土壤酶活性測(cè)定方法

1、土壤酶活性測(cè)定方法土壤脲酶的測(cè)定方法（苯酚鈉次氯酸鈉比色法）一、原理 脲酶存在于大多數(shù)細(xì)菌、真菌和高等植物里。它是一種酰胺酶作用是極為專性的，它僅能水解尿素，水解的最終產(chǎn)物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，與土壤的微生物數(shù)量、有機(jī)物質(zhì)含量、全氮和速效磷含量呈正相關(guān)。根際土壤脲酶活性較高，中性土壤脲酶活性大于堿性土壤。人們常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素狀況。土壤中脲酶活性的測(cè)定是以脲素為基質(zhì)經(jīng)酶促反應(yīng)后測(cè)定生成的氨量，也可以通過(guò)測(cè)定未水解的尿素量來(lái)求得。本方法以尿素為基質(zhì)，根據(jù)酶促產(chǎn)物氨與苯酚次氯酸鈉作用生成藍(lán)色的靛酚，來(lái)分析脲酶活性。二、試劑1）甲苯2）10%尿素：稱取10g尿素，用水溶至10

2、0ml。3）檸檬酸鹽緩沖液（PH6.7）：184g檸檬酸和147.5g氫氧化鉀（KOH）溶于蒸餾水。將兩溶液合并，用1mol/LNaOH將PH調(diào)至6.7，用水稀釋定容至1000ml。4）苯酚鈉溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀釋至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。將A、B溶液保存在冰箱中。使用前將A液、B液各20ml混合，用蒸餾水稀釋至100ml。5）次氯酸鈉溶液：用水稀釋試劑，至活性氯的濃度為0.9%，溶液穩(wěn)定。6）氮的標(biāo)準(zhǔn)溶液： 精確稱取0.4717g硫酸銨溶于水并稀釋至1000ml，得到1

3、ml含有0.1mg氮的標(biāo)準(zhǔn)液；再將此液稀釋10倍（吸取10ml標(biāo)準(zhǔn)液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。三、操作步驟稱取5g土樣于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振蕩均勻，15min后加10ml10%尿素溶液和20ml PH 6.7檸檬酸鹽緩沖溶液，搖勻后在37恒溫箱培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后過(guò)濾，過(guò)濾后取1ml濾液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚鈉溶液和3ml次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻。20min后顯色，定容。1h內(nèi)在分光光度計(jì)與578nm波長(zhǎng)處比色。（靛酚的藍(lán)色在1h內(nèi)保持穩(wěn)定）。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：在測(cè)定樣品吸光值之前，分別取0、1、3、5、7、9、11、13ml氮工作液，

4、移于50ml容量瓶中，然后補(bǔ)加蒸餾水至20ml。再加入4ml苯酚鈉溶液和3ml次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻。20min后顯色，定容。1h內(nèi)在分光光度計(jì)上于578nm波長(zhǎng)處比色。然后以氮工作液濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意事項(xiàng):1、每一個(gè)樣品應(yīng)該做一個(gè)無(wú)基質(zhì)對(duì)照，以等體積的蒸餾水代替基質(zhì)，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同，以排除土樣中原有的氨對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。2、整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)無(wú)土對(duì)照，不加土樣，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同，以檢驗(yàn)試劑純度和基質(zhì)自身分解。3、如果樣品吸光值超過(guò)標(biāo)曲的最大值，則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣四、結(jié)果計(jì)算： 以24小時(shí)后1g土壤中NH3N的毫克數(shù)表示土壤脲酶活性（

5、Ure）。Ure=（a樣品a無(wú)土a無(wú)基質(zhì)）Vnm式中：a樣品為樣品吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的NH3N毫克數(shù)； a無(wú)土為無(wú)土對(duì)照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的NH3N毫克數(shù)； a無(wú)基質(zhì)為無(wú)基質(zhì)對(duì)照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的NH3N毫克數(shù)； V為顯色液體積；n為分取倍數(shù)，浸出液體積吸取濾液體積；m表示烘干土重土壤磷酸酶活性測(cè)定（磷酸苯二鈉比色法）一、原理測(cè)定磷酸酶主要根據(jù)酶促生成的有機(jī)基團(tuán)量或無(wú)機(jī)磷量計(jì)算磷酸酶活性。前一種通常稱為有有機(jī)基團(tuán)含量法，是目前較為常用的測(cè)定磷酸酶的方法，后一種稱為無(wú)機(jī)磷含量法。研究證明：磷酸酶有三種最適PH值：45、67、810。因此，測(cè)定酸性、中性和堿性土壤的磷酸酶，要提供相應(yīng)的PH

6、緩沖液才能測(cè)出該土壤的磷酸酶最大活性。測(cè)定磷酸酶常用的PH緩沖體系有乙酸鹽緩沖液（PH5.05.4）、檸檬酸鹽緩沖液（PH7.0）、三羥甲基氨基甲烷緩沖液（PH7.08.5）、和硼酸緩沖液（PH910）。磷酸酶測(cè)定時(shí)常用基質(zhì)有磷酸苯二鈉、酚酞磷酸鈉、甘油磷酸鈉、-或者-萘酚磷酸鈉等。現(xiàn)介紹磷酸苯二鈉比色法。二、試劑1）緩沖液：（1）醋酸鹽緩沖液（PH 5.0）0.2mol/L 醋酸溶液 11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L.0.2mol/L 醋酸鈉溶液 16.4g C2H3O2Na或27g C2H3O2Na.3H2O溶至1L.取14.8ml 0.2mol/L 醋酸溶液和35.2ml 0.2m

7、ol/L 醋酸鈉溶液稀釋至1L.（2）檸檬酸鹽緩沖液（PH 7.0）0.1mol/L 檸檬酸溶液 19.2g C6H7O8溶至1L.0.2mol/L 磷酸氫二鈉溶液 53.63g Na2HPO4.7H2O或者71.7g Na2HPO4.12H2O溶至1L.取6.4ml 0.1mol/L 檸檬酸溶液加43.6ml 0.2mol/L 磷酸氫二鈉溶液稀釋至100ml.（3）硼酸鹽緩沖液（PH 9.6）0.05mol/L 硼砂溶液 19.05g 硼砂溶至1L.0.2mol/L NaOH溶液 8g NaOH溶至1L.取50ml 0.05mol/L 硼砂溶液加23ml 0.2mol/L NaOH溶液稀釋至

8、200ml.2）0.5% 磷酸苯二鈉（用緩沖液配制）3）氯代二溴對(duì)苯醌亞胺試劑：稱取0.125g氯代二溴對(duì)苯醌亞胺，用10ml 96%乙醇溶解，貯于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黃色溶液未變褐色之前均可使用。4）甲苯5）0.3%硫酸鋁溶液6）酚標(biāo)準(zhǔn)溶液 酚原液：取1g重蒸酚溶于蒸餾水中，稀釋至1L，存于棕色瓶中。 酚工作液（0.01mg/ml）：取10ml酚原液稀釋至1L。三、操作步驟稱5g土樣置于200ml三角瓶中，加2.5ml甲苯，輕搖15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二鈉（酸性磷酸酶用乙酸鹽緩沖液；中性磷酸酶用檸檬酸鹽緩沖液；堿性磷酸酶用硼酸鹽緩沖液），仔細(xì)搖勻后放入恒溫箱，37

9、下培養(yǎng)24h。然后在培養(yǎng)液加入100ml 0.3%硫酸鋁溶液并過(guò)濾。吸取3ml濾液于50ml容量瓶中，然后按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方法顯色。用硼酸緩沖液時(shí)，呈現(xiàn)藍(lán)色，于分光光度計(jì)上660nm處比色。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取0、1、3、5、7、9、11、13ml酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml硼酸緩沖液和4滴氯代二溴對(duì)苯醌亞胺試劑，顯色后稀釋至刻度，30min后，在分光光度計(jì)上660nm處比色。以顯色液中酚濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意事項(xiàng):1、每一個(gè)樣品應(yīng)該做一個(gè)無(wú)基質(zhì)對(duì)照，以等體積的蒸餾水代替基質(zhì)，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同，以排除土樣中原有的氨對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。2、整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置一

10、個(gè)無(wú)土對(duì)照，不加土樣，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同，以檢驗(yàn)試劑純度和基質(zhì)自身分解。3、如果樣品吸光值超過(guò)標(biāo)曲的最大值，則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣四、結(jié)果計(jì)算 以24h后1g土壤中釋放出的酚的質(zhì)量（mg）表示磷酸酶活性。 磷酸酶活性=（a樣品a無(wú)土a無(wú)基質(zhì)）Vnm式中：a樣品為樣品吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酚毫克數(shù)； a無(wú)土為無(wú)土對(duì)照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酚毫克數(shù)； a無(wú)基質(zhì)為無(wú)基質(zhì)對(duì)照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酚毫克數(shù)； V為顯色液體積；n為分取倍數(shù)，浸出液體積吸取濾液體積；m表示烘干土重土壤蔗糖酶活性測(cè)定（3,5- 二硝基水楊酸比色法）一、原理蔗糖酶與土壤許多因子有相關(guān)性，如與土壤有機(jī)質(zhì)、氮、磷含

11、量，微生物數(shù)量及土壤呼吸強(qiáng)度有關(guān)，一般情況下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生成的還原糖與3,5- 二硝基水楊酸反應(yīng)而生成橙色的3-氨基-5-硝基水楊酸。顏色深度與還原糖量相關(guān)，因而可用測(cè)定還原糖量來(lái)表示蔗糖酶的活性。二、試劑1）酶促反應(yīng)試劑：基質(zhì)8%蔗糖，pH5.5磷酸緩沖液：1/15M磷酸氫二鈉（11.876g Na2HPO42H2O溶于1L蒸餾水中）0.5ml加1/15M磷酸二氫鉀（9.078g KH2PO4溶于1L蒸餾水中）9.5ml即成，甲苯2）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/mL） 預(yù)先將分析純葡萄糖置80烘箱內(nèi)約12小時(shí)。準(zhǔn)確稱取50mg葡萄糖于燒杯中，用蒸餾水溶解后，移至50

12、mL容量瓶中，定容，搖勻（冰箱中4保存期約一星期）。若該溶液發(fā)生混濁和出現(xiàn)絮狀物現(xiàn)象，則應(yīng)棄之，重新配制。 3）3,5- 二硝基水楊酸試劑（DNS試劑） 稱0.5g二硝基水楊酸，溶于20ml 2mol/LNaOH和50ml水中，再加30g酒石酸鉀鈉，用水稀釋定容至100ml（保存期不過(guò)7天）。三、操作步驟（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制分別吸1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于試管中，再補(bǔ)加蒸餾水至1mL，加DNS試劑3mL混勻，于沸水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5min（從試管放入重新沸騰時(shí)算起），取出立即泠水浴中冷卻至室溫，以空白管調(diào)零在波長(zhǎng)540nm處比色，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，

13、以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）土壤蔗糖酶測(cè)定稱取5 g土壤，置于50mL三角瓶中，注入15ml 8%蔗糖溶液，5ml pH 5.5磷酸緩沖液和5滴甲苯。搖勻混合物后，放入恒溫箱，在37下培養(yǎng)24h。到時(shí)取出，迅速過(guò)濾。從中吸取濾液1ml，注入50ml容量瓶中，加3ml DNS試劑，并在沸騰的水浴鍋中加熱5min，隨即將容量瓶移至自來(lái)水流下冷卻3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水楊酸而呈橙黃色，最后用蒸餾水稀釋至50ml，并在分光光度計(jì)上于508nm處進(jìn)行比色。（為了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的誤差，每一土樣需做無(wú)基質(zhì)對(duì)照，整個(gè)試驗(yàn)需做無(wú)土壤對(duì)照；如果樣品吸光值超過(guò)標(biāo)曲的最

14、大值，則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣。）四、結(jié)果計(jì)算：蔗糖酶活性以24h，1g干土生成葡萄糖毫克數(shù)表示。蔗糖酶活性=（a樣品a無(wú)土a無(wú)基質(zhì)）nma樣品、a無(wú)土、a無(wú)機(jī)質(zhì)分別表示其由標(biāo)準(zhǔn)曲線求的葡萄糖毫克數(shù)；n為分取倍數(shù)；m表示烘干土重土壤纖維素酶活性測(cè)定（3,5- 二硝基水楊酸比色法）一、原理纖維素是植物殘?bào)w進(jìn)入土壤的碳水化合物的重要組分之一。在纖維素酶作用下，它的最初水解產(chǎn)物是纖維二糖，在纖二糖酶作用下，纖維二糖分解成葡萄糖。所以，纖維素酶是碳素循環(huán)中的一個(gè)重要的酶。纖維素酶解所生成的還原糖與3,5- 二硝基水楊酸反應(yīng)而生成橙色的3-氨基-5-硝基水楊酸。顏色深度與還原糖量相關(guān)，因而可用

15、測(cè)定還原糖量來(lái)表示蔗糖酶的活性。二、試劑1）甲苯2）1%羧甲基纖維素溶液：1g 羧甲基纖維素鈉，用50%的乙醇溶至100ml。3）pH5.5醋酸鹽緩沖液：0.2mol/L 醋酸溶液 11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L.0.2mol/L 醋酸鈉溶液 16.4g C2H3O2Na或27.22g C2H3O2Na.3H2O溶至1L.取11ml 0.2mol/L 醋酸溶液和88ml 0.2mol/L 醋酸鈉溶液混勻即成PH 5.5醋酸鹽緩沖液.4）3,5-二硝基水楊酸溶液：稱1.25g二硝基水楊酸，溶于50ml 2mol/LNaOH和125ml水中，再加75g酒石酸鉀鈉，用水稀釋至250ml（保存

16、期不過(guò)7天），5）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/mL） 預(yù)先將分析純葡萄糖置80烘箱內(nèi)約12小時(shí)。準(zhǔn)確稱取50mg葡萄糖于燒杯中，用蒸餾水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，搖勻（冰箱中4保存期約一星期）。若該溶液發(fā)生混濁和出現(xiàn)絮狀物現(xiàn)象，則應(yīng)棄之，重新配制。三、操作步驟葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別吸1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL于試管中，再補(bǔ)加蒸餾水至1mL，加DNS溶液3ml混勻，于沸騰水浴中加熱5min，取出立即泠水浴中冷卻至室溫，以空白管調(diào)零在波長(zhǎng)540nm處比色，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 稱10g土壤置于50ml三角瓶中，加入1

17、.5ml甲苯，搖勻后放置15min，再加5ml 1%羧甲基纖維素溶液和5ml pH5.5醋酸鹽緩沖液，將三角瓶放在37恒溫箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束后，過(guò)濾并取1ml濾液，然后按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線顯色法比色測(cè)定。（為了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的誤差，每一土樣需做無(wú)基質(zhì)對(duì)照，整個(gè)試驗(yàn)需做無(wú)土壤對(duì)照；如果樣品吸光值超過(guò)標(biāo)曲的最大值，則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣。） 四、結(jié)果計(jì)算纖維素酶活性以72h，1g干土生成葡萄糖毫克數(shù)表示。纖維素酶活性=（a樣品a無(wú)土a無(wú)基質(zhì)）nma樣品、a無(wú)土、a無(wú)機(jī)質(zhì)分別表示其由標(biāo)準(zhǔn)曲線求的葡萄糖毫克數(shù)；n為分取倍數(shù)；m表示烘干土重過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定（高錳酸鉀滴定

18、法）一、原理過(guò)氧化氫廣泛存在于生物體和土壤中，是由生物呼吸過(guò)程和有機(jī)物的生物化學(xué)氧化反應(yīng)的結(jié)果產(chǎn)生的，這些過(guò)氧化氫對(duì)生物和土壤具有毒害作用。與此同時(shí)，在生物體和土壤中存有過(guò)氧化氫酶，能促進(jìn)過(guò)氧化氫分解為水和氧的反應(yīng)（H2O2 H2O+O2），從而降低了過(guò)氧化氫的毒害作用。土壤中過(guò)氧化氫酶的測(cè)定便是根據(jù)土壤（含有過(guò)氧化氫酶）和過(guò)氧化氫作用析出的氧氣體積或過(guò)氧化氫的消耗量，測(cè)定過(guò)氧化氫的分解速度，以此代表過(guò)氧化氫酶的活性。測(cè)定過(guò)氧化氫酶的具體方法比較多，如氣量法：根據(jù)析出的氧氣體積來(lái)計(jì)算過(guò)氧化氫酶的活性；比色法：根據(jù)過(guò)氧化氫與硫酸銅產(chǎn)生黃色或橙黃色絡(luò)合物的量來(lái)表征過(guò)氧化氫酶的活性；滴定法：用高錳酸

19、鉀溶液滴定過(guò)氧化氫分解反應(yīng)剩余過(guò)氧化氫的量，表示出過(guò)氧化氫酶的活性。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)采用高錳酸鉀滴定法。二、試劑2mol/L H2SO4溶液:量取5.43ml的濃硫酸稀釋至500ml，置于冰箱貯存;0.02mol/L高錳酸鉀溶液：稱取1.7g高錳酸鉀，加入400mL 水中，緩緩煮沸15min，冷卻后定容至500mL，避光保存，用時(shí)用0.1mol/L草酸溶液標(biāo)定；0.1mol/L草酸溶液：稱取優(yōu)級(jí)純H2C2O42H2O 3.334g,用蒸餾水溶解后，定容至250ml；3%的H2O2水溶液：取30% H2O2溶液25ml,定容至250ml，置于冰箱貯存，用時(shí)用0.1mol/L KmnO4溶液標(biāo)定。三、操作步驟分別取5g土壤樣品于具塞三角瓶中（用不加土樣的作空白