免疫分析法

第三章 免疫分析法,一、概述二、抗原三、抗體與免疫反應四、免疫分析方法及應用五、免疫擴散法,主要內(nèi)容,一、概述二、抗原三、抗體與免疫反應四、免疫分析方法及應用五、免疫擴散法,主要內(nèi)容,什么叫免疫分析？基于抗原和抗體的特異性反應進行檢測的一種技術(shù)手段?？乖贵w反應是指抗原與相應的抗體之間發(fā)生的特異性結(jié)合反應。它既可以發(fā)生在體內(nèi)，也可以發(fā)生在體外。高選擇性和低檢出限。在體內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應為體液免疫應答的效應作用。體外的抗原抗體結(jié)合反應主要用于抗原或抗體的檢測，用于免疫學診斷。,一、概述,(1) 在實驗藥物動力學和臨床藥物學中，測定生物利用度和藥物代謝動力學參數(shù)等生物藥劑學中的重要數(shù)據(jù)，以便了解藥物在體內(nèi)的吸收、分解、代謝和排泄情況；(2) 在藥物的臨床檢測中，對治療指數(shù)小、超過安全劑量易發(fā)生嚴重不良反應或最佳治療濃度和毒性反應濃度有交叉的藥物血液濃度進行監(jiān)測；(3) 在藥物生產(chǎn)中，從發(fā)酵液或細胞培養(yǎng)液中快速測定有效組分的含量，以實現(xiàn)對生產(chǎn)過程的在線監(jiān)測；(4) 對藥品中是否存在特定的微量有害雜質(zhì)進行評價。,在藥物分析中，免疫分析法的應用主要集中在以下幾方面：,免疫分析： 利用抗原與抗體的特異性結(jié)合作用，來選擇性識別和測定，可以作為抗體或抗原的待測物.免疫分析方法,免疫分析檢測的發(fā)展,放射免疫檢測（興起于20世紀70年代),酶聯(lián)免疫檢測（興起于20世紀80年代，各臨床機構(gòu)普遍使用）；,以化學發(fā)光為代表的光生物學標記及免疫檢測技術(shù)（20世紀90年代開始推廣使用，產(chǎn)品步入成長期）三個階段。,可逆性,比例性反應階段性,特異性,免疫分析法的特點,特異性,特異性：抗原與抗體結(jié)合反應的專一性分子基礎:抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補性,可逆性：抗原與相應抗體結(jié)合成復合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體，解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。影響因素： 抗體對相應抗原的親合力親合力越高，結(jié)合越牢固，越不易解離 環(huán)境因素對復合物的影響pH、離子強度,比例性：抗原與抗體發(fā)生可見反應需遵循一定的量比關系前帶(prezone)：抗體過量后帶(postzone)：抗原過量等價帶(equivalence zone)：抗原抗體比例合適,一、概述二、抗原三、抗體與免疫反應四、免疫分析方法及應用五、免疫擴散法,主要內(nèi)容,抗原（antigen,Ag)：是一類能刺激機體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應答，并能與相應免疫應答產(chǎn)物（抗體和致敏淋巴細胞)在體內(nèi)外發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)抗原的兩種特性：免疫原性和抗原特異性免疫原性（immunogenicity)，能刺激機體發(fā)生免疫應答，產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細胞的能力?？乖禺愋阅芘c相應抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性結(jié)合的能力。 凡具有免疫原性和抗原性的物質(zhì)稱為完全抗原 只有抗原特異性而不具有免疫原性的物質(zhì)稱為半抗原 半抗原+蛋白質(zhì)完全抗原 賦予半抗原以免疫原性的蛋白質(zhì)稱為載體。,定義,1.抗原的免疫原性,抗原物質(zhì)必須具備的條件： 一、異物性 二、一定的理化性狀 三、完整性 四、宿主的遺傳性,一、異物性,異物是指化學結(jié)構(gòu)與宿主的自身成分相異或機體的免疫細胞從未與它接觸過的物質(zhì)。異物性的物質(zhì)包括以下幾類： 1、異種物質(zhì) 如：馬血清蛋白、各種微生物及其代謝產(chǎn)物對人體而言都是異種物質(zhì)，具有強的免疫原性。 2、同種異體物質(zhì) 如：ABO血型抗原、人類主要組織相容性抗原。 3、自身抗原物質(zhì) 如：自身組織成分結(jié)構(gòu)改變、隱蔽性自身成分暴露構(gòu)成自身抗原。,二、一定的理化性狀,大分子膠體物質(zhì) 凡具有免疫原性的物質(zhì)，分子量都較大，一般在10kDa以上,在一定范圍內(nèi),分子量越大免疫原性越強。一定的化學組成和結(jié)構(gòu) 從化學組成來看，凡含有芳香族氨基酸（尤其是酪氨酸）的蛋白質(zhì)，其免疫原性較強。從結(jié)構(gòu)來看，結(jié)構(gòu)越復雜其免疫原性越強。分子構(gòu)象與易接近性 分子構(gòu)象是指抗原分子中一些特殊化學基團的三維結(jié)構(gòu)，它決定抗原分子是否能與淋巴細胞表面的抗原受體相互吻合。易接近性是指抗原分子的特殊化學基團與淋巴細胞表面相應的抗原受體相互接觸的難易程度。,三、完整性,具有一定理化性狀的物質(zhì)須經(jīng)非消化道途徑進入機體（包括注射、吸入、混入傷口等），并接觸淋巴細胞，才能成為良好抗原。如果是口服后可被消化酶水解成胨、氨基酸，破壞了其結(jié)構(gòu)，就喪失了免疫原性。自然界中天然的抗原物質(zhì)有：蛋白質(zhì)、多糖、核蛋白,四、宿主遺傳性,抗原的免疫原性也與機體的應答能力有關，同種動物不同個體對同一種抗原的免疫應答存在明顯的差異，這種差異受遺傳因素控制，控制免疫應答的基因稱為免疫應答基因（immune response, Ir)。,2.抗原特異性,抗原決定簇（基）載體決定簇和半抗原決定簇共同抗原和交叉反應,一、抗原決定簇,1、概念 抗原決定簇（antigenic determinant, AD)是指抗原中決定抗原特異性的特殊化學基團，又稱為表位（epitope)。表位的性質(zhì)、數(shù)目和空間構(gòu)象決定著抗原的特異性?？乖ㄟ^AD與相應淋巴細胞表面的抗原受體結(jié)合，激活淋巴細胞，引起免疫應答。2、種類和數(shù)量 一個抗原分子可以有一種或多種不同的AD ，一種AD決定著一種特異性，多種AD決定著多種特異性3、部位 位于抗原表面的AD能直接被相應淋巴細胞所識別，稱功能性決定簇，存在抗原分子內(nèi)部的AD無激發(fā)免疫應答的功能，稱隱蔽決定簇。只有經(jīng)理化因素處理后，使之暴露可能成為新的功能決定簇。,4、大小 抗原決定簇的大小與相應抗體的抗原結(jié)合部位相當。一個蛋白質(zhì)抗原決定簇含5-7個氨基酸殘基一個多糖抗原決定簇含5-7個單糖一個核酸半抗原決定簇含6-8個核苷酸5、抗原結(jié)合價（antigenic valence)是指能和抗體分子結(jié)合的抗原決定簇的總數(shù)。半抗原為一價天然抗原的分子結(jié)構(gòu)復雜，分子表面有多個決定簇為多價,構(gòu)象決定簇：序列上不相連而依賴于蛋白質(zhì)或多糖的空間構(gòu)象形成的決定簇，多暴露于分子表面。順序決定簇：一段相連的氨基酸序列所形成的決定簇，多位于抗原分子內(nèi)部。功能性AD：分子表面，易被識別。隱蔽性AD：分子內(nèi)部。B細胞決定簇：分子表面。T細胞決定簇：分子內(nèi)部。,二、AD的分類,三、共同抗原和交叉反應,兩種來源不同的抗原，除各有其主要的特異性抗原決定簇外，相互之間也存在部分相同的抗原決定簇，這種共有的抗原決定簇稱為共同抗原。親緣關系很近的生物之間存在的共同抗原稱為類屬抗原。無種屬關系的生物之間存在的共同抗原稱為異嗜性抗原。一種共同抗原刺激機體產(chǎn)生的抗體，可與其他含有共同抗原的物質(zhì)發(fā)生結(jié)合反應，稱為交叉反應。,2.2 藥物分子的抗原性,1、藥物分子的免疫原性 大多數(shù)的藥物分子通常都是半抗原； 一些蛋白類藥物、多肽類藥物、激素類藥物大部分屬于完全抗原。2、藥物分子的抗原特異性 藥物分子和蛋白質(zhì)載體結(jié)合后，抗原特異性可能會發(fā)生改變。,3、藥物分析中，為了得到高效價的抗血清，通常會與蛋白質(zhì)載體合成人工抗原進行試驗。常用載體：牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OA）、破傷風類毒素（TT）、鑰孔蛋白（KLH）等。,（1）半抗原和載體結(jié)合的化學反應,多肽類激素：活化蛋白質(zhì)或多肽的游離羧基形成肽鍵；與蛋白質(zhì)或多肽的游離氨基縮合形成肽鍵甾體：甾體激素的羥基和酮基不能直接和載體蛋白形成有效的共價鍵，需要制備甾體的衍生物，通過含游離羧基的甾體衍生物與載體蛋白相連抗生素：-內(nèi)酰胺環(huán)在偏堿性條件下可以與蛋白質(zhì)的自由氨基以酰胺鍵的形式共價結(jié)合；氨基糖苷類抗生素用碳化二亞胺為連接劑實現(xiàn)藥物和載體蛋白的連接,在選擇結(jié)合半抗原的化學反應時，應考慮不同的連接方式可能對抗體的專一性產(chǎn)生不同的影響。半抗原沒有可以結(jié)合的官能團時需要合成適當?shù)难苌?。為得到特定抗原決定簇相對單純的合成抗原，需要根據(jù)半抗原的化學特性及連接產(chǎn)物的化學特性選擇連接的半抗原。,（2）半抗原和載體的選擇原則,半抗原選擇原則：最好含有芳香結(jié)構(gòu)；應考慮抗原抗體反應的微環(huán)境；合理利用分子類似物之間的交叉反應。,載體選擇原則：應考慮載體對檢測系統(tǒng)的影響：選擇的載體應和檢測體系不發(fā)生交叉反應；用于包被合成抗原的載體和用于免疫動物產(chǎn)生抗體的合成抗原的載體蛋白不同。免疫過程中考慮載體效應的影響：抗體的特異性依賴于半抗原分子結(jié)構(gòu)中的免疫決定區(qū)，但整個載體蛋白大分子對于抗體反應的性質(zhì)和量也有影響；應使用相同載體的合成抗原制備半抗原抗體。,（3）合成抗原的測定,定性測定方法： 光譜分析：半抗原和載體蛋白的結(jié)合導致蛋白構(gòu)象的改變，改變程度和半抗原的結(jié)合量有關，半抗原結(jié)合量越大，構(gòu)象改變程度越大。 熱力學分析：半抗原和載體蛋白結(jié)合后熱力學特征會有變化，差異可通過差示掃描量熱法（DCS）等方法測定。,定量測定方法 相對含量測定法：通過ELISA法比較半抗原與載體蛋白的相對結(jié)合量。絕對含量測定法：半抗原具有與載體蛋白完全不同的廣譜吸收特征，且半抗原在此特定波長下具有較強的吸收；或能利用特定的化學反應定量測定半抗原的量，且不與載體蛋白發(fā)生反應。,一、概述二、抗原三、抗體與免疫反應四、免疫分析方法及應用五、免疫擴散法,主要內(nèi)容,免疫分析實際上是一種特殊的試劑分析，特點是抗體/抗原成為分析試劑。,1、抗體的結(jié)構(gòu)與功能,抗體泛指機體經(jīng)抗原刺激由免疫活性細胞產(chǎn)生的一組免疫球蛋白，通常由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈組成常用的是IgG分子，其在血清免疫球蛋白中的含量約70%,1. 抗體（antibody, Ab）功能性概念 是由抗原刺激而產(chǎn)生并能與刺激其產(chǎn)生的抗原發(fā)生特異性結(jié)合的、具有免疫功能的球蛋白?？贵w主要存在血清中，也存在于呼吸道粘膜液、小腸粘膜液、唾液以及乳汁等其它體液中。 2. 免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）結(jié)構(gòu)性概念 具有抗體活性或化學結(jié)構(gòu)與抗體分子相似的球蛋白。所有抗體都是免疫球蛋白，但是并非所有免疫球蛋白都是抗體。,免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu),IgG分子基本結(jié)構(gòu)是由四個肽鏈組成的，二條較小的輕鏈和二條較大的重鏈，輕鏈與重鏈是由二硫鍵連接形成，分為氨基端（N端），羧基端（C端）。,一、多克隆抗體（polyclonal antibody） 1. 定義：抗原分子通常具有多個抗原決定簇，動物免疫后可刺激多種具有相應抗原受體的B細胞發(fā)生免疫應答，因而可產(chǎn)生多種針對不同抗原決定簇的抗體。這些由不同B細胞克隆產(chǎn)生的抗體稱為多克隆抗體（polycolonal antibody, PcAb）。 2. 實際意義 （1）預防、治療感染性疾病（特異性差，可發(fā)生超 敏反應） （2）臨床診斷,二、單克隆抗體（monoclonal antibody, McAb） 1. 定義：由單一克隆B細胞雜交瘤產(chǎn)生的、只識別 抗原分子某一特定抗原決定簇的、具有高度特異性的 抗體。每種單克隆抗體其類、亞類、型及親和力完全 相同，具有高度均一性。 2. 特點 具有高度均一性。 3. 雜交瘤細胞 骨髓瘤細胞無限增殖； 免疫B細胞合成、分泌特異性抗體。 4. 雜交瘤技術(shù) HAT培養(yǎng)基：次黃嘌(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺 嘧啶核苷(T)。,三、基因工程抗體 基因工程抗體是通過PCR技術(shù)獲得抗體基因或抗體基因片段，與適當載體重組后引入不同表達系統(tǒng)所產(chǎn)生的抗體，被廣泛應用于疾病的臨床診斷、預防和治療及基礎理論研究等領域。 人-鼠嵌合抗體（chimeric antibody）； 人改型抗體（reshaped humanized antibody）； 小分子抗體； 雙特異性抗體（bispecific antibody）等。,、,2抗體作為分析試劑的評價,抗體的特異性是無與倫比的，不需或只需要簡單的預處理。有較高的穩(wěn)定性。這兩點奠定了分析免疫高度靈敏和高度專一的基礎。此外，抗體還有一個獨特的性質(zhì)：每個抗體分子有兩個抗原的結(jié)合點，即多價性。然而抗體缺乏高靈敏試劑應具備的分析信號反差。,3、抗體的制備,（1）常規(guī)抗血清（多克隆抗體）：指人工被動免疫后制成的多克隆抗體，是免疫分析中的重要工具。免疫原的制備、動物免疫、放血、抗血清分離及抗血清的分析鑒定。,免疫原的制備,免疫原由質(zhì)量好的抗原與佐劑制成。通常有免疫原水劑、福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑。水劑由無菌生理鹽水將抗原制成一定濃度的免疫原。弗氏佐劑是由一定量的羊毛脂和石蠟油，以及一定濃度的分支桿菌混合而成，經(jīng)研磨達到油包水的程度。不完全福氏佐劑即不含有分支桿菌。,動物免疫,通常的免疫動物為家兔和羊。免疫的部位多采用腳掌、腹股溝淋巴結(jié)、大腿肌肉、皮下多點、靜脈。免疫抗原量通常為110mg或50100mg。,試血及效價測定,家兔的試血通?？捎啥夓o脈取血，取血量0.5ml。不同稀釋度的抗血清和1%的血細胞懸液按1:1混合，37保溫2h后觀測血細胞的凝聚情況，即可測得免疫血清的效價。,（2）單克隆抗體,單克隆抗體是建立在經(jīng)細胞融合而獲得的雜交瘤細胞基礎上的。所獲得的抗體具有均一的特異性。高度均質(zhì)性的特異性抗體，由一個識別單一抗原表位的B細胞克隆所分泌。一般來自雜交瘤細胞細胞培養(yǎng)法 & 接種動物體內(nèi)生產(chǎn)法,2、抗體的純化,利用化學方法提純或濃縮某一類的免疫球蛋白。利用免疫吸附劑和親和色譜得到免疫學上專一性的抗體。,2017/11/2,49,沉淀分離,通過改變?nèi)芤旱臈l件或添加某種物質(zhì)，降低溶液中某一成分的溶解度，使其從溶液中沉淀析出，與其它成分分離的技術(shù)。是純化生物大分子物質(zhì)常用的經(jīng)典方法包括鹽析沉淀法、有機溶劑沉淀法和非離子聚合物沉淀法等。,2017/11/2,50,（一）鹽析法,在物質(zhì)的水溶液中添加一定濃度的中性鹽，使物質(zhì)的溶解度減小而沉淀析出，這一過程稱為“鹽析”。優(yōu)點：成本低，不需要昂貴的設備；操作簡便，安全；對許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用；對pH、溫度要求不嚴格。缺點：分離效果有限,2017/11/2,51,鹽析的基本原理,蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度是由蛋白質(zhì)親水基團、與水形成水化膜的程度、以及所帶有電荷的情況決定的。當中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液中，鹽離子對水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，于是減弱甚至消除蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜。同時，鹽離子所帶的電荷中和部分蛋白質(zhì)分子表面電荷，更加導致其溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。,2017/11/2,52,鹽類和濃度的選擇,常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等硫酸銨最為常用，其優(yōu)點是：溶解度大；溫度系數(shù)?。幻芏刃?，有利于析出蛋白的離心分離；蛋白沉淀物在2 mol/L3 mol/L硫酸銨溶液中穩(wěn)定，低溫下可保存一年；價廉易得；分離效果比其它鹽好。但硫酸銨緩沖能力比較弱，pH難控制；銨離子干擾蛋白質(zhì)的測定，所以有時也用其它中性鹽進行鹽析。高濃度鹽析法是粗純樣品的常用方法。,2017/11/2,53,脫鹽,蛋白質(zhì)用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的方法有：透析法超濾法葡聚糖凝膠G50層析法。,2017/11/2,54,（二）有機溶劑沉淀法,利用待分離物質(zhì)與雜質(zhì)在有機溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機溶劑，使某一溶質(zhì)沉淀析出，從而與其它成分分離的方法。,有機溶劑破壞溶質(zhì)分子周圍的水化層；有機溶劑降低溶液的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)的溶解度降低。,2017/11/2,55,優(yōu)點：分辨率比鹽析法高，即一種溶質(zhì)發(fā)生沉淀的有機溶劑濃度范圍比較窄；溶劑容易除去，并可以回收；沉淀無需脫鹽，易于離心或過濾分離。缺點：有機溶劑可使某些生物大分子變性失活，操作常需在低溫下進行；有機溶劑具有一定毒性。,2017/11/2,56,有機溶劑的選擇,選擇有機溶劑的原則：有機溶劑的水溶性好；沉淀效率高；毒性小，避免損害工作人員的健康和污染環(huán)境；不與溶質(zhì)分子發(fā)生化學反應，價格便宜。使用較多的是乙醇、丙酮、甲醇等。,2017/11/2,57,殘留的有機溶劑去除的方法： 自然蒸發(fā)或負壓蒸發(fā)，可在室溫進行； 凝膠過濾除去。,（三）離子交換層析法,離子交換層系（ion exchange chromatography， IEC）是利用離子交換劑上可交換離子與組分中的離子發(fā)生可逆交換時結(jié)合力的差別，而進行分離的一種技術(shù)。廣泛應用于很多生命物質(zhì)的分析、制備和純化等。,優(yōu)點： 重現(xiàn)性好，簡單易行； 分辨力強，回收率高； 具有多孔性，表面積大、交換容量大； 具有親水性，對大分子的吸附不牢固，層析條件溫和，不致引起物質(zhì)變性或失活。,2017/11/2,59,離子交換法的固定相是離子交換劑；若擔體帶有正電荷，可吸附著負電荷分子，則為陰離子交換法；不帶凈電荷的分子，以及陽離子則直接流出，不會被吸附上去。這些被固相單體所吸附的離子，統(tǒng)稱為 counter ion，因為其電荷與擔體上的電荷相反 (counter 是 相反 的意思),離子交換劑為人工合成的惰性高分子聚合物，其上帶有許多可電離基團，根據(jù)這些基團所帶電荷的不同，可分為陰離子交換劑和陽離子交換劑。它可分三部分：高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團和平衡離子。,基本原理,2017/11/2,60,陽離子交換反應：R-A- H+ + Y+ R-A- X+ + H+ 陰離子交換反應：R-B+ OH- + X- R-B+ X- + OH- R代表離子交換劑的高分子聚合物基質(zhì)，A- 和B+分別代表陽離子交換劑和陰離子交換劑中與高分子聚合物共價結(jié)合的電荷基團，H+ 和OH-分別代表陽離子交換劑和陰離子交換劑的平衡離子，Y+ 和X-分別代表溶液中的離子基團。,2017/11/2,61,2017/11/2,62,兩性離子如蛋白質(zhì)、酶類和核苷酸等物質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力，主要取決于它們的理化性質(zhì)和在特定pH條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。大多數(shù)蛋白在生理pH（pH68）下帶負電荷，需用陰離子交換柱純化，極端的pH下蛋白會變性失活，應盡量避免。 洗脫可采用改變?nèi)芤旱膒H或離子強度，也可同時改變pH與離子強度的方法。改變pH可能對蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響，一般采用改變離子強度的梯度洗脫。用鹽濃度梯度去洗脫離子交換柱，利用泵的輔助可以使流入柱的緩沖液中鹽濃度平穩(wěn)地上升，當離子強度能夠中和蛋白的電荷時，蛋白就被從柱上洗脫下來。,2017/11/2,63,在陰離子交換柱上血漿蛋白組分的分段洗脫,2017/11/2,64,三、技術(shù)要點,（一）離子交換劑的選擇和處理兩性離子如蛋白質(zhì)、酶類和核苷酸等物質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力，主要取決于它們的理化性質(zhì)和在特定pH條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。大多數(shù)蛋白在生理pH（pH68）下帶負電荷，需用陰離子交換柱純化，極端的pH下蛋白會變性失活，應盡量避免。處理的目的：使交換劑充分溶脹，使其顆粒的孔隙增大，讓具有交換活性的電荷基團充分暴露出來，再用酸堿浸泡，除去雜質(zhì)并使其帶上需要的反離子。 （二）裝柱和加樣選擇平衡緩沖液的離子強度和pH時，首先要保證待分離物質(zhì)的穩(wěn)定；其次是使離子交換劑與待分離物質(zhì)有適當?shù)慕Y(jié)合，而不與樣品中雜質(zhì)結(jié)合，以達到分離的目的。溶液的離子強度常用不影響蛋白質(zhì)吸附到交換劑上的最高離子強度液，常用的離子強度為20 mmol/L 50 mmol/L NaCl。（三）洗脫和收集洗脫可采用改變?nèi)芤旱膒H或離子強度，也可同時改變pH與離子強度的方法。改變pH可能對蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響，一般采用改變離子強度的梯度洗脫。用一定鹽濃度梯度去洗脫離子交換柱，利用泵的輔助可以使流入柱的緩沖液中鹽濃度平穩(wěn)地上升，當離子強度能夠中和蛋白的電荷時，蛋白就被從柱上洗脫下來。（四）離子交換劑的再生與保存使其帶上所需的平衡離子。,2017/11/2,65,（四）親和層析法,親和層析是利用某些生物分子之間專一可逆結(jié)合特性的一種高度專一的吸附層析類型。配體是發(fā)生親和反應的功能部位，也是載體和被親和分子之間的橋梁。配體本身必須有兩個基團： 一個能與載體共價結(jié)合，連接后的配體對互補分子的親和力不會改變 一個能與被親和分子結(jié)合。,2017/11/2,66,親和層析法有點像在釣魚，魚是我們所要的分子 (B) 雜夾在一堆蛋白質(zhì)當中，魚餌是與 B 具有專一性的分子 (A, 上圖 1)；A 與 B 的專一性很高，只會在樣本中與 B 結(jié)合，而排除其它雜質(zhì) (上圖 2)；若把結(jié)合在吸著劑上的 B 溶離下來，就可以得到均質(zhì)的 B (上圖 3)。,2017/11/2,67,親和層析中部分蛋白配體,3、特異性抗體的篩選與效價測定,抗體的效價又稱滴度，指某一物質(zhì)與一定容量的另一物質(zhì)產(chǎn)生反應所需要的量。免疫分析中，免疫血清中抗體的效價指將血清稀釋，測定與一定的抗原能發(fā)生反應的最大稀釋度，此最大稀釋度即為血清的效價。常用的效價測定方法有免疫擴散法、間接血凝法和ELISA法等。特異性抗體的篩選，制備出含不同的抗原決定簇的特異性抗原，然后根據(jù)抗體和這些抗原相互作用的強弱進行分析。,一、概述二、抗原三、抗體與免疫反應四、免疫分析方法及應用,主要內(nèi)容,四、免疫分析方法及其應用,放射免疫分析法（RIA）熒光免疫分析法（FIA）克隆酶給予體免疫分析法（CEDIA）酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）,核醫(yī)學,治療：腫瘤、甲亢等診斷 體內(nèi)PET、SPECT、 放射免疫成像等 體外放射免疫分析（RIA）,標記免疫分析技術(shù),用標記示蹤技術(shù)觀察抗原抗體一級反應的分析方法,是體外放射分析技術(shù)中建立最早、應用最廣的一類競爭性體外放射分析技術(shù).特點：敏感性高，反應時間短，可用儀器檢測結(jié)果三大標記免疫分析技術(shù)：放射免疫、熒光免疫、酶免疫 檢測方法 檢測范圍生化、常規(guī)免疫 mgg（10-3 10-6 g）熒光免疫、酶免疫 gng（10-6 10-9 g）放射免疫、發(fā)光免疫 ngpg（10-9 10-12 g）PCR pgfg（10-12 10-15 g）,一、放射免疫分析技術(shù)（Radioimmunoassay，RIA）,女科學家 R.Yalow（美,1921）1950末發(fā)明（胰島素），1977年獲諾貝爾醫(yī)學獎1. 基本原理（1）競爭結(jié)合分析：Ag + Ab AgAb *Ag + Ab *AgAb（2）IRMA（免疫放射分析）：2. 常用標記核素：（1）125I： 射線，半衰期 60 天（2）3H： 射線，半衰期 12.3 年3. 測量儀器（1） 計數(shù)儀（2） 液閃儀,基本原理,Ab限量，Ag*定量,Ag*和Ag的量大于Ab結(jié)合位點，二者通過競爭方式與Ab結(jié)合；隨著Ag增加，Ag*與Ab結(jié)合形成Ag*Ab復合物的放射量降低,二者變化成函數(shù)關系。,具體步驟,抗原抗體反應,結(jié)合的和游離的放射性物質(zhì)的分離,放射性活度的測定,柱色譜法吸附法沉淀法抗抗體發(fā)微孔濾膜法固相法,求出結(jié)合率，繪制標準曲線（劑量反應曲線）,以未結(jié)合的Ag*為F，Ag*Ab復合物為B，則B/F或B/(BF)與Ag的量變存在著函數(shù)關系劑量反應曲線,注：T即是B與F的總和,基本原理 它采用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應，用于定量測定。 測定的對象可以是抗體也可以是抗原。在這種測定方法中有3種必要的試劑： 固相的抗原或抗體（免疫吸附劑） 酶標記的抗原或抗體（標記物） 酶作用的底物（顯色劑）,二、酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）,測量時，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應結(jié)合后，,再加上酶的相應底物，即起催化水解或氧化還原反應而呈顏色。,ELISA原理,酶及其底物 酶結(jié)合物（過碘酸鹽氧化法、戊二醛交聯(lián)法）是酶與抗體或抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應，還具有酶促反應，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物 ，將得到不同的顏色反應。,ELISA原理,ELISA的種類和變化,（一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）競爭法 （四）雙位點一步法（五）捕獲法測IgM抗體（六）應用親和素和生物素的ELISA,（一）雙抗體夾心法,此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原,獲得待分析物的未標定抗體,將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體,洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì),加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結(jié)合位點,洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白,加受檢標本（抗原）形成固相抗體抗原復合物,洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì),加酶標抗體生成抗體待測抗原酶標記抗體的復合物,徹底洗滌未結(jié)合的 酶標抗體,加底物進行酶催化反應,根據(jù)顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量測定,間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。,（二）間接法,包被固相載體: 用已知抗原包被固相載體,加待檢標本: 使相應抗體與固相抗原結(jié)合洗滌，除去無關的物質(zhì),加酶標抗抗體:與固相載體上抗原抗體復合物結(jié)合；洗滌，除去未結(jié)合的酶標抗抗體,加底物顯色,根據(jù)顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量測定,ELISA法間接法測定抗體1.原理,（三）競爭法,對照管由于只加酶標抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色深；測定管的顯色程度則隨待測抗原和酶標抗原與固相抗體競爭結(jié)合的結(jié)果而異。如待測抗原量多，競爭性地抑制酶標抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合的酶標抗原量減少。因此，加入底物后顯色反應較弱。,用已知特異性抗體包被固相載體,測定管加待測抗原和一定量的酶標抗原使二者與固相抗體競爭結(jié)合,對照管只加一定量酶標抗原與固相抗體直接結(jié)合,分別洗滌除去未結(jié)合的成分,加底物顯色,分別測定兩管的吸光度值，根據(jù)對照管與測定管吸光度值之比， 計算標本中待測抗原含量,ELISA特點一：靈敏性 該測定法的靈敏度來自作為報告基團的酶。酶是一種有機催化劑，很少量的酶即可誘導大量的催化反應 ，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應現(xiàn)象。因此該體系常被稱為酶放大體系。ELISA實現(xiàn)了在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對其進行定量。 例如，在測定血清中某一物質(zhì)的含量時，化學比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應測定法的敏感度約為5-10g/ml 。,特點二：特異性 其特異性來自抗體或抗原的選擇性?？乖贵w的結(jié)合實質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點之間。由于兩者在化學結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補關系，所以抗原抗體反應具有高度的特異性。,ELISA要有三個必要的試劑，即免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。完整的ELISA試劑盒應包含以下各組分：（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑，俗稱酶標板）；（2）酶標記的抗原或抗體（酶標記物）；（3）酶的底物；（4）系列參考標準品（定量測定）；（5）酶標記物及樣本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）反應終止液。,二、ELISA試劑,ELISA試劑盒,ELISA試劑的作用,2.1 免疫吸附劑： 已包被抗原或抗體的固相載體，是ELISA方法中的核心試劑。固相載體： 固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學反應。可作ELISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。專用于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板，國際上標準的微量滴定板為812的96孔式。 良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。,包被,將抗原或抗體固定化的過程稱為包被(coating)。換言之，包被即是抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過程?？贵w或蛋白質(zhì)等抗原是通過物理吸附與聚苯乙烯等固相載體結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的相互作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響。載體對不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。,封閉,封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質(zhì)溶液再包被固相載體表面剩余吸附位點的過程。蛋白質(zhì)抗原或抗體包被時所用的一般濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的吸附位點，封閉就是讓大量不相關的蛋白質(zhì)充填這些吸附位點，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附，增加ELISA反應得專一性和靈敏度。封閉的程序與包被過程相類似。最常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白。研究表明，脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大的特點是價廉，可以高濃度使用（5%）。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復雜，而且封閉后的載體不易長期保存，因此在試劑盒的制備中較少應用。,2.2 酶標記物即酶標記的抗原或抗體，是ELISA中最關鍵的試劑。良好的酶標記物應該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。酶標記物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當?shù)姆肿颖壤?，在酶標記物中應盡量不含有或少含有游離的（未結(jié)合的）酶或游離的抗體（或抗原）。此外酶標記物還要有良好的穩(wěn)定性。在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。,2.3 酶的底物2.3.1、HRP的底物HRP催化過氧化物的氧化反應，最具代表性的過氧化物為H2O2，其反應式如下：DH2+ H2O2 D+ H2O 上式中，DH2為供氫體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物，以便作比色測定。常用的供氫體有鄰苯二胺(O-phenylenediamine, OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB),2.3.1 HRP的底物,OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物最常用的底物。OPD見光易變質(zhì)，與過氧化氫混合成底物應用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。TMB經(jīng)HRP作用后產(chǎn)物顯藍色，酶反應用HCl或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為405nm。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無致癌性等優(yōu)點，因此在ELISA中應用日趨廣泛。,2.4.2 AP的底物AP為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作為底物，可制成片劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應后，黃色可穩(wěn)定一時間。,2.5 洗滌液滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。,2.6 對照品陰性對照品須先行檢測，確定其中不含待測物質(zhì)。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg。陽性對照品多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質(zhì)，其中加入一定量的待檢物質(zhì)，此量最好在試劑說明書中標明。加入的量應與試劑的敏感度相稱。國外檢測HBsAg的ELISA試劑盒檢測敏感度約為0.5 ng/ml，陽性對照品中含量約為10 ng/ml。在對照品中一般加入抗生素和防腐劑，以利保存。2.7 標準品定量測定的ELISA試劑盒應含有制作標準曲線用的標準品，應包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中。,1、樣品的采集與保存2、試劑的準備3、包被4、加樣在ELISA實驗中一般有5次加樣步聚，即加標準品、加樣本、加酶標記物、加底物、加反應終止液。,三、ELISA實驗過程,4、保溫在ELISA中一般加標本和加酶標記物后會有一次抗原抗體反應?？乖贵w反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)。 ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固