熒光偏振免疫分析ppt課件

1、熒光偏振免疫分析,by沈未,熒光偏振(fluorescence polarization, FP)通常定義為:用垂直方向(丄)的偏振光激發(fā)熒光分子,然后測量發(fā)射偏振光在垂直方向(丄)和水平方向(丨)的熒光光強(qiáng)度(丨) 早期的熒光偏振研究均以P表示,目前其仍常用于臨床化學(xué)和藥物篩選;而A多生物學(xué)檢測,是因其便于進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和解釋某些相關(guān)的物理學(xué)參數(shù),FP值是一個(gè)比值,一般以mP表示(1P=1000mP)。 分子固定不動,即完全偏振時(shí),FP值是P0=1000 mP,是理論上的最大值; 在一個(gè)分子可以自由運(yùn)動的系統(tǒng)中,根據(jù)分子運(yùn)動速度的快慢,熒光偏振值大約在0 500 mP之間,論文的結(jié)構(gòu)和主要內(nèi)容

2、,如果待測樣本中競爭抗原含量很少(低于檢測限),熒光標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合,FP值較高(一般在150-300 mP)。 而待測樣本中競爭抗原的濃度增加時(shí),熒光標(biāo)記抗原以游離的形式存在于樣本中,FP值便會下降,一般在30-60 mP即為完全抑制,FPIA是均相的競爭免疫分析方法,反應(yīng)完全在溶液系統(tǒng)中,不需要分離結(jié)合的和未結(jié)合的抗體。 實(shí)驗(yàn)操作過程非常簡單,僅僅是將抗體,熒光標(biāo)記的抗原和抗原加入到反應(yīng)杯中,經(jīng)過幾分鐘甚至是幾秒鐘的溫育便可直接測量,很快得到被測抗原的濃度,組蛋白對DNA熒光偏振度影響,1. 制備DNA-組蛋白復(fù)合體: -DNA(48kbp)用熒光染料YOYO-1標(biāo)記, 堿基對與染料分子

3、之比為10:1; 用 Bis-Tris緩沖液(50mmol/L, pH6.6)稀釋組蛋白溶液; 組蛋白濃度是DNA的10500倍; DNA/YOYO-1溶液(6.5 pmol/L)和稀釋后的組蛋白溶液共同保溫(37)培育3h, 反應(yīng)液體積為2mL,組蛋白對DNA熒光偏振度影響,2.熒光偏振度測量: 用MOS-450/CD測量,其是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的熒光偏振度測量模式; 在測量熒光偏振度時(shí), 偏振光彈性調(diào)制器自動設(shè)置在半波長模式, 這樣激發(fā)光在水平分量和垂直分量之間以100 kHz 的頻率轉(zhuǎn)換; 應(yīng)用Bio-Kine 軟件(Bio-Logic)通過兩個(gè)散射信號實(shí)時(shí)計(jì)算熒光強(qiáng)度和熒光偏振度,組蛋白對DNA

4、熒光偏振度影響,3. DNA-組蛋白復(fù)合體熒光偏振度隨組蛋白與DNA 濃度比變化關(guān)系曲線,組蛋白對DNA熒光偏振度影響,4. 對圖表的解釋: 在溶液中單獨(dú)存在時(shí), DNA分子隨機(jī)卷曲且有彈性此構(gòu)型對應(yīng)著一定的偏振度值.在我們的實(shí)驗(yàn)條件下, DNA 分子的熒光偏振度在0.11左右; 在組蛋白的作用下，DNA分子發(fā)生了凝聚; DNA-組蛋白分子可能呈現(xiàn)更緊密、更小的構(gòu)型, 導(dǎo)致復(fù)合體分子 比 DNA 分子旋轉(zhuǎn)更快, 對應(yīng)較小的熒光偏振度值,熒光偏振研究的一般步驟,1.確定最佳的熒光標(biāo)記物; 2.確定公式中的各種參數(shù); 3.倍比稀釋結(jié)合物，根據(jù)不同的FP值確定最優(yōu)稀釋比，使其結(jié)合能力與FP值成線性關(guān)

5、系; 4.建立標(biāo)準(zhǔn)曲線; 5.分析結(jié)果,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)猜想,熒光偏振免疫分析的優(yōu)點(diǎn),1.均相系統(tǒng),不需要洗滌操作,可大大減少試劑的用量。 2.檢測速度很快,且易于自動化,適于快速的篩選檢測。 3.熒光標(biāo)記抗原的均一性好,性質(zhì)穩(wěn)定,可長期保存,方法的重現(xiàn)性好。 4.FP值是一個(gè)比值,與其他熒光檢測技術(shù)相比,不易受溶液顏色和儀器靈敏度變化的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定,可靠性高。 5.選用不同發(fā)射波長的熒光素來進(jìn)行多標(biāo)記檢測,可實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)物的同時(shí)定性及定量分析。如四甲基羅丹明,其激發(fā)和發(fā)射光譜與熒光素的重疊很少,因此相互之間基本不會干擾,現(xiàn)已在多標(biāo)記檢測中得到應(yīng)用,熒光偏振免疫分析的缺點(diǎn),1. FPIA比ELISA方法的靈敏度低。一般來說FPIA的檢測限為0.1-10ng/mL-1左右。 2.FPIA易受樣本基質(zhì)(如與基質(zhì)蛋白的非特異性結(jié)合),背景熒光和光散射的影響。 3.FPIA的檢測信號的背景較高,檢測范圍(窗口)較窄,信噪比(S/N)較低。 4. FPIA對熒光標(biāo)記物的純度要求較高,需耍較復(fù)雜的純化步驟。 5. FPIA檢測需要特定的分析儀器,或?qū)ζ胀ǖ臒晒夥止夤舛扔?jì)增加測量偏振附件。因此價(jià)格較普通酶標(biāo)儀昂貴,對本實(shí)驗(yàn)室研究的思考,當(dāng)研究對象為與核