氨基酸的分離鑒定—紙層析法

1、化學與生物工程學院生物工程系生物化學實驗報告課程名稱：生物化學實驗項目：氨基酸的分離鑒定一紙層析法實驗室名：生物化學實驗室實驗時間：2012-11-15任課老師：楊艷專業(yè)班級：生物工程1142學生姓名：髙曄學號：201121030219組別：第五組實驗內(nèi)容【實驗目的】通過氨基酸的分離，學習紙層析法的基本原理，掌握氨基酸紙層析的操作方法?！緦嶒炘怼考垖游龇ǎ╬aper chromatography）通常用于蛋白質(zhì)的氨基酸成分的定性和定量。1944年A . J P.馬丁第一次用紙層析分析氨基酸，得到很好的分離效果。到現(xiàn)在為止，紙層 析法已經(jīng)成為定性或定量測定多肽，核酸堿基，糖，有機酸，維生素，抗

2、生素等物質(zhì)的一 種最簡單易行的分離分析工具。層析用于分析簡單的混合物時可做單向?qū)游?。對于復雜的混合物，可做雙向?qū)游?。?原理是以濾紙為惰性支持物的分配層析，層析溶劑由有機溶劑和水組成。濾紙纖維上的羥 基具有親水性，吸附一層水作為固定相，有機溶劑為流動相。當有機相流經(jīng)固定相時，由 于分配系數(shù)不同，結(jié)果物質(zhì)在兩相間不斷分配而得到分離。其一般操作是將樣品溶解在適當溶劑中，點樣在濾紙的一端；再選用適當?shù)娜軇┫到y(tǒng)，從點樣的一端通過毛細現(xiàn)象向另一端展開，展開完畢，取出濾紙晾干或烘干，再以適當?shù)?顯色劑或紫外燈、熒光燈下觀察其圖譜。樣品經(jīng)展開后某一物質(zhì)在紙層析譜上的位置常用 比移值（rate of folw

3、, Rf）來表示。Rf=原點至層析斑點中心的距離 /原點至溶齊愉沿的距離 =X/Y在一定的條件下某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與被測物的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。本實驗利用單向紙層析法分離氨基酸。【實驗器材】1器材層析缸、毛細管、小燒杯、量筒、培養(yǎng)皿、分液漏斗、層析濾紙（新華一號）、噴霧器（或白瓷盤），烘箱（或吹風機）、鉛筆、直尺2試劑1）、擴展劑40mL 將20 mL水飽和的正丁醇和 5 mL醋酸以體積比4: 1在分液漏斗中進行混合。然后與 15mL蒸餾水混合，充分振蕩，靜置后分層，放出下層水層。取漏 斗內(nèi)的擴展劑約5mL置于小燒杯中做平衡溶劑，其余的倒

4、人培養(yǎng)皿中備用。2）、氨基酸溶液0. 5 %的賴氨酸、脯氨酸、亮氨酸溶液及它們的混合液（各組份濃度均為0. 5%）各配置5mL。3）、顯色劑50100mL 0. 1 %水合茚三酮正丁醇溶液。【實驗步驟】(1)檢查培養(yǎng)皿是否干燥、潔凈；若否，將其洗凈并置于干燥箱內(nèi)120C烘干。(2)平衡：剪一大塊塑料薄膜鋪在桌面上，將層析缸或大燒杯到置于塑料薄膜上，再把盛有約5mL展層溶液的小燒杯置于倒置的層析缸或大燒杯中，用塑料薄膜密封起來， 平衡20min。(3 )規(guī)劃：帶上手套，取寬約 10cm、高約15cm的層析濾紙一張。在紙的下端距邊緣23 cm處輕輕用鉛筆劃一條平行于底邊的直線A，在直線上做4個記號

5、，記號之間間隔2cm,B兩線的交點為原點標明刻度(以厘米為單位)，參見下圖。圖2實驗裝置示意圖(4) 點樣：用毛細管分別取 10mL左右的氨基酸樣品點在四個位置上。干后重復點樣，同一位置上需點 23次，23mL/次，保證每點在紙上擴散的直徑最大不超過3mm。其中3個是已知樣，1個是待測樣品。(5) 層析：用針、線將濾紙縫成筒狀，紙的兩側(cè)邊緣不能接觸且要保持平行，參見圖1-1。向培養(yǎng)皿中加入擴展劑，使其液面高度達到1cm左右，將點好樣的濾紙筒直立于培養(yǎng)皿中(點樣的一端在下，擴展劑的液面在A線下約1cm),罩上大燒杯，仍用塑料薄膜密封。當擴展劑上升到 A線時開始計時，每隔一定時間測定一下擴展劑上升

6、的高度，填入表1中。當上升到1518cm，取出濾紙，剪斷連線，立即用鉛筆描出溶齊U前沿線，自然風干或用 電吹風熱風吹干。(6) 顯色：用噴霧器在通風廚中向濾紙上均勻噴上0.1%茚三酮正丁醇溶液， 然后置烘箱 中烘烤5分鐘(100 C)或用熱風吹干即可顯出各層析斑點。(7) 計算各種氨基酸的 Rf值，并判斷混合樣品中都有哪些氨基酸，各人將自己的實驗結(jié) 果貼在實驗報告上，見表 2。(8) 以層析時間為橫坐標，擴展劑上升高度為縱坐標畫圖，求出擴展劑上升到15cm時 所需要的時間?！緦嶒灲Y(jié)果與數(shù)據(jù)處理】表1擴展劑前沿上升速度X （ min）0510152030406090Y（ cm）00.81.52.

7、153.754.855.97.98.8815表2各種氨基酸的Rf值賴氨酸脯氨酸亮氨酸待測氨基酸原點到層析斑點中心的距離0.110.430.700.44原點到溶齊U前沿的距離0.880.880.880.88Rf0.120.480.790.50判斷待測氨基酸賴氨酸、脯氨酸、亮氨酸【實驗結(jié)論】通過實驗可以知道每種氨基酸的在擴展劑中的移動速率是不相同的，利用每種氨基酸在紙上的位置不同可以計算出氨基酸的Rf值。和標準的Rf值對比，得出氨基酸種類。據(jù)此由上表2可知，混合氨基酸是由賴氨酸、脯氨酸、亮氨酸組成。【注意事項】點樣時要避免手指或唾液等污染濾紙有效面（即展層時樣品可能達到的部分 ）。點樣斑點不能太大，防止層析后氨基酸斑點過度擴散和重疊，且點樣后吹風溫度不宜過高，以免樣品變性（斑點發(fā)黃）。展層開始時切勿使樣品點浸入溶劑中。展層劑要臨用前配制，以免發(fā)生酯化，影響層析結(jié)果。Rf值十分接近時，單如果樣品中溶質(zhì)種類較多，且某些溶質(zhì)在某一溶劑系統(tǒng)中的向?qū)游龇蛛x效果不佳，則可采用雙向?qū)游?，即將樣品點在一方形濾紙的角上，先用一種溶劑系統(tǒng)展層。濾紙取出干燥后，再