現(xiàn)代科技綜述知識(shí)文庫(kù)：β－內(nèi)酰胺酰化酶的分子生物學(xué)

1、現(xiàn)代科技綜述系列內(nèi)酰胺?；傅姆肿由飳W(xué)科技是人類(lèi)區(qū)別于動(dòng)物的重要文明之一，是人類(lèi)對(duì)自然規(guī)律研究和利用的學(xué)科。本文提供對(duì)科技基本概念“內(nèi)酰胺?；傅姆肿由飳W(xué)”的解讀，以供大家了解。內(nèi)酰胺?；傅姆肿由飳W(xué)1929年Fleming發(fā)現(xiàn)了青霉素，40年代初青霉素開(kāi)始應(yīng)用于臨床，對(duì)人類(lèi)的健康作出了巨大的貢獻(xiàn)。近50年來(lái)，人們?cè)噲D找到比青霉素更好的抗生素從而推動(dòng)抗生素的研究與生產(chǎn)。目前，雖然從自然界已發(fā)現(xiàn)近8000種抗生素，但是，青霉素等內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素仍不愧為抗生素中的佼佼者，它在整個(gè)抗生素工業(yè)總產(chǎn)值中占70%。不過(guò)，隨著青霉素長(zhǎng)期、大量地廣泛應(yīng)用，臨床出現(xiàn)了病原菌耐藥性的問(wèn)題。因此，在內(nèi)酰胺類(lèi)抗生

2、素構(gòu)效關(guān)系研究的基礎(chǔ)上，采取在天然母核上接不同的酰基側(cè)鏈的方法。制出殺菌能力強(qiáng)、殺菌譜廣、毒性低和耐酸性強(qiáng)的半合成內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素已達(dá)3000多種，投放市場(chǎng)的也有近百種。半合成內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的研究與開(kāi)發(fā)已成為當(dāng)今抗生素工業(yè)中一個(gè)十分活躍的領(lǐng)域。青霉素?；?Penicillin Acylase，penicillin Amidase，EC3，5111)水解青霉素產(chǎn)生酰基側(cè)鏈酸和6氨基青霉烷酸(6ApA)，它是6ApA生產(chǎn)中的重要工業(yè)用酶。根據(jù)酶底物專(zhuān)一性的不同，可分為青霉素V酰化酶、青霉素G酰化酶和氨芐青霉素?；?。其中研究較多、應(yīng)用較廣的是大腸桿菌青霉素G?；福撁妇哂休^廣泛的底物專(zhuān)一性，水解

3、反應(yīng)最適H+濃度109107molL，在較高的H+濃度條件下可進(jìn)行合成反應(yīng)，苯乙酸為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，6ApA為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。在發(fā)酵過(guò)程中酶的形成需要苯乙酸的誘導(dǎo)，產(chǎn)酶適宜溫度在28以下，溫度高于37C時(shí)很少有酶的產(chǎn)生。此外，巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、嗜檸檬酸克魯氏酵母(kluyvera Citrophila)、雷氏變形桿菌(proteus Retteqeri)、球形芽孢桿菌(Bacillus Sphaericus)、粘稠節(jié)桿菌(Arthiobacter viscosus)和假單孢菌(Psemdomonas spStrain G16)等青霉素?；难芯恳灿胁簧賵?bào)道。

4、國(guó)內(nèi)外一些實(shí)驗(yàn)室都先后開(kāi)展了大腸桿菌青霉素G酰化酶的基因克隆與表達(dá)的研究。Mayer等于1979年首先由大腸桿菌ATCC11105菌株克隆了青霉素G酰化酶基因，構(gòu)建了5K(PHM12)高產(chǎn)工程菌。之后，Brus等和Oliver等發(fā)表了大腸桿菌青霉素G酰化酶的部分核苷酸序列。不久，Shumachaetr、Oh和郭禮和等3家實(shí)驗(yàn)室先后報(bào)道了3個(gè)不同大腸桿菌菌株青霉素G酰化酶結(jié)構(gòu)基因的核苷酸全序列，他們得到的結(jié)果證明，大腸桿菌青霉素G?；傅慕Y(jié)構(gòu)基因是由4個(gè)功能DNA片段組成：(1)編碼26個(gè)氨基酸殘基先導(dǎo)肽(leader peptide)的78bP；(2)編碼209個(gè)氨基酸殘基的亞基的627bp；

5、(3)編碼54個(gè)氨基酸殘基的間隔肽(Spacer peptide)的162bp；(4)編碼557個(gè)氨基酸殘基的1671bp。此外，調(diào)節(jié)片段包括5端的兩個(gè)環(huán)化受體蛋白的結(jié)合位點(diǎn)(cyclic AMPreceptor protein，CRP)、一個(gè)啟動(dòng)子(35和10六聚核苷酸)和核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)以及3端的終止信號(hào)(Terminator)。青霉素G?；富虮磉_(dá)的初級(jí)產(chǎn)物為94000的前體肽，它像許多真核生物激素一樣，需要經(jīng)過(guò)多步蛋白質(zhì)加工，最后形成一個(gè)具有催化活性的酶分子。首先，先導(dǎo)肽被切掉，它使蛋白的分子輸送到細(xì)菌細(xì)胞圍膜空隙(Periplasmic Space)中；間隔肽切出后，產(chǎn)生和

6、亞基。據(jù)推測(cè)，在間隔肽的誘導(dǎo)下，兩個(gè)亞基肽鏈折疊成特定的空間構(gòu)象，此時(shí)，才成為有活性的酶分子，定位于圍膜空隙。這種轉(zhuǎn)譯后的蛋白加工在原核生物中實(shí)屬少見(jiàn)。實(shí)驗(yàn)證明，加工時(shí)大腸桿菌青霉素G?；盖绑w肽對(duì)溫度是敏感的。半合成頭孢霉素比半合成青霉素具有抗菌譜廣、毒副作用小、耐酸、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，因而它倍受重視。從20世紀(jì)60年代出現(xiàn)第1代半合成頭孢霉素以來(lái)，發(fā)展到80年代已出現(xiàn)第4代半合成頭孢霉素。7氨基頭孢烷酸(7ACA)是半合成頭孢霉素不可缺少的中間體。7ACA生產(chǎn)的傳統(tǒng)工藝是化學(xué)裂解，其主要缺點(diǎn)是反應(yīng)專(zhuān)一性差，產(chǎn)率低，副產(chǎn)物污染環(huán)境等。之后，便出現(xiàn)了酶促與化學(xué)處理相結(jié)合的“二步法”。但是，

7、該工藝仍然存在操作步驟多、產(chǎn)率不高的問(wèn)題。因此，人們?cè)噲D通過(guò)DNA重組技術(shù)來(lái)改變這種狀況。Isogai等人利用Fusarium Solani的編碼D氨基酸氧化酶(DAD)cDNA與Pseudmonas diminuta的編碼戊二酰頭孢霉素?；?G17ACA acylase)的基因片段，成功地構(gòu)建了一個(gè)合成7ACA的雜合操縱子(Hybride operon)，在Acremonium chrysogenum的鹼性蛋白酶調(diào)控元件的控制下實(shí)現(xiàn)表達(dá)，盡管含有該雜合操縱子的頭孢霉素高產(chǎn)菌株AChrysogenum BC2116的轉(zhuǎn)化子只產(chǎn)生很少的7ACA，暫時(shí)還沒(méi)有什么商業(yè)意義，然而細(xì)菌和真菌兩種不同的

8、基因結(jié)合在一起引入工業(yè)微生物中，必竟是一次有意義的嘗試。為了直接將頭孢霉C(CpC)轉(zhuǎn)化為7ACA，1987年，Matsuda等由pseudomonas SE83菌株克隆到分別編碼為GL7ACA?；?acyI)和CpC酰化酶(Acy)兩個(gè)不同的基因，二者分別定位在25Kb和28Kb的DNA片段上，并完成它們的核苷酸的全序列測(cè)定，每個(gè)DNA核苷酸序列各有一個(gè)讀框，編碼兩個(gè)大小不同的蛋白質(zhì)亞基，其分子量為26000和57000。像大腸桿菌青霉素G?；敢粯樱^孢霉素?；虻谋磉_(dá)初級(jí)產(chǎn)物也為一個(gè)前體多肽，經(jīng)特殊蛋白加工后形成具有活性的酶分子。acy基因表達(dá)產(chǎn)物雖能水解CpC產(chǎn)生7ACA，但是產(chǎn)率

9、極低。鑒于pseudomonas S E83 CpC酰化酶與大腸桿菌青霉素G?；傅陌被嵊休^高的同源性，而青霉素G酶?；休^廣泛的底物專(zhuān)一性，它也能作用于某些半合成頭孢霉素，這就暗示有可能通過(guò)基因定點(diǎn)誘變，改變大腸桿菌青霉素G?；傅牡孜飳?zhuān)一性，開(kāi)發(fā)出更有效的CpC?；?。在這方面，Williams等邁出了第一步，他們通過(guò)定點(diǎn)誘變，獲得了若干個(gè)突變體，結(jié)果證明，亞基Met168與底物結(jié)合有關(guān)，對(duì)酶的底物專(zhuān)一性起著關(guān)鍵性作用。王敏等通過(guò)盒式定位誘變，得到了Ala177、Thr177、Gly177、Arg177和leu177等5個(gè)突變體，均失去了酶活性，即使在結(jié)構(gòu)上與Ser相似的The也不能取代

10、q亞基上的第177位Ser，說(shuō)明這個(gè)位置上的Ser是酶催化活性不可缺少的。在酶的結(jié)構(gòu)與功能研究方面，Hunt等人已獲得可供衍射的單晶，隨著青霉素G?；傅木w結(jié)構(gòu)被揭示，將為酶蛋白分子設(shè)計(jì)提供依據(jù)，青霉素G?；傅牡鞍踪|(zhì)工程研究將會(huì)達(dá)到一個(gè)新的水平，從而進(jìn)一步推動(dòng)半合成頭孢霉素工業(yè)的發(fā)展?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】： 1 Vandamme E J. Penicillin acylase and beta -lactamase. Economic microbiol,1976,5:468 522 2 Mayer H.Collins J,Wagner F. Cloning of the penicillin G

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