【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）胃癌細(xì)胞株BGC-823中Notch1調(diào)控MMP-9表達(dá)的研究

蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 胃癌細(xì)胞株 控 達(dá)的研究 - 1 - 前言 惡性腫瘤是中國人口的第二大死因， 胃癌是其中最常見的惡性消化道腫瘤。全球每年新發(fā)胃癌 100余萬例，中國占 42%； 死亡約 80萬例，中國占 35%。因此， 我國是胃癌發(fā)病率和死亡率最高的國家之一，此兩項(xiàng)指標(biāo)均高于世界平均水平兩倍以上 1。 目前醫(yī)學(xué)界公認(rèn)，根治性手術(shù)切除在胃癌外科治療中是最有效的方法，但術(shù)后五年生存率僅為 55 左右 2。盡管近年來對(duì)胃癌的研究已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展，但其早期診斷和治療效果依然不盡如人意，尤其是對(duì)于晚期和伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臟器轉(zhuǎn)移的胃癌患者的治療 3。 從疾病發(fā)生的過程來看 ，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是引起胃癌患者預(yù)后不良和死亡的主要原因 4。 也是 影響惡性腫瘤治療困難 和生存率低的因素。 因此對(duì)惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制的研究，可以為抗腫瘤治療和改善預(yù)后提供理論依據(jù)， 有助于找 尋 防治腫瘤轉(zhuǎn)移的有效 方法 。 腫瘤的轉(zhuǎn)移通過一系列的步驟，包括腫瘤細(xì)胞侵襲，基底膜降解和細(xì)胞外基質(zhì)降解，最后導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。 基質(zhì)金屬蛋白酶 （ 族是細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)的酶，被認(rèn)為是促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要因子。 腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中起著很關(guān)鍵的作用，因?yàn)槠淇山到?的多種蛋白質(zhì)成分，進(jìn)而破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，故在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用越來越受到重視，被認(rèn)為是該過程中主要的蛋白水解酶。 一類結(jié)構(gòu)中含有 金屬離子 的肽鏈內(nèi)切酶基因家族， 根據(jù)作用 底物和結(jié)構(gòu) 同源性， 族可分為 六大類： 膠原酶、明膠酶、基質(zhì)降解素、基質(zhì)溶解素、 膜型金屬蛋白酶 和其他分泌型 在 族中， 重要成員，主要來源于巨噬細(xì)胞，是 子量為 92 型膠原酶）， 有效的降解基底膜的主要成分型膠原蛋白 5，而細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分是型 膠原蛋白?？梢?腫瘤細(xì)胞脫落、侵襲及轉(zhuǎn)移中起著非常重要的作用，所以認(rèn)為是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要因子 6。 大量的研究發(fā)現(xiàn)， 甲狀腺癌 7、結(jié)腸癌 8、乳腺癌 9等癌組織中的表達(dá)顯著高于正常組織，并且與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。 10用免疫組織化學(xué)的方法檢測 91 例胃癌患者的胃癌組織 ,發(fā)現(xiàn) 表達(dá)和進(jìn)展期胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 ,微血管密度與 正相關(guān) ,從而認(rèn)為 以促進(jìn)胃癌侵襲。 潘海邦等 11研究發(fā)現(xiàn)，胃癌中 高表達(dá)，且與胃癌的分化、侵襲、轉(zhuǎn)移、臨床分期均密切相關(guān)，由此提示 胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后有密蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 胃癌細(xì)胞株 控 達(dá)的研究 - 2 - 切關(guān)系。 919年發(fā)現(xiàn)于果蠅，該種基因突變可造成果蠅翅膀鋸齒樣缺損。 究組 1983年首次克隆了該基因，并命名為 隨后的研究發(fā)現(xiàn)， 家族成員在進(jìn)化上高度保守的跨膜受體蛋白家族，幾乎參與全部細(xì)胞組織的增殖、分化、凋亡等多種重要的生命活動(dòng)過程，并發(fā)揮不同的調(diào)控作用。 導(dǎo)通路是由 前發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物中有 4個(gè)同源性 別是 血干細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞的表面。四種 00 據(jù)其與細(xì)胞膜的關(guān)系分為胞外區(qū) (跨膜區(qū) (胞內(nèi)區(qū) (部分 12。 種：分別是 13。 于細(xì)胞膜表面。個(gè)裂解位點(diǎn)，分別是 3位點(diǎn)，其中 須經(jīng)過 3次裂解： （ 1） 1位點(diǎn)（ 1654位精氨酸殘基和 1655位谷氨酸殘基之間）裂解為胞外區(qū)（ 跨膜區(qū)（ 2個(gè)亞基，以非共價(jià)鍵（二硫鍵）連接在一起，形成異二聚體定位在細(xì)胞膜表面。 (2) 在 金屬蛋白酶 (用下于 1710與纈氨酸 端和 個(gè)片段。 （ 3） 配體表達(dá)細(xì)胞吞噬，而 3位點(diǎn)（在跨膜區(qū)甘氨酸 1744之間）被 放 ，激活下游的靶基因，通過一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最后在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)功能 14,15。所以抑制 16,17。 本 研究中，我們選擇 過對(duì) 3進(jìn)行干預(yù)，用 不同 濃度 的 外培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞株 應(yīng) 用實(shí)時(shí)熒光定量 分析胃癌細(xì)胞株 探討 能 機(jī)制 ， 為下一步的實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。相信 通過我們的研究， 將有助于揭示 在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的 分子機(jī)制，以利于找到新的預(yù)防和治療以及未來的分子靶向治療胃癌的途徑 。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 胃癌細(xì)胞株 控 達(dá)的研究 - 3 - 材料與方法 1 材料 胃癌細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞株 購于 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院 主要試劑 養(yǎng)基 司 細(xì)胞培養(yǎng)用新生牛 血清 杭州四季清公司 胰蛋白酶 司 司 司 引物設(shè)計(jì)、合成 司 T 司 司 解液 碧云天 脫脂奶粉 北京普利來公司 x 司 濾紙 上海生工 白定量試劑盒 北京普利來公司 司 兔抗人 克隆抗體 司 兔抗人 克隆抗體 杭州賢致 兔抗人 克隆抗體 司 辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔 抗 司 光液 司 過硫酸銨 （ 上海生工 丙烯 酰 胺 司 十二烷基硫酸鈉 ( 上海生工 上海生工 蛋白 司 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 胃癌細(xì)胞株 控 達(dá)的研究 - 4 - 甘氨酸 上海生工 上海生工 上海生工 上海生工 微量 加 樣器 上海生工 超純水 蘭州大學(xué) 第一醫(yī)院 定影粉 北京中杉公司 顯影粉 北京中杉公司 主要儀器 超凈工作臺(tái) 蘇州凈化 4 冰箱 20 冰箱 80冰箱 箱 日本三洋公司 光學(xué)倒置顯微鏡 日本 司 低溫高速離心機(jī) 德國 司 500 型酶聯(lián)免疫分析儀 美國 核酸蛋白定量儀 通用 公司 實(shí)時(shí)定量 ( 羅氏 診斷產(chǎn)品有限 公司 增 儀 ( 700 超純水設(shè)備 色搖床 北京六一實(shí)驗(yàn)儀器廠 膠板 北京六一實(shí)驗(yàn)儀器廠 電泳儀 北京六一實(shí)驗(yàn)儀器廠 半干式電轉(zhuǎn)移槽 北京六一 實(shí)驗(yàn)儀器廠 垂直電泳槽 北京六一實(shí)驗(yàn)儀器廠 電子天平 S 400S 移液器 日本立洋 主要溶液配制 細(xì)胞培養(yǎng)用 沖液 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 胃癌細(xì)胞株 控 達(dá)的研究 - 5 - 2O . 2g， 溶于 1000 高溫 高壓消毒 ， 4長期保存 。 250 50沖 液攪拌 30解后 ，用 裝后 ， 20 避光保存。 胰蛋白酶 蛋白酶加入 100沖 液 中 ，用 整 用 分裝， 4保存 。 超純水按照說明配置，加入 100U/霉素 、 100U/霉素， 用整 右，過濾 用 分裝， 4 保存?zhèn)溆谩?細(xì)胞凍存液 生牛血清溶于 制成 1胞凍存液。 稱取 于 90純水 中，用 濃 相應(yīng)值 后 ， 定容到 100高溫 高壓消毒 30溫保存 。 稱取 90純水溶 解，用 濃 相應(yīng)值 后 ， 定容到 100高溫 高壓消毒 30溫保存 。 稱取 180純水溶 解，用 濃 相應(yīng)值 后 ， 定容 到 200高溫 高壓消毒 30溫保存 。 10 8g， 200分溶解在超純水中后 ，最后 定容 到 10004 保存 ， 使用 前 將其稀釋 10 倍。 10電泳緩沖液： 0g，甘氨酸 充分溶解在超純水中后， 最后定容到 1000溫保存 ， 使用 前 將其 稀釋 10 倍。 2陽極緩沖液 I（ 稱取 醇 100于超純水 ，用 最后定容 到 500溫保存 ， 使用時(shí)將其稀釋 2 倍 。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 胃癌細(xì)胞株 控 達(dá)的研究 - 6 - 2陽極緩沖液 醇 100溶于超純水， 以 定容 到 500溫保存 ， 使用時(shí)將其稀釋 2 倍 。 4陰極緩沖液（ 氨酸 6g，甲醇 200于超純水， 以 定容 到 500溫保存 ， 使用時(shí)將其稀釋 4 倍 。 5 5L 甘油 2.5 芬藍(lán) 25用 超純水定 容 至 5分振蕩混勻后，分裝于 心 管中， 4 保存。 封閉液 （ 5%脫脂奶粉） ： 將 脂奶粉溶于 10 ，現(xiàn)用現(xiàn)配。 抗體溶液： 將一抗、二抗按一定的稀釋比例加入 新鮮配制 5%脫脂奶粉中 。 10 麗春紅染液： 將 麗春紅 2g，磺基水楊酸 30g，三氯乙酸 30g， 溶解 于 100純水中，使用時(shí)將其稀釋 10 倍。 定影液： 將定影藥粉 中小包 溶解于 10005 溫水中，待全溶 透明后加入大包藥粉攪拌，充分溶解后，定容到 ，待冷卻至室溫后使用 。 顯影液： 將 顯 影藥粉 中小包 溶解于 10005 溫水中，待全溶 透明后加入大包藥粉攪拌，充分溶解后，定容到 ，待冷 卻至室溫后使用 。 10%將 10g 解于 100純水， 50 水浴下溶解，室溫保存。 10%過硫酸胺（ 硫酸胺 , 溶于 1純水 中 ， 4 保存，保存時(shí)間為 7 天 。 理水： 量取超純水 100 合均勻后， 高溫 高壓消毒 30然冷卻后， 4 儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?0)： 將 10丙醇中，溶解后，分裝在 心管中， 20保存。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 胃癌細(xì)胞株 控 達(dá)的研究 - 7 - 2 方法 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌 細(xì)胞 株 含 10%新生牛血清、 鏈 霉素 (100U/青霉素(100U/ 養(yǎng)液中， 37 ， 5% 95%空氣 細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī) 培養(yǎng)。 胞傳代 代前準(zhǔn)備 （ 1） 培養(yǎng)用液 的 預(yù)熱：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、胰蛋白酶和 沖液的瓶子放入 37 水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。 （ 2） 用 75%酒精擦拭雙手和經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺(tái)。 （ 3） 正確擺放使用的器械：保證足夠 有效 的操作空間，不僅 方便 操作而且能夠 減少污染。 （ 4） 點(diǎn)燃酒精燈：注意 酒精燈內(nèi)酒精不得超過酒精燈最大容量的 2/3， 酒精燈火焰不能太小。 （ 5） 準(zhǔn)備好 實(shí)驗(yàn)中要 用的 經(jīng)過 消毒的空培養(yǎng)瓶 。 （ 6）將 預(yù)熱好的培養(yǎng)用液取出： 將 已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液取出，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈 工作 臺(tái)內(nèi)。 （ 7）將 細(xì)胞 從 培養(yǎng)箱內(nèi)取出：注意細(xì)胞取出時(shí)要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺(tái)面 后， 在鏡下觀察細(xì)胞。 （ 8） 打開瓶口：將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入超凈 工作 臺(tái)內(nèi)，將各瓶口 依次 打開， 同時(shí)要在酒精燈上消毒 瓶口。 蛋白酶消化 （ 1） 加入 胰蛋白酶 ： 先將瓶內(nèi)舊 培養(yǎng) 液 小心倒出 ，用 洗 2 3 次后 ，加入 化液（ 胰蛋白酶 ） ， 輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面。注意消化液的量以蓋住細(xì)胞最好，消化最佳溫度是 37 。 （ 2） 顯微鏡下觀察細(xì)胞： 消化 2 5，將培養(yǎng)瓶瓶蓋旋緊后置于 倒置顯微鏡下 進(jìn)行 觀察 。 若 發(fā)現(xiàn)細(xì) 胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間 間隙增大 ， 應(yīng)立即終止消化，進(jìn)行下一步操作 。 （ 3） 倒出消化液 加入培養(yǎng)液：棄去胰蛋白酶液，加入含 10%新生小牛血清的 新鮮培養(yǎng)液 ，終止消化 。 打分散細(xì)胞 用吸管將消化 后的 細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液， 將 細(xì)胞懸液加入到 10 心管蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 胃癌細(xì)胞株 控 達(dá)的研究 - 8 - 中。 用天平配平 后 ， 將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中，以 1000 心 5倒出上清 液 ，加入培養(yǎng)液適量，輕輕用滴管吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。 裝 稀釋 細(xì)胞 （ 1） 分裝： 用滴管 將細(xì)胞懸液吸出 ， 分裝至 2 3 個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入 8 旋緊瓶蓋。 （ 2） 顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞 數(shù) ，必要 時(shí) 計(jì)數(shù) ， 并標(biāo)記好時(shí)間、 操作者 和細(xì)胞名稱。注意密度過小會(huì)影響傳代細(xì)胞的生長， 所以 傳代細(xì)胞的密度不應(yīng)低于 5105/ 續(xù)培養(yǎng) 用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入 37， 5%胞 培養(yǎng)箱中繼續(xù) 常規(guī) 培養(yǎng)。 細(xì)胞的凍存 凍存細(xì)胞時(shí)要緩慢冷凍。因?yàn)榧?xì)胞在不加任何保護(hù)劑的情況下直接冰凍時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外的水分會(huì)快速形成冰晶，冰晶的形成會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損害，甚至引起細(xì)胞死亡。 （ 1） 取 處于對(duì)數(shù)生長期， 生長狀態(tài)好的細(xì)胞 用胰蛋白酶消化 制成 單 細(xì)胞懸液 。 （ 2） 1000 5心 ，用 沖液 洗滌 。 （ 3） 加入 配置好的含 10%細(xì)胞 凍存液中， 凍存液中 細(xì)胞 的最 終密度為 （ 5 10） 106/ （ 4） 用吸管輕輕吹打 使細(xì)胞 均勻，然后分裝入 無 菌凍存管中，每 只凍存 管加液 1 （ 5） 旋緊密封 凍存管， 管上 寫明細(xì)胞 的 名 稱和凍存時(shí)間 ，裝入已作標(biāo)記的小袋 。 （ 6） 先放入 4 冰箱 40著置于 20 冰箱，約 30 60置于 80 超低溫冰箱中放置過夜，最后 移入 液氮罐中長期保存。 細(xì)胞的復(fù)蘇 細(xì)胞復(fù)蘇的原則 是 快速融化：必須將凍存的細(xì)胞快速融化至 37 ，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶 在很短的時(shí)間即 融化，避免 由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)結(jié)晶 對(duì)細(xì)胞造成損害。 （ 1）提前 打開水浴鍋，溫度調(diào) 節(jié)為 37 ，待溫度 穩(wěn)定到 37 后， 將細(xì)胞凍存管從液氮中取出， 直接 放入 37 水浴中 輕輕 搖動(dòng) ，使 凍存管 內(nèi)容盡 快融化 。 （ 2）從 37 水浴中取出凍存管， 用吸管 吸出細(xì)胞懸液， 移入 10心管中，加入 3養(yǎng)液， 混合后 1000離心 5出離心管，蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 胃癌細(xì)胞株 控 達(dá)的研究 - 9 - 棄 去上清 液 。 （ 3） 用吸管再加入 6養(yǎng)液，輕輕吹打?qū)⒓?xì)胞懸浮， 1000心 5出離心管 ， 棄上清 。 （ 4）用吸管加入 2 10%新生牛血清的 養(yǎng)液，輕輕吹打?qū)⒓?xì)胞懸浮， 再將管內(nèi)液體移入己加 6 10%新生牛血清的 養(yǎng)液的 75養(yǎng)瓶中。 （ 5） 將 胃 癌細(xì)胞 株置 于 37 ， 5% 95%空氣 細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置 培養(yǎng)。 （ 6） 隔夜，將培養(yǎng)瓶放置在顯微鏡下觀察，可見培養(yǎng)瓶中大部分細(xì)胞均己貼壁，呈不規(guī)則形狀 ，說明復(fù)蘇成功，更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。 細(xì)胞計(jì)數(shù) 實(shí)驗(yàn)原理：當(dāng)待測細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)，通過測定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。 具體操作 （ 1） 準(zhǔn)備工作 取一瓶傳代 培養(yǎng) 的細(xì)胞，按照細(xì)胞培養(yǎng)中的傳代方法繁殖細(xì)胞，待長成單層后以 備 使用。 用 95%乙醇清潔計(jì)數(shù)板和專用蓋玻片，然后用紗布 輕輕拭干。 （ 2） 制備細(xì)胞懸液 將 細(xì)胞用 胰蛋白酶液消化、 洗滌后，加入 適量 培養(yǎng)液，吹打制成待測細(xì)胞懸液 ，要求細(xì)胞密度不低于 104/ （ 3） 加樣 A蓋好蓋玻片 ：將經(jīng)過清潔的 蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)槽上。 B制備計(jì)數(shù)用的細(xì)胞懸液：用吸管吸 5 滴細(xì)胞懸液到離心管中，加入 5滴臺(tái)盼藍(lán)染液（ 或苯胺黑，活細(xì)胞不會(huì)被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。 C將細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板： 用吸管輕輕吹打細(xì)胞懸液使其均勻 ，然后吸取少量 細(xì)胞 懸液沿蓋玻片 一側(cè) 邊緣緩緩滴入 （加樣時(shí)不能溢出蓋玻 片，也不能流入旁邊槽中，加樣量不能過少，蓋玻片下不能有氣泡，否則要重新加樣） 。 （ 4） 計(jì)數(shù)細(xì)胞 統(tǒng)計(jì)四個(gè)大格的細(xì)胞數(shù) 目 ：將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察， 邊觀察邊 移動(dòng)計(jì)數(shù)板，當(dāng)鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后，數(shù)出四角的 4 個(gè)大格（每個(gè)大格含有 16 個(gè)中格）中沒有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目（只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)，只按 1 個(gè)計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)左 線，不計(jì) 右 線）。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 胃癌細(xì)胞株 控 達(dá)的研究 - 10 - （ 5）計(jì)算細(xì)胞數(shù) 計(jì)算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)： 將計(jì)數(shù)結(jié)果代入 下面公式計(jì)算細(xì)胞密度：細(xì)胞數(shù) / 4 個(gè)大格子細(xì)胞數(shù) 之和 /4） 2104 說明：公式中乘以 104是 因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為： ） ） ） 而 11000式中除以 4 是 因?yàn)橛?jì)數(shù)了 4 個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。 公式中乘以 2 是 因?yàn)榧?xì)胞懸液與染液是 1 1 稀釋。 細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn) （ 1） 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于 104 個(gè) /果細(xì)胞數(shù)目過少，需離心后再重懸細(xì)胞于少量培養(yǎng)液中。 （ 2）消化單層細(xì)胞時(shí)， 細(xì)胞要分散良好， 制成單細(xì)胞懸液， 否則會(huì)影響 細(xì)胞 計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。 （ 3） 每次取樣 計(jì) 數(shù) 前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液 。在連續(xù)取樣計(jì)數(shù)時(shí)， 更要注意每次取樣都要混勻，否則計(jì)數(shù)結(jié)果會(huì)有很大誤差。 配藥 ： (2S)-(3,5 藥物 子量為： 電子天平稱取 于 （終濃度為： 10000 ），分裝于 200L 中， 80 儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?計(jì)算腫瘤細(xì)胞存活率 實(shí)驗(yàn)原理 驗(yàn)即四唑鹽比色試驗(yàn)，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。實(shí) 驗(yàn)用四唑鹽化學(xué)名為 3-（ 4,52） 品名為噻唑蘭，簡稱 細(xì)胞線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性 原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物甲 臜 （ 并沉積在細(xì)胞中， 而死細(xì)胞無此功能。 甲 臜溶解于二甲基亞砜（ 用酶聯(lián)免疫檢測儀在 490長處測量其光吸收值， 根據(jù)測得的吸光度值（ ） ，可間接反映細(xì)胞數(shù)量。 實(shí)驗(yàn)分組 （ 1）空白對(duì)照組：不接種細(xì)胞，不加入干預(yù)藥物，只加入溶劑，作比色調(diào)零孔； （ 2）陰性對(duì)照組：接種人胃癌細(xì)胞株 加干預(yù)藥物處理； 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 胃癌細(xì)胞株 控 達(dá)的研究 - 11 - （ 3）實(shí)驗(yàn)組：加 預(yù)組， 濃度按 5 、 10 、 20 、 40 、 60 分為 5 組，分別 在 37 ， 5%胞培養(yǎng)箱 中培養(yǎng) 24、 48、 72 h。每個(gè)濃度設(shè) 3 個(gè)平行孔。 實(shí)驗(yàn)步驟 （ 1） 取處于對(duì)數(shù)生長期的 胃癌 細(xì)胞株，用 胰蛋白酶消化，用含 10%新生牛血清的 養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液。 （ 2） 用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù) 細(xì)胞 后接種于 96 孔培養(yǎng)板，用含 10%新生牛血清的養(yǎng)液重懸細(xì)胞使細(xì)胞數(shù)為 1104 個(gè) /孔加入細(xì)胞懸液200L，待細(xì)胞貼壁后加入干預(yù)藥物。 （ 3） 按照上述實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行加 預(yù) 。 （ 4） 棄去培養(yǎng)上清液換無血清培養(yǎng)基， 用加樣器 每孔加入 20L 液 ，37 繼續(xù) 孵育 4 h，終止培養(yǎng)， 小心 棄去 孔內(nèi) 培養(yǎng)上清液，每孔加入 150L 振蕩 10結(jié)晶物充分溶解。 （ 5） 在酶聯(lián)免疫檢測儀 上選擇波長 490各孔的 光吸收值 ，記錄結(jié)果。 結(jié)果分析 取每 3 個(gè)平行孔 的平均數(shù)， 計(jì)算 癌 細(xì)胞存活率。 細(xì)胞存活率 =(實(shí)驗(yàn)組 空白對(duì)照組 )/(陰性對(duì)照組空白對(duì)照組 )100% 實(shí)時(shí)熒光定量 驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)時(shí)熒光定量 術(shù)，指 的 是在 應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè) 程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。其所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料， 我們采用的是 光染料 ， 就是 在 應(yīng)體系中，加入過量 光染料， 光染料特異性地?fù)饺?鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的 料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與 物的增加完全同步。 引物設(shè)計(jì)與合成 下述 引物由 司設(shè)計(jì)，上海英駿生物技術(shù)有限公司 (司 )合成。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 胃癌細(xì)胞株 控 達(dá)的研究 - 12 - 物序列 表 1 引物序列 基因名稱及引物序列 上游引 物： 5- 3 下游引物： 5- 游引物： 53 下游引物： 53 游引物： 5下游引物： 53 引物配制 （ 1） 確定引物量 ： 即合成引物 例如其讀 數(shù) 為 。 （ 2） 配置儲(chǔ)存液 ： 將儲(chǔ)存液濃度配制為 100 ( 此時(shí)加入 理水的量為 10=。 （ 3） 配置工作液 ： 取引物儲(chǔ)存液 1 份加 9 份 理水，配制成 10 的工作液。 注意 ：在溶 理 水之前 應(yīng) 先將裝引物的 離心一下再打開 管 蓋，以 防引物丟失。 實(shí)驗(yàn)分組 劑量依賴性檢測 癌 細(xì)胞株 不作任何處理，作為對(duì)照組。 實(shí)驗(yàn)組 在 癌 細(xì)胞株 中 加入 濃度分別為： 5 、10、 20 、 40 ； 分別作用 24 h，重復(fù) 3 次 。 時(shí)間依賴性檢測 癌細(xì)胞株不作任何處理，作為對(duì)照組。 實(shí)驗(yàn)組 在 癌 細(xì)胞株中 加 入終 濃度為 20 別作用24、 48、 72 h，重復(fù) 3 次。 細(xì)胞處理 接種細(xì)胞于 單孔 細(xì)胞培養(yǎng)皿 中 ，細(xì)胞長至 60%左右時(shí)，同步化處理細(xì)胞 （ 即用無血清 養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，以使所有細(xì)胞處于同一生長期 ） ，然蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 胃癌細(xì)胞株 控 達(dá)的研究 - 13 - 后按照 上述 分組加藥處理細(xì)胞。藥物終濃度為 5 加 2L 干預(yù)藥物， 10 加 4L 干預(yù)藥物， 20 加 8L 干預(yù)藥物 , 40 加 16L 干預(yù)藥物?？傮w系： 4 提取 理 一種新型總 提試劑，試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可 迅速 裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使 蛋白質(zhì)分離，并將 放到溶液中。當(dāng)加入氯仿時(shí)，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使 入水相，離心后可形成水 相層和有機(jī)層，這樣 仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和 離開。水相層（無色）主要為 機(jī)層（黃色）主要為 蛋白質(zhì)。 操作前準(zhǔn)備 使用前， 準(zhǔn)備 75%乙醇（ 、 氯仿、異丙醇 、 P 管（ 、 無 水。 細(xì)胞中總 提取 （ 1） 將 單孔細(xì)胞培養(yǎng)皿 中的培養(yǎng)液吸入到無 體過多可同時(shí)倒入多個(gè)離心管中收集）， 1000 心 5去上清，加入1洗滌，然后 1000 離心 5去上清后用 次，吸去上清。 （ 2） 在離心管中加入 150L 震蕩器上震蕩混勻，直到肉眼看不見細(xì)胞團(tuán)為止。 （ 3） 單孔細(xì)胞培養(yǎng)皿 中用無菌 洗 2 次 ， 棄上清后加入 1移液器吹打以 使 細(xì)胞充分裂解， 室溫裂解 5然后將 液體吸入 上述離心管中 （盡量在冰上進(jìn)行整個(gè)操作） 。 （ 4） 加入氯仿 200L， 震蕩器上 劇烈振蕩 15 溫放置 3 （ 5） 12000 4 離心 15 離心機(jī)小心取出離心管，此時(shí)樣品分為 3 層，即無色的上清液 、中間的白色蛋白層及 下層的有機(jī)相， 上 清液中 。 （ 6） 小心 吸取上清液（切記不要吸取任何中間層物質(zhì)）到新的 入等體積異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，室溫放置 10 （ 7） 120004 離心 10管底部可出現(xiàn)沉淀。 （ 8） 棄上清， 加入 1 5%乙醇洗滌沉淀。 12000 4離心 5 去上清。室溫干燥 5 10 （ 9） 根據(jù) ， 加入 20 50L 分溶解 州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 胃癌細(xì)胞株 控 達(dá)的研究 - 14 - 將得到的 80 保存或用于擴(kuò)增試驗(yàn)。 本的定量分析 用核酸蛋白定量儀測出 濃度及純度） ， 80 在 若比值小于 明有殘余蛋白質(zhì)，則該份 合成 劑盒組成成分 試劑盒組成成分見表 2（ 10 L 反應(yīng) 200 次）： 表 2 T 00 L T 100 L 50 M） 100 L 100 M） 400 L 反轉(zhuǎn)錄 （ 1） 冰上配制 應(yīng)液（見表 3）： 表 3 應(yīng)液體系 試劑 使用量 (L) 5 4 12 20 （ 2）每 10L 反轉(zhuǎn)錄體系加入的 量不超過 500 轉(zhuǎn)錄前應(yīng)按照測得的 適度適當(dāng)稀釋 品。 （ 3） 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件： 37 15 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)） 85 5 轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)） （ 4） 將反 轉(zhuǎn)率得到的 80 保存?zhèn)溆?，或者直接進(jìn)入下一步擴(kuò)增。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 胃癌細(xì)胞株 控 達(dá)的研究 - 15 - 實(shí)時(shí)熒光定量 應(yīng) 冰上 配制 應(yīng)液 ， 見表 4 表 4 應(yīng)液體系 試劑 使用量 (L) 終濃度 x T 反應(yīng)液（ 液） 2 菌蒸餾水） 5 應(yīng)條件 95 10 1 5 5 62 30 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 （ 1） 反應(yīng)結(jié)束后分析 熔解 曲線，由 熔解 曲線判定擴(kuò)增產(chǎn)物是否單一，確認(rèn)產(chǎn)物的特異性。 （ 2） 數(shù)據(jù)分析： 法 目前 ， 采用實(shí)時(shí)熒光定量 對(duì)定量 ， 國際上通用的比較目的基因在不同組織中表達(dá)差異的方法是 2 原理： 與樣品中起始模板的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)成線性反比關(guān)系（ 含義是 需要的循環(huán)數(shù)）。每個(gè)標(biāo)本重復(fù) 2 次，取平均值為 。首先，將目的基因 ( 用內(nèi)源性表達(dá)的基因 (進(jìn)行歸一化 ( T 分別獲得實(shí)驗(yàn)樣品 (對(duì)照樣品 ( ， 即 CT CT CT CT 然后，計(jì)算實(shí)驗(yàn)樣品與對(duì)照樣品的 值，即 CT CT 最后 ， 計(jì)算樣品 中 目的基因的相對(duì)表達(dá)率 (， 2 未做任何處理的 癌 細(xì)胞中各指標(biāo) (基因表達(dá)量為 1， 2 40 州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 胃癌細(xì)胞株 控 達(dá)的研究 - 16 - 驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)原理 用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)， “ 探針 ”是抗體，用標(biāo)記的二抗 “ 顯色 ” 。經(jīng)過 離的蛋白質(zhì) 樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（硝酸纖維素膜 ）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。 實(shí)驗(yàn)分組 量依賴性檢測： 入 終 濃度分別為： 5 、 10 、 20 、 40 。 胞 不做任何處理，作為對(duì)照組。 分別作用 24 h，重復(fù) 3 次。 間依賴性檢測： 入 度為 20 。 做任何處理，作為對(duì)照組。 分別作用 24、 48、 72 h，重復(fù) 3 次。 具體操作 胞處理 將人胃癌細(xì)胞株 種于單孔培養(yǎng)皿中 待細(xì)胞長至 60% 左右時(shí)，同步化處理細(xì)胞 （ 即用無血清 養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng) 24h，以使所有細(xì)胞處于同一生長期 ）， 然后按照以上分組加 藥處理細(xì)胞。藥物終濃度為 5 加干預(yù)藥物 2L， 10 加干預(yù)藥物 4L， 20 加干預(yù)藥物 8L, 40 加干預(yù)藥物 16L?？傮w系： 4 白樣品的制備 （ 1） 將培養(yǎng)液 吸 入無菌的離心管（因?yàn)榧尤胨幬锖髸?huì)影響細(xì)胞的貼壁，一些活細(xì)胞可能會(huì)脫落入培養(yǎng)液中，所以同時(shí)需要收集培養(yǎng)液中細(xì)胞），然后將培養(yǎng) 皿中的培養(yǎng)液吸干凈 。 （ 2） 每 個(gè)培養(yǎng)皿 加 3 預(yù)冷的 平放輕輕搖動(dòng)洗滌細(xì)胞，然后棄去 復(fù)以上操作 2次，