分子生物學：第五章 原核基因的表達與調控

1、第五章原核生物基因的表達與調控,Expression and regulation of genes in prokaryotes,本章內容,第一節(jié) 原核基因表達調控概論 第二節(jié) 乳糖操縱元與負控誘導系統(tǒng) 第三節(jié) 色氨酸操縱元與負控阻遏系統(tǒng) 第四節(jié) 其它操縱元及其調控機制 第五節(jié) 轉錄水平的其他調控方式 第六節(jié) 原核生物的轉錄后調控,第一節(jié) 原核生物基因表達調控概論,一、原核基因表達調控的環(huán)節(jié) 二、操縱子學說 三、原核基因表達調控的類型與特點 四、弱化子對基因活性的影響 五、降解物對基因活性的調節(jié) 六、細菌的應急反應,基因表達 （Gene expression）： DNA 到蛋白質的過程 基因

2、表達調控（Regulation of gene expression）： 對基因表達過程的調節(jié),基因表達的調控系統(tǒng)： 不同生物可使用不同信號和機理來調控基因表達 原核生物: 營養(yǎng)狀況，nutritional status 環(huán)境因素，environmental factor 真核生物： 激素水平，hormone level 發(fā)育時期，developmental stage 基因表達方式： 組成型或永久型表達，constitutive expression 誘導型或適應型表達，induced or adaptive expression,原核與真核生物轉錄及翻譯調控的比較,細菌: 轉錄與翻譯過程幾

3、乎發(fā)生在同一時間間隔內，轉錄與翻譯偶聯(lián) 真核生物：轉錄產(chǎn)物需從核內運轉到核外，才能被核糖體翻譯成蛋白質,一、原核基因表達調控的環(huán)節(jié),基于調控發(fā)生的時期,原核生物中的轉錄和翻譯水平的調控均以操縱子的方式進行,二、操縱子學說（ operon ） ,操縱子學說：原核生物基因結構及其表達調控理論，基因表達調控的基礎 法國巴斯德研究所 Jacob 和 Monod 1961 年提出，在 10 年內經(jīng)許多科學家的補充和修正得以逐步完善,Franois Jacob 1920 年,Jacques Monod 1910 年 1976 年,1、操縱子的提出,大腸桿菌可以利用葡萄糖、乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖等作為碳源而

4、生長繁殖 當培養(yǎng)基中含有葡萄糖和乳糖時，細菌優(yōu)先使用葡萄糖 當葡萄糖耗盡，細菌停止生長，經(jīng)過短時間適應，就能利用乳糖，細菌繼續(xù)呈指數(shù)式繁殖增長,法國的Jocob和Monod等人做了一系列遺傳學和生化學研究實驗，于1961年提出乳糖操縱子學說,2、操縱子的定義 ,操縱子：是基因表達的協(xié)調單位，由啟動子、操縱基因及其所控制的一組功能上相關的結構基因所組成。 操縱基因受調節(jié)基因產(chǎn)物的控制。,一個操縱子 = 編碼序列（2-6）+ 啟動序列 + 操縱序列 + (其他調節(jié)序列),3、操縱子（operon）的基本組成,操縱子的基本結構,轉錄出多順反子mRNA， 翻譯后得到多種蛋白質,介導轉錄終止,編碼功能相

5、關的蛋白質,調控區(qū) 結合RNA聚合 酶和調節(jié)蛋白,（1）啟動子（promoter, P）,能被RNA聚合酶識別、結合并啟動基因轉錄的一段DNA序列 操縱子至少有一個啟動子，一般在第一個結構基因5上游，控制整個結構基因群的轉錄 不同的啟動子序列有所不同，但存在共有性序列(consensus sequences),不同的啟動子序列不同，與RNA聚合酶的親和力不同、啟動轉錄的頻率高低不同 不同的啟動子啟動基因轉錄的強弱不同 例如：PL、PR、PT7屬強啟動子，而Plac則是較弱的啟動子,（2）終止子（terminator，T）,給予RNA聚合酶轉錄終止信號的DNA序列 在一個操縱子中至少在結構基因群

6、最后一個基因的后面有一個終止子,強終止子和弱終止子 一串結構基因群中間有弱終止子的存在，則前后轉錄產(chǎn)物的量會有所不同，這也是終止子調節(jié)基因群中不同基因表達產(chǎn)物比例的一種方式 抗終止作用：有的蛋白因子能作用于終止序列，減弱或取消終止子的作用，稱為抗終止作用（anti-termination），這種蛋白因子就稱為抗終止因子（anti-terminator）,（3）結構基因,操縱子中被編碼蛋白質和RNA的基因 含有2個以上的結構基因，多的可達十幾個 每個結構基因是一個連續(xù)的開放讀框, 5端有翻譯起始碼，3端有翻譯終止碼 各結構基因頭尾銜接、串連排列，組成結構基因群,至少在第一個結構基因5側具有SD序

7、列，當被轉錄成多順反子mRNA，就能被核糖體所識別結合、并起始翻譯 核糖體沿mRNA移動，在合成完第一個編碼的多肽后，不脫離mRNA而繼續(xù)翻譯合成下一個多肽，直至合成完這條多順反子mRNA所編碼的全部多肽,（4）操縱基因 ,能被調控蛋白特異性結合的一段DNA序列，常與啟動子鄰近或與啟動子序列重疊，當調控蛋白結合在操縱序列上，會影響其下游基因轉錄的強弱 并不編碼蛋白質，起著調控基因表達強弱的作用,乳糖操縱子中的操縱基因為例 操縱基因（o）序列位于啟動子（p）與被調控的基因之間，部分序列與啟動子序列重疊 具有回文（palindrome）樣的對稱性一級結構，能形成十字形的莖環(huán)（stem loop）構

8、造 不少操縱子都具有類似的對稱性序列，可能與特定蛋白質的結合相關,（5）調節(jié)基因（regulatory gene） ,編碼能與操縱序列結合的調控蛋白的基因 與操縱序列結合后能減弱或阻止基因轉錄的調控蛋白稱為阻遏蛋白（repressive protein），其介導的調控方式稱為負調控（negative regulation） 與操縱序列結合后能增強或起動基因轉錄的調控蛋白稱為激活蛋白（activating protein），所介導的調控方式稱為正調控（positive regulation）,調節(jié)基因lac I位于Plac鄰近，有其自身的啟動子和終止子，轉錄方向和結構基因群的轉錄方向一致，編碼產(chǎn)

9、生由347個氨基酸組成的調控蛋白R 在環(huán)境沒有乳糖存在的情況下，R形成活性四聚體，能特異性與操縱子緊密結合，從而阻止利用乳糖的酶類基因的轉錄,當環(huán)境中有足夠的乳糖時，乳糖受-半乳糖苷酶作用轉變?yōu)閯e乳糖與R結合，使R的空間構像變化，四聚體解聚成單體，失去與操縱子特異性緊密結合的能力，從而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以轉錄合成利用乳糖的酶類 乳糖（別乳糖）是誘導物，與R結合起到去阻遏作用，誘導了利用乳糖的酶類基因轉錄開放,許多調控蛋白都是變構蛋白（allosteric protein），通過與上述類似的方式與效應物結合改變空間構像，從而改變活性，起到調節(jié)基因轉錄表達的作用 效應物（effe

10、ctor）：某些特定的物質能與調控蛋白結合，使調控蛋白的空間構像發(fā)生變化，從而改變其對基因轉錄的影響 誘導物（inducer）：能誘導操縱子開啟的效應物 輔阻遏物（corepressor）：能導致操縱子關閉，阻遏轉錄過程的效應物,（6）順式作用和反式作用 ,順式作用（cis-action）：啟動子、操縱子位于緊鄰結構基因群的上游，終止子在結構基因群之后，它們都在結構基因的附近，只能對同一條DNA鏈上的基因表達起調控作用 順式作用元件（cis-acting element）：啟動子、操縱子和終止子,反式作用（trans-action）：調節(jié)基因可以在結構基因群附近、也可以遠離結構基因，它通過其基

11、因產(chǎn)物調控蛋白來發(fā)揮作用 調節(jié)基因不僅能對同一條DNA鏈上的結構基因起表達調控作用，而且能對不在一條DNA鏈上的結構基因起作用 反式作用元件（trans-acting element）：調節(jié)基因 反式調節(jié)因子（trans-acting factor）：其編碼產(chǎn)生的調控蛋白,三、原核基因調控機制的類型與特點 ,1、根據(jù)操縱子對調節(jié)蛋白（阻遏蛋白或激活蛋白） 的應答，可分為： 正轉錄調控 負轉錄調控,可誘導調節(jié)：某些物質的誘導下使基因活化 操縱子常常是關閉的，主要是一些編碼糖和氨基酸分解代謝酶的基因，這些糖和氨基酸平時含量少，一旦生存條件發(fā)生變化，可以開啟基因的表達 例：大腸桿菌的乳糖操縱子,2、

12、根據(jù)操縱子對某些能調節(jié)它們的小分子的應答，可分為可誘導調節(jié)和可阻遏調節(jié)兩大類：,分解代謝酶合成的誘導操縱子模型,誘導物：與阻遏蛋白結合，改變其構型,能夠促使細菌產(chǎn)生酶來分解它，這種物質就是誘導物。,可阻遏調節(jié)：基因常常是開啟的，主要是一些合成各種細胞代謝過程中所必須的小分子物質的基因，由于這類物質在生命活動中的重要地位，操縱子呈開啟狀態(tài)； 由于一些特殊代謝物或化合物的積累而將其關閉，阻遏了基因的表達 例：色氨酸操縱子 合成代謝蛋白的基因,酶合成的阻遏操縱子模型,輔阻遏物,由于某物質的結合使無活性的阻遏物激活，便阻止細菌蛋白的合成，這種物質為輔阻遏物。,3. 在負轉錄調控系統(tǒng)中，調節(jié)基因的產(chǎn)物是

13、阻遏蛋白（repressor），阻止結構基因的轉錄 分為負控誘導和負控阻遏 負控誘導系統(tǒng)中，阻遏蛋白與誘導物結合，使結構基因轉錄； 負控阻遏系統(tǒng)中，阻遏蛋白與輔阻遏物結合時，阻止結構基因的轉錄,4. 在正轉錄調控系統(tǒng)中，調節(jié)基因的產(chǎn)物是激活蛋白（activator） 正控誘導和正控阻遏 正控誘導系統(tǒng)中，誘導物的存在使激活蛋白活化； 正控阻遏系中，輔阻遏物的存在抑制激活蛋白的活性,負控誘導系統(tǒng),負控阻遏系統(tǒng),正控誘導系統(tǒng),正控阻遏系統(tǒng),對 比,四、弱化子對基因活性的影響,弱化子（attenuation）：當操縱子被阻遏、RNA 合成終止時，起終止轉錄信號作用的的一段核苷酸 調節(jié)方式：核糖體在轉錄

14、本上的位置, 決定了 RNA 形成的二級結構, 從而決定基因能否繼續(xù)轉錄 調節(jié)信號分子: 細胞中某一氨基酸、嘧啶或氨酰-tRNA的濃度,五、降解物對基因活性的調節(jié),降解物抑制作用（葡萄糖效應）：在葡萄糖存在時，細菌不利用乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或麥芽糖等，與其相對應的操縱元也不啟動，不產(chǎn)生相應的酶，此為葡萄糖效應或降解物抑制作用,六、細菌的應急反應,應急反應：當細菌氨基酸全面匱乏時，會產(chǎn)生一個應急反應，如停止合成 RNA、糖、脂肪和蛋白質相關的生物化學反應 應急反應實施信號：鳥苷四磷酸（ppGpp）和鳥苷五磷酸（pppGpp），一種超級調控因子 誘導物：空載 tRNA,第二節(jié) 乳糖操縱元與負控誘

15、導系統(tǒng) lactose operon, negative induction,一、乳糖操縱元的結構及本底表達 二、乳糖操縱元的調控位點 二、乳糖操縱元的負控誘導系統(tǒng) 四、乳糖操縱元的正調控 五、 操縱元的突變-遺傳分析驗證操縱元功能 六、 lac 操縱元中的其它特點,一、乳糖操縱子的結構及本底表達,大腸桿菌乳糖操縱子包括 3 個結構基因：Z、Y 和 A ，以及啟動子、操縱子和阻遏子等 轉錄時，RNA 聚合酶首先與啟動區(qū)（Promoter, P）結合，通過操縱子（Operator, O）向右轉錄, 半乳糖苷酶： 半乳糖苷鍵的專 一 性酶，可將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，也水解其他 半乳糖苷（如苯

16、基半乳糖苷） 透過酶：使外界的 半乳糖苷（如乳糖）透過大腸桿菌細胞壁和原生質進入細胞內 用乳糖為大腸桿菌生長的惟 一 碳源和能源時，這兩種酶是必需的,lac 操縱元的本底表達及特點 誘導物穿越細胞膜需要透過酶，一些透過酶可以在沒有誘導物的情況下合成 真正的誘導物是乳糖的異構體 異構乳糖，別乳糖是在 半乳糖苷酶的催化下由乳糖產(chǎn)生的，需要 半乳糖苷酶的預先存在 本底水平的組成型合成（background level， constitutive synthesis）：在非誘導狀態(tài)下有少量的 lac mRNA 合成,二、乳糖操縱元的調控位點,Operator 操縱基因 阻遏蛋白結合區(qū),O區(qū)：阻遏物結合

17、區(qū)，位于P區(qū)后半部分和轉錄起始區(qū)（-7+28），該區(qū)序列有對稱性，其對稱中心點在+11位，對稱序列，6bp,2. 啟動啟動子區(qū) RNA聚合酶結合位點 從I基因結束到mRNA轉錄起始位點下游5-10bp 含cAMP-CAP結合區(qū)：cAMP結合位點 （-67-52），有對稱性，其對稱位點在-60-59之間,幾個 操縱元 DNA 的調控區(qū)域 P、O 區(qū) 阻遏物與o區(qū)的結合影響了RNA聚合酶與啟動子區(qū)結合形成轉錄起始復合物的效率,三、乳糖操縱元的負控誘導系統(tǒng),1. 阻遏物 lac 基因產(chǎn)物及功能 Lac 操縱元阻遏物 mRNA：弱啟動子控制 組成型表達,阻遏蛋白：由 4 個相同的亞基組成，每個亞基含有

18、 347 個氨基酸殘基，并能與 1 分子 IPTG 結合,乳糖操縱元的三個操縱子序列與阻遏蛋白結合的特征及其作用,阻遏蛋白質-DNA 互作空間構像,lacZ基因內部的O2核苷酸序列作為操縱基因時（Operator），有阻遏蛋白就會與其結合，從而阻止基因表達，這是一種高效阻遏的非常保險的方式：即編碼序列具有操縱基因序列，被阻遏蛋白結合，因而不可能表達轉錄本。 生物進化的保險機制。,阻遏蛋白結合在操縱子部位,2. 大腸桿菌對乳糖的反應,培養(yǎng)基中有無誘導物對 lac mRNA 及 半乳糖苷酶活性的影響,無乳糖存在， lac mRNA 及 半乳糖苷酶本底水平表達 有乳糖存在， lac mRNA誘導表達

19、， 半乳糖苷酶和透過酶合成 乳糖消耗，阻遏物持續(xù)合成，細胞重新構建阻遏狀態(tài)， lac mRNA合成受抑制，總量下降 酶合成停止，但是蛋白半衰期較長，可以維持一段時間,安慰性誘導物（gratuitous inducer）：高效誘導物，但不是半乳糖苷酶的底物 乳糖類似物 異丙基巰基半乳糖苷（IPTG），巰甲基半乳糖苷（TMG），發(fā)色底物 O 硝基半乳糖苷（ONPG）都是安慰性誘導物 IPTG 應用最多, 與 X-gal 結合，細菌藍白斑篩選,IPTG,TMG,ONPG,四、乳糖操縱元的正調控 ,1. 葡萄糖對 lac 操縱元的影響 半乳糖苷酶作用：把乳糖分解成葡萄糖及半乳糖 葡萄糖和乳糖同時加入培

20、養(yǎng)基：大腸桿菌在耗盡外源葡萄糖之前不會誘發(fā) lac 操縱子 葡萄糖對lac操縱子表達的抑制作用是間接的 葡萄糖的某些降解產(chǎn)物抑制 lac mRNA 的合成，葡萄糖的這種效應為代謝物阻遏效應（catabolite repression）,當葡萄糖和乳糖同時存在于培養(yǎng)基中時，lac 啟動子表達受阻，沒有 半乳糖苷酶活性 當葡萄糖消耗完以后（箭頭處），細胞內 cAMP （環(huán)腺苷酸）濃度增加， 半乳糖苷酶活性增加，一度停止生長的細胞又恢復分裂,？,細菌的 cAMP 含量，與葡萄糖的分解代謝有關：當分解葡萄糖產(chǎn)生能量時，cAMP 生成少分解多，故 cAMP 濃度低 當環(huán)境中無葡萄糖供應時，cAMP 含量

21、升高，為何？ cAMP 合成由 腺苷酸環(huán)化酶 (AC) 催化，葡萄糖抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性; 無葡萄糖，腺苷酸環(huán)化酶活性高，cAMP 高,cAMP 的糖分子的3和5同時與一個磷酸形成3-5磷酸二酯鍵,cAMP: adenosine 3,5-cyclic monophosphate,2. CRP（CAP）與 cAMP （環(huán)化AMP） 為何同時存在乳糖和葡萄糖時，乳糖操縱元受阻不開放？ 乳糖操縱元開放，還需一種 cAMP 的受體蛋白 （cAMP receptor protein, CRP）的正調控，也稱為 代謝物激活蛋白（catabolite activating protein, CAP） CR

22、P 與 cAMP 結合并發(fā)生空間構象變化而活化，能以二聚體的方式與特定的 DNA 序列結合，從而啟動 Lac 操縱元,cAMP-CRP能與DNA相結合，造成雙螺旋彎曲，易于形成三元轉錄起始復合物 阻遏物則是抗解鏈蛋白，阻止形成開放結構,CRP激活轉錄的方式,只要有這個“環(huán)”的亞基存在，阻遏物無法與O區(qū)相結合，lac operon得到表達,CAP結合位點,CAP為二聚體， 45KD ，被cAMP激活 結合位點22bp I -70 -50 II -50 -40,CAP cAMP 在 CAP 位點上與 RNA pol 的相互作用,gal, lac 和 ara 操縱子上游啟動子區(qū)與 CAP cAMP

23、結合位點的相對位置分析,CAP 的正調控作用，結合后啟動 Lac 操縱元轉錄,lac 啟動子在兩個相互獨立的調控體系互作下實現(xiàn)其功能, 乳糖操縱元正控系統(tǒng)和負控系統(tǒng)比較,五、 操縱元的突變-遺傳分析驗證操縱元功能,1. 顯性突變：操縱子突變（O+ Oc），結構基因組成型表達,等位基因間的顯隱關系 w.t. (I+ O+ P+) 誘導型 加入誘導物 操縱子開啟 無誘導物 操縱子關閉 OC mut. (I+ OC P+) （組成型） OC失去與阻遏蛋白特異結合的能力 有無誘導物 操縱子均開啟 組成部分二倍體OCO+ OC O+ cis-dominant,iS p o,mut repressor,I

24、+,組成部分二倍體 IS/I+ IS/iC iS I+ iS iC,等位基因間的顯隱關系 w.t. (I+ O+ P+) 誘導型 加入誘導物 操縱子開啟 無誘導物 操縱子關閉 iS mut. (iS O+P+) (超阻型) iS gene 產(chǎn)物阻遏蛋白不能與誘導物結合 有無誘導物，操縱子均關閉,2. 隱性突變：阻遏蛋白基因突變（I+ IC），結構基因組成型表達,等位基因間的顯隱關系 w.t. (I+ O+ P+) 誘導型 加入誘導物 操縱子開啟 無誘導物 操縱子關閉 iC mut. (iC O+P+) (組成型) iC gene產(chǎn)物阻遏蛋白喪失與O位點結合的能力 可誘導表達 組成部分二倍體 I

25、+/IC I+ iC,六、 lac 操縱元中的其它特點,1. A 基因及其生理功能 A基因編碼 半乳糖苷乙酰基轉移酶 半乳糖苷酶降解的半乳糖苷分子不能進一步代謝，不少半乳糖苷衍生物在高濃度時是細胞生長的抑制物 A 基因能把乙?；D移到半乳糖苷分子上，但它抑制了 半乳糖苷酶產(chǎn)物的有害性衍生物在細胞內積累，在生物進化中具有意義,2. lac基因產(chǎn)物數(shù)量上的變化 在一個完全被誘導的細胞中，-半乳糖苷酶、透過酶及乙酰基轉移酶的拷貝數(shù)比例為1:0.5:0.2 反映了以-半乳糖苷作為唯一碳源時細胞的需要 調控機制： lac mRNA可能與翻譯過程中的核糖體相脫離，從而終止蛋白質鏈的翻譯；頻率取決于每一個后

26、續(xù)的AUG密碼子再度起始翻譯的概率 在lac mRNA分子內部，A基因比Z基因更易受內切酶作用發(fā)生降解，在任何時候Z基因的完整拷貝數(shù)要比A基因多,Spacer 較短時,3. 操縱子的融合與基因工程 自然條件下，lac操縱子與負責嘌呤合成的pur操縱子偶聯(lián) 位于lac操縱子沿轉錄方向的下游，中間隔一個控制細胞對T6噬菌體敏感性的tsx基因 tsxsZ+ tsxRZ-,Lac啟動子轉錄酶有較高的親和力，可高效啟動轉錄的啟動子，可使較弱啟動子的轉錄增強，增加蛋白質的合成量,第三節(jié) 色氨酸操縱元與負控阻遏系統(tǒng)Tryptophan operon，negative repression,一、trp 操縱元

27、的阻遏系統(tǒng) 二、弱化子與前導肽 三、trp 操縱子弱化機制的實驗依據(jù) 四、阻遏和弱化作用的協(xié)調 四、trp 操縱元的其它調控機制,細菌中色氨酸生物合成途徑,trpG-D 和trpC-F基因融合 trpE和trpG編碼鄰氨基苯甲酸合酶 trpD編碼鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉移酶 trpC編碼吲哚甘油磷酸合酶，trpF編碼異構酶 trpA和trpB分別編碼色氨酸合酶的和亞基,trpE 基因是第一個被翻譯的基因，和 trpE 緊鄰的是啟動子區(qū)和操縱區(qū) 前導區(qū)和弱化子區(qū)分別定名為 trpL 和 trpa trpR 編碼阻遏物，它距 trp 基因簇很遠。后者位于大腸桿菌染色體 25 min 處，而前者在 9

28、0 min 位置 在 65 min 處有一個 trpS（色氨酸 tRNA 合成酶），它與攜帶色氨酸的 tRNATrp 共同參與 trp 操縱子的調控作用,大腸桿菌中的 trp 操縱元,受阻遏系統(tǒng)和弱化系統(tǒng)的調控,一、 trp 操縱元的阻遏系統(tǒng),阻遏蛋白（aporepressor）：trpR 基因的產(chǎn)物，該基因突變常引起 trp mRNA 的組成型合成 阻遏蛋白與操縱子的結合需要色氨酸（效應物） 阻遏蛋白與色氨酸結合形成有活性的阻遏物，再與操縱區(qū)結合即關閉 trp mRNA 轉錄,效應物：色氨酸由 trp 操縱元編碼的合成途徑的末端終產(chǎn)物 當培養(yǎng)基中色氨酸供應不足時，阻遏物失去色氨酸并從操縱子上

29、解離，trp 操縱子去阻遏，可轉錄 當培養(yǎng)基中色氨酸含量較高時，它與游離的阻遏蛋白相結合，并使之與操縱子 DNA 緊密結合，抑制轉錄,trp 操縱元的阻遏系統(tǒng),自動調控 避免浪費,二、 弱化子與前導肽,色氨酸高濃度和低濃度下，trp操縱子的表達水平相差600倍，而阻遏作用僅能使轉錄降低70倍 阻遏物失活突變不能完全消除色氨酸對操縱子表達的影響 阻遏-操縱機制對色氨酸來說是一個一級開關，主管轉錄是否啟動，相當于粗調開關 其它調控機制弱化作用進行細調控，指示已經(jīng)啟動的轉錄是否繼續(xù)下去 通過轉錄達到第一個結構基因之前的過早終止來實現(xiàn)的，由色氨酸的濃度來調節(jié)這種過早終止的頻率,1. 弱化子 前導區(qū)：在

30、 trp mRNA 5 端 trpE 基因的起始密碼前有一個長 162 bp 的 mRNA 片段，為前導區(qū) 弱化子：當 mRNA 合成起始后，有色氨酸時，轉錄總是在這個區(qū)域終止，產(chǎn)生一個僅有 140 個核苷酸的 RNA 分子，終止 trp 基因轉錄，該區(qū)域為弱化子,莖 環(huán)結構：引起終止的 mRNA 序列自身配對形成莖 環(huán)結構，具典型的終止子特點,2. 前導肽 在Trp中，含 AUG 和 UGA ，若翻譯起始于 AUG ，可產(chǎn)生一個 14 aa 短肽，這個假設的短肽稱為前導肽。 前導肽第 10，第 11 位上有相鄰的兩個色氨酸密碼子，UGG，UGG，參與了 trp 操縱元中的轉錄弱化機制,弱化子

31、結構,trpE 基因的起始密碼前有一個 162 bp 的 mRNA 片段,四個區(qū)域的 可能配對方式,10, 11位的Trp,3. 轉錄弱化作用機理,無色氨酸，無負載色氨酸的 tRNATrp ，通過兩個相鄰色氨酸密碼子的速度慢，當4區(qū)被轉錄完成時，核糖體才進行到1區(qū)（或停留在兩個相鄰的trp密碼子處），前導區(qū)結構為 2 3 配對，無 3 4 配對，可轉錄 有色氨酸，核糖體很快就通過兩個相鄰色氨酸密碼子， 2 3 不能配對， 有3 4 配對形成莖 環(huán)狀終止結構，終止轉錄,2,3,3,4,Trp codon 在核糖體上,Trp codon 離開核糖體,trp 操縱元的轉錄與翻譯偶聯(lián)調控,轉錄和翻譯偶

32、聯(lián)，才可能發(fā)生弱化作用,如果當其他氨基酸短缺或所有的氨基酸都不足時，核糖體翻譯移動的速度就更慢，甚至不能占據(jù)A的序列，結果有利于A和C發(fā)夾結構的形成，于是RNA聚合酶停止轉錄 等于告訴細菌：“整個氨基酸都不足，即使合成色氨酸也不能合成蛋白質，不如不合成以節(jié)省能量” 細菌其他氨基酸合成系統(tǒng)的許多操縱子（如組氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸等操縱子）中也有類似的弱化子存在,原核 RNA 前導序列的變構引起轉錄繼續(xù),區(qū)沒有配對的發(fā)夾結構,原核 RNA前導序列的變構引起轉錄的終止或弱化,三、 trp 操縱子弱化機制的實驗依據(jù),在色氨酸濃度高時，色氨酰 tRNA 合成酶缺陷型的 trp 操縱元表

33、達 溫度敏感突變株 trpS5 的 Trp tRNA 合成酶只在 30 0C 時有活性，在 42 0C 時無活性 30 0C 時，色氨酰 tRNA合成酶有活性，可生成 tRNATrp，trp 操縱元不表達 42 0C 時，色氨酰 tRNA 合成酶失去活性，不能生成 tRNATrp，trp 操縱元表達,另有一個缺失前導區(qū)及D基因的突變體（trpLD102），該細菌在有色氨酸的培養(yǎng)基中仍有很高的色氨酸合成酶活性,有實驗證明，在不加色氨酸的培養(yǎng)基中，trp mRNA的合成仍然受到部分阻遏 現(xiàn)在一般認為，野生型細胞中同時存在著有活性和無活性的阻遏物，培養(yǎng)基中色氨酸濃度的變化，能夠使這兩種阻遏物間的平衡

34、發(fā)生傾斜，最終做出關閉或啟動trp操縱子的決定，從而維持一定的色氨酸含量,四、阻遏與弱化作用的協(xié)調,一種可能是阻遏物從有活性向無活性的轉變速度極低，需要有一個能更快地做出反應的系統(tǒng)，以保持培養(yǎng)基中適當?shù)纳彼崴?弱化子系統(tǒng)主要是對外源色氨酸濃度做出反應。外源色氨酸濃度很低的信號雖然足以引起trp操縱子的去阻遏作用，但是這個信號還不足以很快引發(fā)內源色氨酸的合成 在這種環(huán)境下，弱化子就通過抗終止的方法來增加trp基因表達，從而提高內源色氨酸濃度,1. 細菌中為什么要有弱化子系統(tǒng)呢？,2. 為什么還要有阻遏體系呢？,沒有阻遏體系，只有弱化也可以調節(jié)色氨酸酶系的合成 阻遏的作用是在有大量外源色氨酸存

35、在時，保障阻止非必需的先導 mRNA 的合成，不合成色氨酸轉錄本，生物的合成系統(tǒng)更加經(jīng)濟，避免浪費 組氨酸操縱子擁有在功能上與 trp 操縱子完全相同的弱化子結構，但沒有阻遏物，它的表達完全受弱化子調節(jié),五、 trp 操縱元的其它調控機制, 大腸桿菌（E. coli）： 共有 5 個基因參與色氨酸生物合成，構成色氨酸操縱元 trpG D 和 trpC F 為融合基因，翻譯出的多肽具有雙重功能 有兩個啟動子控制整個操縱子的轉錄，能夠感受色氨酸和無負載的 tRNATrp 的濃度變化 枯草芽孢菌（Bacillus subtilis）： 色氨酸操縱子包括 6 個基因，處于一個 12 個基因的大操縱子內

36、 B. subtilis 還有第 7 個色氨酸合成基因 trpG（又稱 pabA），位于葉酸操縱子中 翻譯出來的 Trp-PabA 多肽鏈能發(fā)揮兩個酶的作用，一個用于色氨酸途徑，一個用于葉酸途徑,B. subtilis（枯草芽胞桿菌）中色氨酸操縱元的調控機制,色氨酸激活調節(jié)蛋白TRAP，形成終止子結構 無負載的tRNATrp聚集使TRAP失活，激活轉錄和翻譯 無負載的tRNATrp濃度升高，rtpA基因編碼的AT蛋白與TRAP結合，激活轉錄,第四節(jié) 其它操縱元,一、半乳糖操縱元 二、阿拉伯糖操縱元 三、阻遏蛋白Lex的降解與細菌中的SOS應答 四、多啟動子調控的操縱子,一、半乳糖操縱元 大腸桿

37、菌半乳糖操縱子（galactose operon）在大腸桿菌遺傳圖上位于 17 min 處 包括 3 個結構基因：異構酶（UDP galactose 4 epimerase, galE），半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷轉移酶（galactose transferase, galT），半乳糖激酶（galactose kinase, galK） 3 個酶的作用：使半乳糖變成葡糖 1 磷酸 調節(jié)基因是galR與galE、T、K及操縱區(qū)O等離得很遠，而galR產(chǎn)物對galO的作用與lacI-lacO的作用相同, gal操縱元的結構及其代謝途徑,（a）操縱元的結構,（b）代謝途徑, 半乳糖操縱元的結構及其調控機

38、制,1. cAMP CRP 對 gal 啟動子的作用,gal 操縱子 P O 區(qū)序列中有兩個相距僅為 5 bp 的啟動子 每個啟動子擁有各自的 RNA 聚合酶結合位點 S1 和 S2 gal 操縱子可以從兩個啟動子分別起始基因轉錄,cAMP-CRP對從S1和S2 起始的轉錄有不同作用 無葡萄糖時， cAMP-CRP濃度高，從S1起始的轉錄順利進行，RNA聚合酶與S1的結合需要半乳糖 有葡萄糖時，無cAMP-CRP，轉錄從S2開始,半乳糖不僅可以作為唯一碳源供細胞生長，而且與之相關的物質-尿苷二磷酸半乳糖（UDP-gal）是大腸桿菌細胞壁合成的前體，生長過程中的所有時間里細胞必須能夠合成差向異構

39、酶，保證尿苷二磷酸的供應 在沒有外源半乳糖的情況下，UDP-gal是通過半乳糖差向異構酶（ galE基因的產(chǎn)物）的作用由UDP-葡萄合糖成的,2. 雙啟動子的生理功能,假如只有S1啟動子，由于這個啟動子的活性依賴于cAMP-CRP，當培養(yǎng)基中有葡萄糖存在時就有不能合成異構酶galE； 假如只有S2啟動子，那么在葡萄糖存在的情況下，半乳糖使操縱子處于充分誘導狀態(tài)，這無疑是一種浪費 從必要性或經(jīng)濟性考慮，都需要一個不依賴于cAMP-CRP的啟動子（S2）進行本底水平的組成性合成，以及一個依賴于cAMP-CRP的啟動子（S1）對高水平合成進行調節(jié),二、阿拉伯糖操縱元,阿拉伯糖（arabinose）是

40、另一個可以為代謝提供碳源的五碳糖 在大腸桿菌中阿拉伯糖的降解需要3個基因：araB、araA和araD 分別編碼3個酶：araB基因編碼核酮糖激酶，araA編碼L-阿拉伯糖異構酶，araD編碼L-核酮糖-5-磷酸-4-差向異構酶,1. ara 操縱元的特點,雙向轉錄：araPBAD 和araPc轉錄方向相反 AraC有3個結合位點（O1，O2，araI：激活蛋白結合位點） Pc和O1重疊 AraC既可充當阻遏物，也可作為激活劑。純的AraC 結合araO1，阻遏作用；C+Ara 結合于araI調節(jié)區(qū)，誘導，正調節(jié)。 araC本身受到操縱調節(jié)（自身調節(jié)） araC的表達受自身產(chǎn)物AraC的調控：

41、當沒有阿拉伯糖時，AraC起著一個轉錄阻遏物的作用。 阻遏araC轉錄大約需要40個AraC。因此當AraC蛋白水平低時，araC將表達直至存在足夠的AraC去阻遏它的轉錄。,2. AraC 蛋白的正、負調節(jié)作用,有Ara無Glu時，AraC 蛋白與誘導物阿拉伯糖相結合后，結合于araI，誘導 araPBAD 轉錄 正控系統(tǒng)中，起始轉錄還需要 cAMP CRP 參與,當Glu較高， Ara水平較低時， AraC過量，可結合到araO1，阻遏Pc。 AraC 蛋白與操縱區(qū)O2以及araI誘導因子結合區(qū)上半?yún)^(qū)相結合，形成DNA回轉結構，araBAD 基因不表達,AraC蛋白作為PBAD活性正、負調

42、節(jié)因子的雙重功能是通過該蛋白的兩種異構體來實現(xiàn)的 Pr是起阻遏作用的形式，可以與現(xiàn)在尚未鑒定的類操縱區(qū)位點相結合， Pi是起誘導作用的形式，它通過與PBAD啟動子結合進行調節(jié) 沒有阿拉伯糖時，Pr形式占優(yōu)勢；有阿拉伯糖存在，它就能夠與AraC蛋白結合，使平衡趨向于Pi形式 阿拉伯糖的誘導作用就可以解釋為阿拉伯糖與Pr的結合，使Pr離開它的結合位點，然后，產(chǎn)生大量的Pi，并與啟動子結合,培養(yǎng)基中含有葡萄糖，cAMP-CRP沒有與操縱區(qū)位點相結合，AraC蛋白處于Pr形式并與O1位點結合，RNA聚合酶很少再與Pc結合，araC基因雖然仍有轉錄，但受到抑制，只有少量 AraC蛋白形成，整個系統(tǒng)幾乎處

43、于靜止狀態(tài),3. 營養(yǎng)狀況對ara操縱子活性的影響,沒有葡萄糖，也沒有阿拉伯糖，因為沒有誘導物，盡管有cAMP-CRP與操縱區(qū)位點相結合，AraC蛋白仍以Pr形式為主，無法與操縱區(qū)O2位點相結合，無araBAD mRNA轉錄,無葡萄糖，阿拉伯糖時，大量araC基因產(chǎn)物以Pi形式存在，并分別與操縱區(qū)O1、O2位點相結合，在cAMP-CRP的共同作用下，araC和araBAD基因大量表達，操縱子充分激活,三、阻遏蛋白LexA的降解與細菌中的SOS應答,SOS系統(tǒng)基因LexA 編碼阻遏蛋白 RecA低水平表達 RecA 與DNA單鏈結合活化成為蛋白酶 切割LexA 阻遏蛋白 SOS系統(tǒng)高效表達，DN

44、A修復,四、多啟動子調控的操縱子（P276）,1rRNA操縱子 大腸桿菌rRNA操縱子（rrnE）上有兩個啟動子，P1和P2 P1是強啟動子，營養(yǎng)充沛時，由P1起始的轉錄產(chǎn)物比由P2起始的轉錄產(chǎn)物高3-5倍 當營養(yǎng)匱乏時，P1的作用被抑制，但P2仍有功能,2. 核糖體蛋白SI操縱子 核糖體蛋白SI操縱子（rpsA），它也受應急反應調節(jié) RpsA有4個啟動子，P1、P2是強啟動子，平時主要依靠它們來啟動基因的表達，合成SI蛋白 P3、P4是弱啟動子，只有在緊急情況下，P1、P2啟動子受ppGpp的抑制，由P3、P4起始合成的SI蛋白維持了生命的最低需要,3. Dna Q蛋白操縱子,Dna Q蛋白

45、是DNA聚合酶全酶的亞基之一，其主要功能是校正DNA復制中可能出現(xiàn)的錯誤 受RNA聚合酶活性的調節(jié)，有兩個啟動子 在RNA聚合酶活性較低時，操縱子的轉錄由弱啟動子P2控制；而RNA聚合酶活性較高時，就開始利用強啟動子P1,第五節(jié) 轉錄水平的其他調控方式（P282）,一、因子的活性調節(jié)及選擇性使用 二、組蛋白類似蛋白的調節(jié)作用（略） 三、轉錄調控因子的作用（略） 四、抗終止因子的調節(jié)作用（略）,E. coli 中基因表達調控最常見的蛋白質是因子， 70 是調控基本生理功能如碳代謝、生物合成等基因轉錄所必須的因子,一. 因子的活性調節(jié)及選擇性使用（P248）,70 家族：除54 外，其它 5 種因

46、子在結構上具有同源性，統(tǒng)稱70 家族 大腸桿菌的因子（以70 為例）主要包括 4 個結構域：其中第 2 個和第 4 個保守區(qū)參與結合啟動區(qū) DNA，第 2 個保守區(qū)的另一部分還參與雙鏈 DNA 解開成單鏈的過程,70 類啟動子：核心酶結合到 DNA 鏈上后與啟動子區(qū)相結合 54 啟動子：類似于真核生物的 TATA 區(qū)結合蛋白（TBP），在無核心酶時可獨立結合到啟動子上, 70 和54 因子識別并結合在所調控基因上游的不同區(qū)域,70 類啟動子,54 啟動子,因子的選擇性使用與熱激基因的表達調控 高溫下， 32因子數(shù)量增加，替代70因子，引導RNA聚合酶到熱休克基因的啟動子上，激活熱休克基因的轉錄,ropS,因子的級聯(lián)與噬菌體不同時期基因表達之間的關系 由一種起始因子啟動第二種因子及其附帶基因，依次類推,SP