無脊椎動物免疫功能性物質概述

1、無脊椎動物免疫功能性物質概述專業(yè):動物學 姓名：李波 學號：S無脊椎動物免疫脊椎動物在長期進化過程中形成了巧妙而又復雜的免疫系統(tǒng)，其免疫機制中既有先天性免疫(innate immunity)又有獲得性免疫(acquired immunity)，而無脊椎動物缺乏真正的抗體，因此目前認為無脊椎動物僅具有先天性免疫功能，而且，無脊椎動物對病原體的防御是非特異性的。無脊椎動物的免疫反應主要通過物理屏障、吞噬作用、溶菌作用和凝集作用等清除病原菌的侵入和外來異物。因此，缺乏免疫球蛋白的無脊椎動物主要是通過吞噬細胞和非特異性免疫因子來發(fā)揮免疫功能的，即細胞免疫和體液免疫，且二者密切相關。1細胞免疫無脊椎動物

2、重要的機體防御機能主要由免疫細胞通過吞噬、包被以及形成結節(jié)來實現的，亦由固著性細胞產生的吞噬作用和胞飲作用來實現的。病原或異物突破機體的防御屏障進入機體后被快速濾入具有濾過作用的組織和器官，在這些部位病原的清除和殺滅由血清和血細胞共同作用來完成，參與吞噬殺菌過程的主要是吞噬細胞，包括血淋巴中的血細胞和淋巴器官中的淋巴細胞。當病原體穿透體表物理屏障進入到甲殼動物的血淋巴后，會引發(fā)一系列的細胞防御反應，主要包括吞噬作用（phagocytosis）、結節(jié)形成（nodule formation）、包囊作用（encapsulation）和凝集反應（aggregation）等。吞噬作用是免疫細胞攝取入侵顆

3、粒，并利用胞內產生的活性氧將其殺死的過程。如果侵入體內的病原體數量太多或顆粒太大而不能被吞噬，大量的血細胞會協同作用來封鎖病原體，這種現象分別被稱作結節(jié)形成和包囊作用。血細胞還參與蛋白酶原、凝集酶原以及酚氧化酶原等的相關物質的合成與儲存。吞噬作用在動物界中普遍存在，低等的單細胞動物通過吞噬作用攝取食物，在高等的多細胞動物中，吞噬作用則是控制和清除外來物質侵擾的重要手段。目前已證實甲殼動物的血細胞的確能夠吞噬入侵體內的細菌、真菌、洋紅顆粒、松脂等，其吞噬過程包括：異物識別、粘連、凝集、攝入、清除等。對異物的識別可能是由該物質的表面性質和血細胞膜上的受體共同決定的。 包囊作用是針對單個細胞無法吞入

4、的較大異物發(fā)生的反應。甲殼動物機體首先將外來物質隔離，若異物顆粒直接超過10m（如某些真菌、寄生蟲等），則不能通過單個細胞的吞噬作用攝入，而是在其周圍包被數層成纖維細胞而形成包囊，構成包囊的細胞之間形成致密的纖維狀連接，可以起到防止被包圍的入侵物逃逸的作用。甲殼動物的血細胞內含有細胞黏附蛋白，能夠將細胞和外來異物結合形成緊密凝集狀的結節(jié)，這些結節(jié)就是黏附了外來入侵物的血細胞的聚集體，并且通常在酚氧化酶的作用下發(fā)生黑化反應。研究表明，當把外來物注射到動物體內時，循環(huán)系統(tǒng)中血細胞數目會顯著下降，血細胞發(fā)生凝集反應，嚴重時能阻塞鰓絲的維管結構。2體液免疫無脊椎動物缺乏免疫球蛋白，體液免疫是靠血淋巴中

5、的一些非特異性的酶或因子來進行的。（1）酚氧化酶酚氧化酶（Phenoloxidase,PO）又稱為酪氨酸酶，能夠催化單酚羥化成二酚（如多巴），并把二酚氧化成醌；醌在非酶促條件下形成最終的反應產物黑色素。這些黑色素協同具有細胞毒性的醌類中間產物沉積到入侵的病原體周圍，起到隔離殺死病原體的作用，即所謂的黑化包被反應。目前，己從數種無脊椎動物中分離純化出proPO和PO，并對此作了鑒定。依據物種的不同，它們的最適pH值、最適反應溫度、抑制劑等性質有所不同。在甲殼動物中proPO一般為單體蛋白，分子量一般在70-80 kD左右，被激活后所產生的PO的分子量一般約為60-70 kD。（1 kD=1/N

6、g）無脊椎動物的酚氧化酶大多為一種銅金屬酶。目前分子生物學研究也發(fā)現，proPO及PO一般都有兩個功能性的Cu2+結合位點，CuA和CuB。每個銅原子周圍的氨基酸殘基高度保守，而且CuA和CuB分別結合了三個組氨酸。CuB結構在各種動物中比較一致：兩個組氨酸位于一個-螺旋上，而另一個組氨酸則位于另一個-螺旋上。CuA結構在不同物種間可能有所差異，在節(jié)肢動物中，CuA結構與CuB的結構相同；而在軟體動物中，兩個組氨酸分別位于兩個-螺旋上，而另一個組氨酸則位于其中一個-螺旋之后的回環(huán)結構中。在無脊椎動物中，PO一般以無活性的酶原形式酚氧化酶（Prophenoloxidase,proPO）存在，無活

7、性的proPO在絲氨酸蛋白酶作用下轉變成具有活性的PO。血細胞以脫顆粒的方式釋放proPO到血淋巴中，隨后無活性的proPO被酚氧化酶原激活酶（prophenoloxidase activating enzyme/prophenoloxidase-activating proteinase,PPA/PAP）激活轉變成有活性的酚氧化酶（PO）。在PO的催化下，酚被氧化成醌，再經一系列生化反應，最終形成黑色素。黑色素能夠隔離病原體，避免它們與宿主接觸，從而達到免疫效果，黑色素常常在節(jié)肢動物的體表形成黑色斑點，形成的色素沉著對機體起到保護作用。酚氧化酶原激活系統(tǒng)（prophenoloxidase-a

8、ctivatedsystem，proPO-AS）是由proPO、PO、絲氨酸蛋白酶、模式識別蛋白和蛋白酶抑制劑構成的一個復雜的級聯反應系統(tǒng)，這一過程類似于高等動物中的補體激活途徑（補體并非單一分子，而是存在于血清、組織液和細胞膜表面的的一組不耐熱的經活化后具有酶活性的蛋白質，包括30余種可溶性蛋白和膜結合蛋白，故被稱為補體系統(tǒng)。補體廣泛參與機體微生物防御反應以及免疫調節(jié)，也可介導免疫病理的損傷性反應，是體內具有重要生物學作用的效應系統(tǒng)和效應放大系統(tǒng)）。酚氧化酶在無脊椎動物非特性免疫中的功能在較高等的無脊椎動物如節(jié)肢動物中，酚氧化酶（PO）具有多種功能，它不僅參與黑色素形成、角質的硬化和傷口愈合

9、，而且在宿主的防御反應中還作為非自身識別系統(tǒng)發(fā)揮功能。PO是黑色素形成的關鍵酶，PO在傷口處催化產生黑色素沉淀以防止血淋巴丟失，并阻止入侵的微生物乘機進入，黑色素通過愈合傷口和封閉病原菌，在節(jié)肢動物的防御反應起重要作用。黑色素形成過程中伴隨著活性氧的產生，同時也產生具細胞毒性的半醌和三氫酚。半醌有結合親核物質的特性，醌具毒性的分子基礎可能是它們結合到外來細胞的表面，通過形成黑色素包囊來隔離入侵的外來物，并通過醌和其它的中間產物(如醌甲基化物和半醌)產生氧的還原形式來摧毀這些入侵的外來物如病原菌或寄生蟲。甲殼動物中有活性的PO參與宿主的防御反應在識別異物、釋放調理素(opsonin)、促進血細胞

10、的吞噬和包囊反應以及促進顆粒血細胞和半顆粒血細胞釋放顆粒、產生多種介導凝集因子及抗菌肽等免疫功能方面發(fā)揮著重要的作用。（2）凝集素動物的凝集素分子按照糖識別域肽鏈序列分有三類：C型凝集素，S型凝集素，P型凝集素以及一些目前尚未確切歸類的凝集素。C-型凝集素因其活性需鈣離子而得名，均位于細胞外；S-型凝集素因其活性的完全表達通常依賴巰基而命名；P-型因其主要配體為甘露糖-6-磷酸鹽（mannose-6-phosphate）而命名。其中最主要的凝集素分子為C型凝集素和S型凝集素。S型凝集素在細胞內和細胞外均有分布，在它們的空間結構中不存在二硫鍵，主要識別半乳糖分子。C型凝集素是一個龐大的膜蛋白和細

11、胞外蛋白的超家族。這個家族的共同特點都擁有一個二硫鍵豐富，且與鈣離子結合的CRD結構域。絕大多數動物凝集素分子都是僅通過活性鑒定和糖基識別特異性加以歸類的，而很少考慮其生物學活性和進化分類的。越來越多的證據表明C型凝集素在免疫系統(tǒng)中起了關鍵作用。C-型凝集素的的結構特征C-型凝集素是最早被發(fā)現的動物凝集素。早在19世紀，蛇毒凝集素的凝集效應就已經被發(fā)現。1906年發(fā)現的牛Conglutinin是屬于Collectin家族成員。1988年，Drickamer建議將動物凝集素分成若干家族，結構上類似于唾液酸蛋白受體的鈣離子依賴型凝集素被歸于C-型凝集素家族。自此，C-型凝集素家族成員數量快速增長，

12、大量C-型凝集素被從不同的動物中發(fā)現，而其中許多已被證實不具備凝集活性。狹義上的C-型凝集素是指一類鈣離子依賴型的糖識別動物凝集素。在隨后的生物化學和基因序列結構分析發(fā)現，此類蛋白的凝集活性均來自于一類統(tǒng)一的結構：糖識別結構域（Carbohydrate recognition domain，CRD）。所有的C-型凝集素均包含該結構域，而其他類型的凝集素則沒有。對不同種類的C-型凝集素結構域研究發(fā)現，結構域上存在4類鈣離子結合位點。如圖所示，位點1，2，3出現于結構域頂部，而位點4則出現在結構域底部。鈣離子結合位點的形成會受到如序列、結晶條件等多方面的影響。C-型凝集素具有結構異質性和異物結合位

13、點的特異性，對熱不穩(wěn)定(56C 15min即可失活)，其活性需Ca激活；凝集素功能 當外來入侵物(細菌、病毒等)通過某種機制刺激血細胞合成并釋放凝集素，使外來入侵物發(fā)生凝集并失去活性，然后血細胞對其進行吞噬；免疫識別因子在其它方面包括細胞的遷移，細胞間相互作用等扮演重要角色。（3）血藍蛋白血藍蛋白(hemocyanin，HC)是位于節(jié)肢動物和軟體動物血淋巴中的含銅呼吸蛋白，脫氧狀態(tài)為無色，結合氧狀態(tài)為藍色。血藍蛋白的主要生物學功能與機體內的輸氧有關，它與血紅蛋白(hemoglobins)和蚯蚓血紅蛋白(hemerythreins)并稱為動物界三種呼吸蛋白。血藍蛋白最早是以一種類酚氧化酶的酶的形

14、式出現的，然后出現了不同的血藍蛋白亞基，最后變成兩種功能截然不同的含銅蛋白。血藍蛋白可分為兩大類，即節(jié)肢動物的血藍蛋白和軟體動物的血藍蛋白。節(jié)肢動物血藍蛋白由分子量大約是72kDa的亞基組成。盡管觀察到這些亞基有明顯的異質性，但是所有節(jié)肢動物的Hc亞基可能都含有一個序列完全相同的三維結構（圖1.10B）。每個亞基折疊成三個域（domain）。其中第二個域是螺旋區(qū)，螯合一對Cu離子，可結合一個O2。每個銅離子受三個組氨酸殘基的調節(jié)，并處于4個螺旋的中央（圖1.9 B）。在體內，節(jié)肢動物Hc由不同倍數的六聚體組成（16，26，46，66，86-mer），根據物種的不同而不同。節(jié)肢動物類型的Hc的四

15、級結構如圖1.10A所示。軟體動物的血藍蛋白軟體動物HC的分布不如節(jié)肢動物的那樣廣泛，似乎僅限于腹足類和頭足類。近來，德國Markl研究組在1.2 nm水平上用冷凍電鏡術(cryoelectron microscopy)觀察了鮑魚Holiotis tuberculata的HC，獲得了其20聚體組成的中凹的圓柱體四級結構（圖1.11A）。用X光晶體衍射法已在頭足類的章魚中獲得了軟體動物HC的三維結構構象(圖1.11B)。由圖1.11A，軟體動物HC的亞單位很大，相對分子質量可達 Da，每個亞單位由78個在大小上約為50000 Da的相似的功能單位(FU)組成，分別命名為ah。軟體動物Hc的三維構

16、象則由2個域組成，第1域為螺旋區(qū)，螯合一對Cu離子，可結合一個O2分子，第2域為折疊塊，可能也含有Ca，此金屬可能與四級結構的維持有關。血藍蛋白功能 其主要功能是氧的載體,此外還具有調節(jié)滲透壓、儲存蛋白質、脫皮激素轉運和產生抗真菌肽等。而且,在胰島素、SDS和肌體內凝集因子、抗菌肽等生物防御因子的作用下,能轉化為酚氧化酶。在節(jié)肢動物和軟體動物中已有報道血藍蛋白有酚氧化酶活性。（4）抗菌肽動物體中具有抗菌活性的多肽被定義為抗菌肽(antimicrobialpeptides)，是動物體先天反應中的重要部分，抗菌肽具有廣譜的抗菌活力?？咕?anti一microbialpeptides)是具有抗菌活

17、性短肽的總稱。它是在誘導條件下，動物免疫防疫系統(tǒng)產生的一類對抗外源性病原體致病作用的防御性肽類活性物質。作為免疫防御系統(tǒng)的一個重要組成部分，原核生物、植物、動物(包括脊椎動物和無脊椎動物)都可以產生由基因編碼、核糖體合成的抗菌肽。許多抗菌肽相繼得以分離和純化。這些抗菌肽的共同特征為:堿性多肽;N端多堿性氨基酸殘基;C端均酞胺化;具有兩性結構;分子量為4kDa左右?？咕氖囚~、蝦、貝等水生動物抗病防御系統(tǒng)的主要成分之一。一般根據抗菌肽分子的氨基酸序列，二級結構以及其功能不同，可將抗菌肽分為三大類。第一類為環(huán)型抗菌肽，因其富含半胱氨酸形成分子內二硫橋，而呈發(fā)夾式口片層結構(hairpinlikes

18、heet)或者形成a螺旋與p片層結構的混合構造(apm0tifCsap)。第二類也是最早發(fā)現的一類抗菌肽，具有a一螺旋結構的兩親線性多肽。第三類為富含脯氨酸或和甘氨酸線性多肽，有時它們可占氨基酸組成的25以上，富含脯氨酸抗菌肽一般呈二聯體或者三聯體。目前普遍認為，抗菌肽可以與病原體的細胞膜作用，增加膜的滲透性，從而導致病原體的死亡。線形親水脂的a一螺旋分子，主要通過陽離子與細胞膜上的陰離子相互作用，從而破壞細胞膜的完整性。富含半胱氨酸的分子，如防御素(Defensins)，則是在磷脂膜上通過形成離子通道增加細胞膜的通透性。另外的一些分子還可能進入細胞內，直接與DNA、RNA作用，導致細胞死亡。

19、抗菌肽功能 抗菌肽作用于細胞膜上形成孔道，使細胞內容物特別是鉀離子大量滲出，正常細胞膜去極化導致細胞的死亡；誘導降解細胞壁的水解酶激活細胞致死的過程；擾亂細胞膜雙層結構脂類分子的正常分布，而干擾細胞膜的功能；或損傷細胞內的重要的靶分子等。目前已知抗菌肽對100多種細菌以及某些真菌、原生動物、病毒等有殺滅或抑制作用。（5）溶菌酶溶菌酶分為c型溶菌酶（HEWL)、g型溶菌酶（GEWL）、i型溶菌酶（TjL）三種。目前的結論是i型溶菌酶廣泛分布并且只分布于無脊椎動物中。盡管這三種類型的溶菌酶的一級序列之間的相似性非常低，它們的三維結構卻展現了驚人的相似性(圖1.8)。HEWL是第一個解出三級結構的溶

20、菌酶。它包括兩個結構域和中間一個很深的裂縫，裂縫包含了其活性位點。一個結構域主要是由折疊組成，而另一個則包含了更多的螺旋結構。而與之類似的是，GWEL的三級結構也是由一個包含了活性位點的裂縫將一個較小的折疊組成的結構和一個較大的“螺旋組成的結構域分開。而且，TjL的三級結構與HEWL相比也是驚人的相似。TjL包括6個螺旋，一個折疊和一個結合底物的裂縫。溶菌酶(Lysozyme)又稱胞壁質酶(Muramidase),它是一種堿性蛋白,主要殺滅革蘭陽性菌,能夠水解構成細菌細胞壁成分的多糖胞壁質中的N2乙酰葡萄糖胺與N2乙酰胞壁酸之間的1,4糖苷鍵,從而使細菌的細胞壁破損,細胞崩解。在作用時可觀察到

21、溶菌現象,故因此而得名。溶菌酶廣泛存在于各種動物的血細胞和血液中,在免疫活動中發(fā)揮著重要的作用。溶菌酶是吞噬細胞殺菌的物質基礎,當吞噬細胞對異物顆粒進行吞噬和包囊后,細胞內的溶酶體會與異物進行融合,發(fā)生脫顆?，F象,外來入侵的微生物可以被其中的溶菌酶等直接殺死,隨后再進一步將它們水解消化,并將水解消化后的殘渣排出細胞外。（6）蛋白酶抑制劑目前已在甲殼動物的血淋巴中發(fā)現了多種蛋白酶抑制劑，其中比較重要的有兩種即枯草桿菌蛋白酶抑制劑和a一巨球蛋白?？莶輻U菌蛋白酶抑制劑 枯草桿菌蛋白酶抑制劑是一種熱穩(wěn)定的(可抵抗80高溫15min)、耐酸堿性(pH范圍為10兒5)的蛋白質，分子量為23kD，等電點pI

22、為47。純化的枯草桿菌蛋白酶抑制劑能抑制枯草桿菌蛋白酶和鏈霉蛋白酶，以及某些寄生菌(如Aastaci)分泌的蛋白酶，而對胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶無抑制作用?？莶輻U菌蛋白酶抑制劑只能抑制病原菌分泌的蛋白酶，而對非病原菌分泌的蛋白酶以及本身的蛋白酶無影響。蛋白酶抑制劑，是作為表皮中抵抗微生物感染的有力屏障。a一巨球蛋白 a一巨球蛋白是動物血漿中一種高分子量的蛋白酶抑制劑，單體分子量為180185kD，其多肽鏈中的硫醇區(qū)具有高度保守性，在親緣關系較遠的生物如螫蝦、馬蹄蟹、人類等都幾乎相同。甲殼動物血淋巴中的a一M具有同哺乳動物相同的特性和功能。a一M的主要作用是清除循環(huán)系統(tǒng)中的蛋白酶：由于受傷或細菌入侵而產生的蛋白酶對機體內正常的組織或器官是有害的，血漿中的a一M構象改變，使硫醇區(qū)的穩(wěn)定性降低，與有害的蛋白酶非共偷結合形成蛋白酶復合物；在細胞的表面具有M受體，能同蛋白酶復合物發(fā)生特異性的結臺，然后通過某種機制將蛋白酶復合物迅速從循環(huán)系統(tǒng)中清除。（7）溶血素溶血素是一種非特異性的免疫防治因子，它存在于多種無脊椎動物血清中。其作用可能類似于脊椎動物的補體系統(tǒng)，可溶解破壞異物細胞，參與調理作用，而且還