微生物實(shí)驗(yàn)內(nèi)容匯總

1、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),微生物學(xué)教研室,第一次 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,細(xì)菌基本形態(tài)觀察 （球菌、桿菌、螺形菌） 細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)觀察 （莢膜、鞭毛、芽胞） 革蘭染色法,1.細(xì)菌的三種基本形態(tài),球菌：葡萄球菌。 桿菌：大腸桿菌。 螺形菌：霍亂弧菌,細(xì)菌的三種基本形態(tài)示意圖,葡萄球菌,Figure 1 - A Gram stain of Gram + Staphylococcus cells,顯微鏡下的桿菌,桿菌(bacillus,Figure 2 - Gram stain of Gram - E. coli cells,弧菌,霍亂弧菌,Figure 3 - Gram stain of Gram Cholera cel

2、ls,2.細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)觀察,芽胞示教片：破傷風(fēng)桿菌。 鞭毛示教片：變形桿菌。 莢膜示教片：肺炎雙球菌,芽孢,產(chǎn)芽孢細(xì)菌的種類,菌體 （營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞,芽胞,破傷風(fēng)梭菌1000,鞭毛,變形桿菌鞭毛1000,莢膜的觀察,負(fù)染色,菌種】 齒垢 【試劑】 生理鹽水、結(jié)晶紫、碘液、95%乙醇、復(fù)紅 【材料】 酒精燈、接種環(huán)、玻片,3.革蘭氏染色法,由丹麥醫(yī)生Hans Christian Gram于1884年創(chuàng)立,操作步驟,1 min,1 min,30 s,1 min,濾紙吸干，油鏡觀察,結(jié)晶紫 1 碘液 1 95% 乙醇 30” 復(fù)紅 1 沖洗 濾紙干燥 油鏡觀察,沖洗,沖洗,沖洗,染色,初染,媒染,脫色,

3、復(fù)染,紫色（G,革蘭氏染色步驟示意圖,革蘭氏染色,甲菌,乙菌,初染,結(jié)晶紫,媒染,碘液,脫色,乙醇,復(fù)染,復(fù)紅,紫色（G,紅色（G,革蘭氏染色步驟示意圖,結(jié)果,細(xì)菌被染成紫色者，稱為革蘭氏陽(yáng)性菌； 而細(xì)菌染成紅色者，稱為革蘭氏陰性菌,陽(yáng)性菌紫色 陰性菌紅色,意義,鑒別細(xì)菌，用本法染色可將細(xì)菌分成兩大類。 了解致病性 指導(dǎo)選擇用藥,革蘭氏染色法的原理,革蘭氏染色法的原理尚未闡明，可能與以下因素有關(guān)。 1、通透性學(xué)說(shuō) 2、等電點(diǎn)學(xué)說(shuō) 3、化學(xué)學(xué)說(shuō),通透性學(xué)說(shuō),G+菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)含量少，乙醇不易進(jìn)入。 G-菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松，肽聚糖層薄，含大量脂質(zhì)，乙醇易滲入,等電點(diǎn)學(xué)說(shuō),G+菌等

4、電點(diǎn)（pI23） G-菌等電點(diǎn)（pI45） 在相同pH條件下G+菌所帶負(fù)電荷比G-菌多，所以與帶正電荷的結(jié)晶紫染料結(jié)合較牢固，不易脫色,化學(xué)學(xué)說(shuō),G+菌菌體內(nèi)含有大量核糖核酸鎂鹽，可與碘、結(jié)晶紫等染料牢固結(jié)合，使已著色的細(xì)菌不易被乙醇脫色 G-菌 菌體內(nèi)含核糖核酸鎂鹽很少，故易被脫色,注 意 事 項(xiàng),涂片的厚度。 固定的程度。 染色的時(shí)間控制：一一半一。 沖洗的方法，不要對(duì)著涂片區(qū)。 95% 乙醇脫色時(shí)間,第二次 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,一、細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備（示教） 二、細(xì)菌分離接種技術(shù)（操作） 平板劃線接種法；斜面培養(yǎng)基接種法 液體培養(yǎng)基接種法；半固體穿刺接種法 三、細(xì)菌在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)現(xiàn)象（觀察,一、

5、細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基制作,液體培養(yǎng)基制作 普通肉湯培養(yǎng)基成分： 新鮮牛肉浸液100ml，蛋白胨1g，NaCl 0.5g 稱量，包裝，滅菌后使用。 固體培養(yǎng)基制作 稱取營(yíng)養(yǎng)瓊脂4.5g，加入100ml蒸餾水中溶解。 包裝后滅菌使用。 斜面培養(yǎng)基制作,1、稱量及溶化,2、調(diào)pH,3、加瓊脂、溶化、定容、（過(guò)濾,4、分裝、加塞、包扎,5、滅菌,6、擺斜面,操作步驟,1. 半固體培養(yǎng)基接種法（操作） 2. 斜面培養(yǎng)基接種法 3. 液體培養(yǎng)基接種法,細(xì)菌的分離接種接技術(shù),一）分離培養(yǎng),1. 平板分離劃線接種法（操作,二）純培養(yǎng),平板分離劃線接種法,連續(xù)劃線法 分段劃線法,Rotate 90,Flame loo

6、p,Rotate 90,Flame loop,平板劃線接種法（分離培養(yǎng)法,培養(yǎng)結(jié)果,1,3,2,注意事項(xiàng),1.各區(qū)之間接種環(huán)要滅菌,2.用力適當(dāng)，不要?jiǎng)澠?瓊脂表面,3.注意無(wú)菌操作,斜面培養(yǎng)基接種法（操作,用途：常用于擴(kuò)大純種細(xì)菌及實(shí)驗(yàn)室保存菌種,液體培養(yǎng)基接種法,半固體培養(yǎng)基接種法（操作,方法：穿刺接種,結(jié)果：沿穿刺線生長(zhǎng)動(dòng)力- 擴(kuò)散生長(zhǎng)動(dòng)力,三、細(xì)菌在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)現(xiàn)象,沉淀成鏈生長(zhǎng) 渾濁均勻分散生長(zhǎng) 菌膜表面生長(zhǎng)（需氧菌,1. 固體,2. 半固體,3. 液體,菌落 菌苔,動(dòng)力+ 動(dòng)力,固體培養(yǎng)基生長(zhǎng)現(xiàn)象,液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)現(xiàn)象,沉淀生長(zhǎng),混濁生長(zhǎng),表面生長(zhǎng),半固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)現(xiàn)象,有鞭毛

7、動(dòng)力,無(wú)鞭毛 動(dòng)力,沿刺線生長(zhǎng),混濁生長(zhǎng),細(xì)菌在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)現(xiàn)象,第三次 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,一、細(xì)菌分布實(shí)驗(yàn) 空氣中細(xì)菌的檢查 皮膚、日常物品細(xì)菌的檢查 二、藥敏實(shí)驗(yàn),一、細(xì)菌的分布實(shí)驗(yàn),1）空氣細(xì)菌檢查 材料：培養(yǎng)基，普通瓊脂平皿 （2）皮膚（其他物品）消毒前后的細(xì)菌檢查 材料：培養(yǎng)基，無(wú)菌生理鹽水，75%酒精棉球， 2.5%碘酒棉球，無(wú)菌棉棒 （3）自來(lái)水中的細(xì)菌檢查 材料：培養(yǎng)基，無(wú)菌棉棒，酒精燈,1. 空氣中細(xì)菌的檢查,取三塊瓊脂平板，將2個(gè)打開皿蓋 分別置于不同的環(huán)境1530min后， 蓋好皿蓋。另外1個(gè)不啟蓋作為對(duì) 照。置37培養(yǎng)1824h,材料,普通瓊脂平板,方法,結(jié)果,計(jì)數(shù)菌落數(shù)，觀察

8、菌落數(shù)的差異,2、皮膚消毒前后的細(xì)菌檢查方法,在1個(gè)平皿底部做好標(biāo)記，分為消毒前與消毒后兩個(gè)區(qū)域。 取一支無(wú)菌棉簽放入無(wú)菌鹽水中浸泡，在管壁上擠干水后擦拭皮膚或其他物品，然后將該棉簽涂布于無(wú)菌平皿消毒前區(qū)域，作來(lái)回劃線，注意勿劃破瓊脂表面。 將皮膚區(qū)域或物品用碘酒棉球及酒精棉球涂擦消毒，另取一支無(wú)菌棉棒用消毒前所述方法取材，接種于標(biāo)有消毒后的平皿區(qū)域。 平皿37、24h培養(yǎng)后取出觀察表面有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，比較消毒前后菌落數(shù)目，描述菌落特征,結(jié)果,計(jì)數(shù)菌落數(shù),371824h,消毒前,消毒后,自來(lái)水中的細(xì)菌檢查,在1個(gè)平皿底部做好標(biāo)記。 用酒精燈對(duì)水管口滅菌，擰開水管開關(guān)放水15S。 取一支無(wú)菌棉簽蘸

9、取自來(lái)水，將該棉簽涂布于標(biāo)有消毒前的無(wú)菌瓊脂平皿表面，作來(lái)回劃線，注意勿劃破瓊脂表面。 將平皿于37、24h培養(yǎng)后取出觀察平皿表面有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，描述菌落特征,二、藥敏試驗(yàn)（紙片擴(kuò)散法,材料,方法,普通瓊脂平板(2塊平板/組） 大腸桿菌、金葡菌 氯霉素、青霉素、碘酒、結(jié)晶紫,G,G,步驟（無(wú)菌操作） 1、在培養(yǎng)基平皿上做標(biāo)記。 2、接種；用棉簽分別沾取菌液（G+，G-）均勻分別涂布于2個(gè)平皿上。 3、貼藥片；鑷子滅菌取藥片放置于平皿上的標(biāo)記 位置，再滅菌后可取另一藥片放置。 4、37，過(guò)夜培養(yǎng)，觀察結(jié)果,藥敏實(shí)驗(yàn)（紙片擴(kuò)散法,藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果,藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果,第四次 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,病原性球菌標(biāo)本片觀察 鏈

10、球菌、 腦膜炎雙球菌 血漿凝固酶試驗(yàn) 抗“O”試驗(yàn),目的要求,掌握病原性球菌的基本形態(tài)。 掌握藥敏實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)與判斷,鏈球菌,腦膜炎雙球菌,原理和意義 致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，使人或動(dòng)物血漿發(fā)生凝固，因此，測(cè)定血漿凝固酶的有無(wú)是鑒定葡萄球菌致病性的重要依據(jù),血漿凝固酶試驗(yàn),步驟,血漿 血漿,1,2,金葡 白葡,凝集（,不凝集（,血漿凝固酶試驗(yàn),生理鹽水,無(wú)菌操作,血漿凝集試驗(yàn)結(jié)果,鏈球菌侵入體內(nèi)產(chǎn)生SLO，刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體ASO，當(dāng)兩者中和后，再加入SLO 乳膠試劑，因病人血清中ASO量很多，未被中和掉的抗體與乳膠試劑反應(yīng)，產(chǎn)生清晰凝集，為陽(yáng)性；無(wú)凝集，為陰性。 方法：間接凝集 結(jié)

11、果：效價(jià)大于400單位 意義：風(fēng)濕熱及其活動(dòng)性的輔助診斷,抗“O”試驗(yàn)（ASO test,原理,步驟,抗“O”試驗(yàn)（ASO test,陰性對(duì)照（1滴） 待檢血清 （1滴） + + 膠乳試劑（1滴） 膠乳試劑（1滴,2min,2min,第五次 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,操作：肥達(dá)試驗(yàn) 肉毒梭菌、產(chǎn)氣莢膜菌標(biāo)本,肥達(dá)實(shí)驗(yàn),肥達(dá)試驗(yàn)（Widal test）是用已知的傷寒桿菌O、H抗原和甲、乙型副傷寒桿菌H抗原與病人血清做定量凝集試驗(yàn)，以測(cè)定患者血清中有無(wú)相應(yīng)抗體，根據(jù)抗體含量的多少以及增長(zhǎng)情況，可幫助診斷傷寒及副傷寒,原理,肥達(dá)反應(yīng)稀釋法示意表,肥達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷,血清的凝集效價(jià)（滴度）：是指能與一定量的抗原發(fā)生肉眼

12、可見(jiàn)的明顯凝集（即“+”凝集）的血清最高稀釋倍數(shù)。血清效價(jià)代表血清中抗體的含量，血清效價(jià)越高，所含抗體的量愈多,結(jié)果判斷,1、正常凝集效價(jià) 傷寒沙門菌“O”抗體凝集效價(jià)在1：80以下，傷寒沙門菌“H”抗體在1：160以下， 甲、乙型副傷寒沙門菌“H”抗體凝集效價(jià)在1：80以下。 2、病程中動(dòng)態(tài)觀察 二份血清，第二次效價(jià)增長(zhǎng)四倍以上有意義 3、O與H抗體在診斷上的意義,傷寒及副傷寒感染早期/交叉反應(yīng),傷寒及副傷寒感染晚期/預(yù)防接種/非特異性回憶反應(yīng),傷寒,甲型副傷寒,乙型副傷寒,接種傷寒及副傷寒三聯(lián)疫苗,非腸熱癥/早期用抗生素/免疫功能低下,3、O與H抗體在診斷上的意義,肉毒梭菌,產(chǎn)氣莢膜梭菌,

13、第六次 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,一、細(xì)菌染色標(biāo)本檢查法 抗酸染色法（操作） 二、標(biāo)本片觀察： （鉤端螺旋體 、白色念珠菌，曲霉、枯草桿菌,分枝桿菌的細(xì)胞壁內(nèi)含有大量的脂質(zhì)，主要是分枝菌酸，它包圍在肽聚糖的外面，所以分枝桿菌一般不易著色，要經(jīng)過(guò)加熱和延長(zhǎng)染色時(shí)間來(lái)促使其著色。但分枝桿菌中的分枝菌酸與染料結(jié)合后，就很難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色。 齊-尼氏抗酸染色法是在加熱條件下使分枝菌酸與石炭酸復(fù)紅牢固結(jié)合成復(fù)合物，用鹽酸酒精處理也不脫色。當(dāng)再加堿性美蘭復(fù)染后，分枝桿菌仍然為紅色，而其他細(xì)菌及背景中的物質(zhì)為蘭色,一、抗酸染色原理,抗酸染色,材料： 標(biāo)本：卡介苗 染液：石炭酸復(fù)紅，3%鹽酸酒精，美藍(lán) 器具：

14、同革蘭氏染色,實(shí)驗(yàn)方法： 1、細(xì)菌涂片標(biāo)本的制備 涂片 干燥 固定,3、油鏡觀察,1）初染：用玻片夾夾持涂片標(biāo)本，滴加石炭酸復(fù)紅2-3滴，在火焰高處徐徐加熱，切勿沸騰，出現(xiàn)蒸汽即暫時(shí)離開，若染液蒸發(fā)減少，應(yīng)再加染液，以免干涸，加熱3-5分鐘，待標(biāo)本冷卻后用水沖洗。 2）脫色： 3%鹽酸酒精脫色301；用水沖洗。 3）復(fù)染：用堿性美蘭溶液復(fù)染1，用水沖洗后用吸水紙吸干,2、染色,抗酸染色步驟,1、涂片包括涂片、干燥、固定三步。 涂片 干燥 固定,抗酸染色步驟,2、染色包括初染、脫色、復(fù)染三步,石炭酸復(fù)紅維持 3-5 3%鹽酸酒精30 1 美藍(lán)復(fù)染1 沖洗 干燥 油鏡觀察,沖洗,沖洗,初染,脫色,

15、復(fù)染,三、抗酸染色結(jié)果,抗酸菌呈紅色， 常堆積成團(tuán)， 排列無(wú)序， 偶呈分枝狀生長(zhǎng)。 背景及非抗酸性細(xì)菌呈蘭色,注意事項(xiàng),1、無(wú)菌操作 2、菌種管搖勻后取菌 3、涂片均勻 4、初染加熱維持35分鐘，勿沸騰燒干 5、冷卻后沖洗 6、油鏡下從視野中找紅色抗酸菌,二、標(biāo)本片觀察,白色念珠菌 鉤端螺旋體 枯草桿菌 曲霉,白色念珠菌,鉤端螺旋體,類炭疽（枯草桿菌,炭疽桿菌,曲霉,第七次 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,膿汁標(biāo)本中金黃色葡萄球菌的鑒定,實(shí)驗(yàn)器材,標(biāo)本：膿拭子、感染分泌物或模擬膿汁標(biāo)本 菌種：金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物、表皮葡萄球菌 培養(yǎng)基：血瓊脂平板、甘露醇發(fā)酵管 其他：血漿、生理鹽水、革蘭染液、玻片、滴管 培養(yǎng)箱、

16、酒精燈、接種環(huán)等,檢查原則,在膿汁標(biāo)本中，以化膿性球菌最為常見(jiàn)，本實(shí) 驗(yàn)主要檢測(cè)金黃色葡萄球菌 用藥前采集標(biāo)本 無(wú)菌操作,標(biāo)本檢測(cè)程序,膿汁、膿性分泌物（未知菌液/固體培養(yǎng)物,涂 片 革蘭染色 鏡 檢,血瓊脂平板,接種,直接,菌落觀察,血漿凝固酶試驗(yàn),甘露醇發(fā)酵,診斷報(bào)告,檢查方法和結(jié)果報(bào)告,直接顯微鏡檢查：取標(biāo)本直接涂片，均勻涂成菌膜，自然干燥，固定后革蘭染色，油鏡觀察。 注：若染色后未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌，可報(bào)告“直接鏡檢未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌,檢查方法和結(jié)果報(bào)告,細(xì)菌分離培養(yǎng)：取膿液或創(chuàng)傷分泌物接種于血瓊脂平板上（接種后4保存），劃線分離，37培養(yǎng)1824h后，觀察菌落特征，取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢。 注：第2天觀察記錄結(jié)果；如培養(yǎng)4872h后仍然無(wú)菌生長(zhǎng)，則報(bào)告“無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng),檢查方法和結(jié)果報(bào)告,血漿凝固酶試