jìn)行分析鑒定而獲得肽指紋圖。其基本原理，是在樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子之間的荷質(zhì)比（M/E）的差異來分離并確定其分子量。對(duì)于經(jīng)過雙向凝膠電泳分離的目標(biāo)蛋白質(zhì)，先采用胰蛋白酶酶解（水解Lys或Arg的C端形成肽?。┏呻亩?，再應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)分別對(duì)這些肽段進(jìn)行鑒定與分析。目前常用的質(zhì)譜分析技術(shù)包括兩種，即基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALD1-TOF-MS）和離子阱質(zhì)譜（ESI-MS）。其基本原理，是將大分子待測(cè)樣品與基質(zhì)混合，通過基質(zhì)分子吸收激光能量，轉(zhuǎn)化為系統(tǒng)的激發(fā)能，導(dǎo)致大分子樣品的電離和氣化，生成的離子在真空無場(chǎng)區(qū)飛行并到達(dá)檢測(cè)器，不同荷質(zhì)比的離子到達(dá)檢測(cè)器的時(shí)間不同從而得到該蛋白質(zhì)的肽質(zhì)指紋PMF8。實(shí)驗(yàn)所得肽譜數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，再采用一定的方法對(duì)匹配結(jié)果進(jìn)行打分和排序，最后根據(jù)分值高低，利用系列相應(yīng)軟件在序列信息庫查找并鑒定蛋白質(zhì)，以確定其種類及相關(guān)數(shù)據(jù)9,10。二蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用在后基因組學(xué)時(shí)代,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn),即如何在分子水平剖析腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的相關(guān)事件。與基因組學(xué)不同,蛋白質(zhì)組學(xué)的目的是研究蛋白質(zhì)的表達(dá)和蛋白質(zhì)的功能,以使研究者更好地探索腫瘤的生物學(xué)本質(zhì)及相關(guān)分子機(jī)制11。目前的研究表明,有大量的蛋白質(zhì)分子參與了腫瘤細(xì)胞周期、凋亡及轉(zhuǎn)移的調(diào)控12。實(shí)踐證明,蛋白質(zhì)組學(xué)研究將為腫瘤的早期診斷、腫瘤標(biāo)志物的篩選與鑒定、抗腫瘤藥物的篩選及開發(fā)探索新的治療靶標(biāo),提供新的平臺(tái)13。近年來蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤標(biāo)志物的篩選和鑒定中應(yīng)用最為廣泛。蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤的診斷與治療方面具有廣泛的臨床應(yīng)用前景，它主要通過運(yùn)用蛋白質(zhì)分離分析技術(shù)比較正常組織和腫瘤組織的差異，從中發(fā)現(xiàn)腫瘤的早期標(biāo)志蛋白分子，并建立相應(yīng)的疾病診斷模型14。蛋白質(zhì)組學(xué)研究已在多種腫瘤中展開，已經(jīng)涵蓋了包括乳腺癌15、肺癌16、膀胱癌17、肝癌18、卵巢癌19、等的大多數(shù)腫瘤，獲得了大量有用的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，并建立了一些相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫。三蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在不同類型鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)行為特性研究中的應(yīng)用鼻咽腔位于鼻腔后方第1和2頸椎的前方蝶骨底或枕骨基底部的下方，呈不規(guī)則的立方體，垂直徑約5.56.0cm，橫徑約3.03.5cm，前后徑為2.03.0cm。鼻咽與其周圍組織的關(guān)系密切而又復(fù)雜。鼻咽上鄰顱底，下接口咽，側(cè)聯(lián)中耳，前通鼻腔，后貼頸椎，可謂四通八達(dá)。因此，鼻咽癌引起的癥狀比較多樣化1。鼻咽癌的局部生長(zhǎng)方式是以浸潤(rùn)性蔓延為主，但在不同個(gè)體，其發(fā)展有一定的傾向性。在臨床上，腫瘤局限于鼻咽部即為鼻咽型；病變向上發(fā)展，出現(xiàn)對(duì)顱神經(jīng)損害和/或顱底骨質(zhì)破壞，但不伴有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，此為上行型，亦稱顱神經(jīng)侵犯型；往下發(fā)展，可以表現(xiàn)單側(cè)或雙側(cè)頸部單個(gè)或多個(gè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性腫大，不伴有前組顱神經(jīng)受累或顱底骨質(zhì)破壞，但可以出現(xiàn)、-顱神經(jīng)受損癥狀，此為下行型，亦稱頸部腫塊型或頸淋巴結(jié)廣泛轉(zhuǎn)移型；既表現(xiàn)有前組顱神經(jīng)受累和/或顱底骨質(zhì)破壞，又出現(xiàn)單側(cè)或雙側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，兼有上行、下行兩型情況者,為上下行型，也稱混合型。大量的研究資料表明，鼻咽癌的發(fā)病具有一定的遺傳傾向，是一種多基因遺傳相關(guān)性疾病。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，直接從蛋白質(zhì)表達(dá)譜角度入手來研究鼻咽癌的相關(guān)問題，并與鼻咽癌細(xì)胞基因組的相應(yīng)變化情況相印證，將更全面、真實(shí)地揭示鼻咽癌變的過程和本質(zhì)。Guo等20應(yīng)用SELDI-TOF-MS及人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)分析了上行型及下行型鼻咽癌58例患者的血清蛋白質(zhì)，得到11個(gè)潛在的生物標(biāo)記物，對(duì)不同類型腫瘤的區(qū)分率達(dá)到90%。此外，Cho等21通過對(duì)鼻咽癌復(fù)發(fā)患者、肺癌患者、單純性甲狀腺腫大患者及正常人的血清進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析，識(shí)別出兩種分子量分別為11.6kDa和11.8kDa的同型血清淀粉樣A蛋白，它們與鼻咽癌的復(fù)發(fā)傾向呈正相關(guān)，可以作為一種有效監(jiān)測(cè)鼻咽癌復(fù)發(fā)趨勢(shì)的腫瘤標(biāo)志物。王暉22等觀察不同類型鼻咽癌細(xì)胞系中蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，認(rèn)為放射生物學(xué)特性不同的鼻咽癌細(xì)胞系中，存在差異表達(dá)蛋白，其中p73可能成為預(yù)后預(yù)測(cè)的侯選標(biāo)志物。孫懿23等用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析和電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜。在鼻咽癌細(xì)胞中驗(yàn)證鑒定了22個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)。并認(rèn)為它們可能作為p53功能相關(guān)蛋白質(zhì)，為闡明鼻咽癌中p53蛋白聚集及失活的機(jī)制提供了重要依據(jù)和線索。向亞莉24等運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，建立了5-8F和6-10B分泌蛋白質(zhì)的2-DE圖譜，質(zhì)譜分析鑒定出14個(gè)非冗余的分泌蛋白質(zhì)，作為研究NPC轉(zhuǎn)移機(jī)制以及篩選NPC轉(zhuǎn)移分子標(biāo)志物的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。張文靜25等用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選鼻咽癌的甲基化失活基因，認(rèn)為15個(gè)5-aza-2-dC處理后表達(dá)上調(diào)蛋白質(zhì)的編碼基因可能是5-8F細(xì)胞的甲基化沉默基因。周異群26等研究人鼻咽癌細(xì)胞CNE一2L2惡性生物學(xué)行為相關(guān)的蛋白，認(rèn)為高與低惡性生物學(xué)行為細(xì)胞間有l(wèi)2個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，CD44表達(dá)減弱與As細(xì)胞的惡性行為減弱相關(guān)。但是，這些結(jié)果或現(xiàn)象，都還需要組織蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)一步證實(shí)。劉宇勤等對(duì)下行型鼻咽癌原發(fā)灶組織細(xì)胞核的亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)特征及其中醫(yī)證型之間的關(guān)系研究下行型鼻咽癌不同中醫(yī)證型差異蛋白表達(dá)核蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜分析，正常分析了氣血凝結(jié)型組織樣本223號(hào)核蛋白二維電泳凝膠斑點(diǎn)和火毒困結(jié)型組織樣本20號(hào)核蛋白二維電泳凝膠斑點(diǎn)，并初步驗(yàn)證了223號(hào)和20號(hào)蛋白質(zhì)的相關(guān)生物學(xué)意義。四結(jié)語利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，可以全面、動(dòng)態(tài)地分析腫瘤患者血清樣品、腫瘤細(xì)胞分泌物、腫瘤組織間隙中混合蛋白質(zhì)的種類及數(shù)量的改變，并通過探討其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的動(dòng)態(tài)變化及分子作用網(wǎng)絡(luò)，有利于進(jìn)一步闡明腫瘤的發(fā)病機(jī)制，尋找可以應(yīng)用于腫瘤診斷、治療及預(yù)后評(píng)估的特異性標(biāo)志物，并可以促進(jìn)抗腫瘤新藥的開發(fā)27,28。不同類型的的鼻咽癌細(xì)胞，其細(xì)胞生物學(xué)特性顯然差異極大，預(yù)后與應(yīng)該采用的治療方式也應(yīng)該有所不同。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)深入探討其分子基礎(chǔ)，將有利于早期診斷和個(gè)體化治療。參考文獻(xiàn)：1閔華慶,洪明晃,郭翔.鼻咽癌M.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2003；922JonesPAEpigeneticsincarcinogenesisandcancerpreventionJAnnNYAcadSci，2003，983：213-2193HermanJG，BaylinSBGenesilencingincancerinassociationwithpromoterypermethylationJNEnglJMed，2003，349(21)：2042-20544BlackstockW,MannM.Aboundlessfutureforproteomics.Trendsiotechnol,2001,19(suppl):s1-s2.5HeQY,ChiuJF.Proteomicsinbiomarkerdiscoveryanddrugdeveloment.JCellBiochem,2003,89(5):868286.6OFARRELLPH，GOODMANHMResolufinoofsimianvirus40proteinsinwholecellextractsbytwo-dimensionalelectrophoresis：heterngeneityofmajorcapsidJcell，1976，9(2)：2892987GLLESPIEMAllfordableproteomics：thetwo-hybirdsystemsJCurrOpinMolTher，2003，5(3)：266-2708ZhangW，CzemikAJ，YungwirthT,eta1Matrix-assistedlaserdesorptionmassspectrometricpeptidemappingofproteinsseparatedbytwo-dimensionalgelelectrophoresis：DeterminationofphosphorylationinsynapsinIJProtenSci，1994，3(4)：6776869ChamradDC，KortingG，StuhlerK，eto2EvaluationofalgorithmsforpmteinidentificationfromsequencedatabasesusingmassspectrometrydataJProteome20044(3)：61962810VonEggelingF，DaviesH，LamasL，eta1Tissue-specificmicrodissectioncoupledwithproteinchiparraytechnologles：applicationsincancerresearchJBiotechniques，200029：1066107011MocellinS,RossiCR,TraldiP,etal.Molecularoncologyinthepost2genomicera:thechallengeofproteomics.TrendsMolMed,2004,10(1):243212LivingstonDM,ShivdasaniR.Towardmechanism2basedcancercare.JAMA,2001,285:58893.13PetricoinEF,LiottaLA.Clinicalapplicationsofproteomics.JNutr,2003,133(7Suppl):2476S84S.14HoebenaA，LanduytB，BotrusG，eta1Proteomicsincancerresearch：MethodsandapplicationofarraybasedproteinprefilingtechnologiesJAnalytieaChimicaActa，2006，564(1)：193315ZhangGQ，DUJ，PangDDetectionandclinicalsignificanceofserumproteomicpatternsofbreastcancersbysurfaceenhancedlaserdesorptionionizationtimeofflightmassspectrometryZhonghuaZhongLiuZaZhi，2006，28(3)：20420716WuX，XiaoZ，ChenZ，eta1Differentialanalysisoftwodimensiongelelectrophoresisprofilesfromthenormalmetaplasia1dysplasiacarcinomatissueofhumanbronchialepitheliumJPatholInt，2004，54(10)：765-77317吳登龍,張?jiān)?關(guān)明,等.蛋白質(zhì)芯片技術(shù)篩選膀胱癌尿液標(biāo)記物的研究.中華泌尿外科雜志，2004，25(7)；45345518FungET,YipTT,LomasL,etal.ClassificationofcancertypesbyMeasuringvariantsofhostresponseproteinsusingSELDIserumassays.IntJCancer,2005,115(5):783-78919YokoyamaY，KuramitsuY，TakashimaM，eta1Proteomicprofilingofproteinsdecreasedinhepatocellularcarcinoma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