植物基因轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植物的分析與鑒定

1、植物基因轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植物的分析與鑒定實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 了解創(chuàng)建煙草突變體庫的方法；2 理解每種方法的基本原理；3 掌握農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法以及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物篩選和鑒定的基本過程。實(shí)驗(yàn)原理隨著越來越多植物的全基因組測序工作的完成，在此基礎(chǔ)上開展功能基因組的研究是目前的核心研究內(nèi)容之一。植物插入突變體庫的建立是功能基因組研究的一個(gè)重要內(nèi)容，在此基礎(chǔ)上也能進(jìn)行正向遺傳學(xué)及反向遺傳學(xué)的研究。在創(chuàng)制突變體的策略上，傳統(tǒng)方法是使用物理或化學(xué)誘變方法獲得，其優(yōu)點(diǎn)是可在盡可能短的時(shí)間內(nèi)獲得飽和突變體。與傳統(tǒng)的物理和化學(xué)誘變方法相比，生物誘變(T-DNA和轉(zhuǎn)座子插人誘變)通?？蓸?biāo)記突變基因，從而較為容易地分離鑒定靶基因

2、。最近數(shù)年，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA插入突變已成為國際公認(rèn)的植物功能基因組學(xué)的主要研究方法之一。煙草是植物基因組研究的一種模式植物，其突變體庫的創(chuàng)建是煙草功能基因組學(xué)研究中的重要內(nèi)容，其目的是通過大規(guī)模的突變體庫平臺(tái)快速全方位的了解基因組中各個(gè)基因的功能。突變體的創(chuàng)制是遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)，也是分離基因和基因功能鑒定的最要途徑。通過誘導(dǎo)培養(yǎng)，使煙草產(chǎn)生愈傷組織，利用土壤農(nóng)桿菌感染愈傷組織，實(shí)現(xiàn)T-DNA標(biāo)簽在煙草愈傷組織基因組中大量隨機(jī)插人，利用植物細(xì)胞的全能性，經(jīng)過抗性篩選，誘導(dǎo)分化，從抗性愈傷組織獲得煙草突變體再生植株，獲得各突變體的純合材料，從而建立煙草突變體的數(shù)據(jù)庫，然后分析突變性狀與T

3、-DNA的共分離關(guān)系，存在共分離的材料用適當(dāng)?shù)腡ail-PCR克隆技術(shù)獲得T-DNA的側(cè)翼基因組序列，用其作探針篩選基因文庫，獲取目標(biāo)基因或克隆，再進(jìn)行下一步的分析（圖實(shí)驗(yàn)4-1）。T-DNA 載體構(gòu)建轉(zhuǎn)化植物（T1，T-DNA雜合子)收獲T2種子篩選T2，獲突變子，應(yīng)為3:1分離確定T-DNA與突變型共分離的個(gè)體產(chǎn)生純合后代克隆T-DNA兩側(cè)的植物DNA（Tail PCR)利用側(cè)翼DNA序列作探針從該植物的cDNA文庫中釣取基因基因功能的驗(yàn)證（遺傳互補(bǔ)測驗(yàn)，分離的野生基因轉(zhuǎn)化突變體，回復(fù)功能）圖實(shí)驗(yàn)4-1 T-DNA標(biāo)簽克隆基因的基本流程TAIL-PCR分離法是利用多個(gè)嵌套的T-DNA插入序

4、列特異性引物（根據(jù)T-DNA中靠近右邊界處的核苷酸序列設(shè)計(jì)的引物，Tm值57-62和一個(gè)短的隨機(jī)簡并引物（AD，Tm值44-46）組合，以突變體基因組DNA為模板，進(jìn)行多次PCR反應(yīng)，采取高溫特異性擴(kuò)增與低溫隨機(jī)擴(kuò)增相間進(jìn)行的方法，最后獲得T-DNA插入側(cè)翼區(qū)特異性擴(kuò)增片段（實(shí)驗(yàn)圖4-2），可作為探針，篩選分離基因。 TAIL-PCR分離法可以降低非側(cè)翼區(qū)特異產(chǎn)物的背景，同時(shí)它可以產(chǎn)生2個(gè)以上嵌套的目的片段，與其它方法相比TAIL-PCR方法具有簡便、特異、高效、快速和靈敏等特點(diǎn)，已經(jīng)在擬南芥和水稻等植物中獲得了成功及廣泛的應(yīng)用。 實(shí)驗(yàn)圖4-2 TAIL-PCR反應(yīng)流程圖 本實(shí)驗(yàn)用含T-DNA

5、載體質(zhì)粒pCAMBIA1301的LBA4404農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)染煙草愈傷組織，讓T-DNA隨機(jī)插入煙草的基因組中形成T-DNA突變體，通過PCR特異擴(kuò)增HPT基因片段來鑒定轉(zhuǎn)基因煙草， 以TAIL-PCR法獲得轉(zhuǎn)基因煙草突變體的側(cè)翼基因片段，測序后將獲得側(cè)翼基因片段的序列與GeneBank中的已知序列對比，獲得功能基因的全序列。儀器、材料和試劑（一）儀器高速冷凍離心機(jī)，PCR儀，超凈工作臺(tái)，恒溫?fù)u床，隔水式恒溫培養(yǎng)箱，光照培養(yǎng)箱，紫外可見分光光度計(jì)，凝膠成象儀或Dark Reader，恒溫水浴鍋，微孔加熱器，電泳儀，水平板電泳槽，天平，酸度計(jì)，旋渦混合器。（二）材料煙草幼苗，含T-DNA載體質(zhì)粒p

6、MD83rc的LBA4404農(nóng)桿菌菌株，Ex-taq DNA 聚合酶，DNA 1kb laddeer，GoldView核酸染料。（三）試劑1. 2CTAB提取液 100mmol/L Tris-HCl pH8.0 2（w/v）CTAB 1.4mol/L NaCl 40mmol/L b-巰基乙醇 20mmol/L EDTA2. TE緩沖液10mmol/L Tris-HCl pH8.01mmol/L EDTA3. 50TAE電極緩沖液 1000mlTris 54g 硼酸 27.5g 0.5mol/L EDTA 20ml4. 10次氯酸鈉5. 氯仿：異戊醇(V:V，24：1)6. 70乙醇7. 溶液I

7、：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris.HCl（pH8.0），10 mmol/L EDTA（pH8.0）100ml8. 溶液III：60ml 5mol/L乙酸鉀，11.5ml 11.5冰乙酸，28.5ml無菌水100ml9. 溶液II：分別配制0.4 mol/L NaOH和2SDS溶液（各30ml），用時(shí)1:1混合10. LB液體培養(yǎng)基 配制每升培養(yǎng)基，應(yīng)在950mL去離子水中加入： 胰蛋白胨(bacto-typtone) 10g 酵母提取物(bacto-yeast extract) 5g NaCl 10g搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)完全溶解，加入200uL 5mol/L NaOH調(diào)節(jié)p

8、H至7.0，加入去離子水至總體積為1升，121高壓滅菌20分鐘。11. MS基本培養(yǎng)基 大量元素 mg/L 微量元素 mg/L 有機(jī)營養(yǎng) mg/L NH4NO3 1650 KI 0.83 甘氨酸 2.0 KNO3 1900 H3BO3 6.2 煙酸 0.5 CaCl22H2O 440 MnSO44H2O 22.3 鹽酸吡哆醇（Vb6） 0.5 MgSO47H2O 370 ZnSO47H2O 8.6 鹽酸硫胺素（Vb1） 0.l KH2PO4 170 NaMoO42H2O 0.25 肌醇 100 CoCl26H2O 0.025 CuSO45H2O 0.025 FeSO47H2O 27.8 配制方

9、法母液：大量元素（50） 400mL硝酸銨 33g；硝酸鉀 38g；磷酸二氫鉀 3.4g；七水合硫酸鎂 7.4g；鐵元素（100） 200mL七水合硫酸亞鐵 0.556g；七水合EDTA二鈉 0.746g；有機(jī)營養(yǎng)（100） 200mLGly 0.040g；VB1 0.002g；VB6 0.010g；肌醇 2g；煙酸 0.010g；微量元素（1000） 200mL碘化鉀 166mg；硼酸 1240mg；一水合硫酸錳 3380mg；七水合硫酸鋅 1720mg；二水合鉬酸鈉 44mg；五水合硫酸銅 5mg；六水合氯化鈷 5mg；氯化鈣（50） 400mL 氯化鈣8.8g12. 愈傷組織誘導(dǎo)與分化培

10、養(yǎng)基：MS基本培養(yǎng)基 0.2mg/L 6-BA0.02mg/L NAA 3%蔗糖 0.6%瓊脂其中6-BA 取25mg用少量1M NaOH溶解后定容到50mL； NAA取25mg用少量1M NaOH溶解后定容到50mL； 2,4-D取50mg用少量1M NaOH溶解后定容到100mL；以上激素母液均為0.5mg/mL13. 篩選培養(yǎng)基：MS基本培養(yǎng)基0.2mg/L 6-BA 0.02mg/L NAA3%蔗糖0.6%瓊脂100mg/L羧芐青霉素14. 抗生素母液的配制KANA（50mg/mL） 1g KANA溶于20mL蒸餾水；RIF（50mg/mL） 0.25g RIF溶于少量乙醇再定容至50

11、mL；STR（30mg/mL） 0.6g STA溶于20mL蒸餾水；羧芐青霉素（100mg/mL） 2g羧芐青霉素溶于20mL蒸餾水。潮霉素B（50mg/mL） 可以直接購買實(shí)驗(yàn)步驟I 煙草外植體的無菌培養(yǎng)和誘導(dǎo)再生1. 煙草葉片預(yù)培養(yǎng)： 取煙草完全展開的幼葉，用自來水洗凈晾干。在超凈工作臺(tái)中將葉片浸于70酒精中30秒，然后移入10的次氯酸鈉溶液中510分鐘（消除外植體表面的微生物）。無菌水至少洗滌3次（消毒液對外植體有很大傷害，必須清洗干凈），每次停留35min。將無菌葉片剪成0.5cm0.5cm大小塊或用 6mm打孔器鑿成圓盤。2. 煙草葉片的誘導(dǎo)再生：自行設(shè)計(jì)MS培養(yǎng)基中的NAA、6-B

12、A植物激素濃度，誘導(dǎo)煙草葉片生根或生芽；將上述處理過的無菌葉片接種在含有不同濃度植物激素的MS固體培養(yǎng)基中，每周定期觀察并更換培養(yǎng)基。II 轉(zhuǎn)基因煙草的培養(yǎng)1. 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)：將含T-DNA載體的農(nóng)桿菌單菌落接種到20ml LB液體培養(yǎng)基中（Kana 50ug/ml、RIF、STR）， 27，180rmin振搖培養(yǎng)過夜。將2ml菌液轉(zhuǎn)入20ml LB液體培養(yǎng)基中，與上述的相同條件培養(yǎng)6小時(shí)左右，使菌液達(dá)到OD6000.20.5，用來侵染煙草葉片 。2. 煙草葉片預(yù)培養(yǎng)： 取煙草完全展開的幼葉，用自來水洗凈晾干。在超凈工作臺(tái)中將葉片浸于70酒精中30秒，然后移入10的次氯酸鈉溶液中510分鐘（消

13、除外植體表面的微生物）。無菌水至少洗滌3次（消毒液對外植體有很大傷害，必須清洗干凈），每次停留35min。將無菌葉片剪成0.5cm0.5cm大小塊或用 6mm打孔器鑿成圓盤。3. 愈傷組織轉(zhuǎn)化：在80r/min搖床上旋轉(zhuǎn)浸染510分鐘。將葉外植體置于無菌濾紙上吸去多余的菌液（如果葉片粘附細(xì)菌過多，可以在無菌水中漂洗12次）。4. 共培養(yǎng)：將侵染過菌液的葉片接種在MS愈傷組織誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基上，在26黑暗條件下共培養(yǎng)3天。5. 篩選培養(yǎng)與分化：將共培養(yǎng)處理的煙草葉片轉(zhuǎn)移到凝固后的篩選培養(yǎng)基上（100ug/L羧芐青霉素和50ug/L潮霉素B，羧芐青霉素起到抑制農(nóng)桿菌生長的作用。如果農(nóng)桿菌生長未被抑

14、制，農(nóng)桿菌將抑制葉外植體的生長）。每隔34天繼代一次，培養(yǎng)條件為，光照2000lx，溫度26，日照16h。4周后轉(zhuǎn)基因細(xì)胞分裂生長形成大量愈傷組織并有根、芽分化。接種煙草葉片于無激素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，同時(shí)作為對照實(shí)驗(yàn)（無愈傷組織生長和器官分化）。 轉(zhuǎn)基因煙草的檢測1. 剪取培養(yǎng)后的轉(zhuǎn)化煙草和前期實(shí)驗(yàn)未轉(zhuǎn)基因煙草葉片小片，液氮中研磨至粉末狀，加入0.5mL65預(yù)熱CATB抽提液65水浴抽提30min，間歇混勻；2. 取上清各加入0.5mL氯仿異戊醇（體積比24:1）去除蛋白，12000rpm離心10min；3. 取上清加入1體積預(yù)冷異丙醇至-20出沉淀3060min，8000rp

15、m離心15min；4. 棄上清，70%乙醇洗滌2次干燥，避光保存；5. 加入15L蒸餾水溶解并電泳檢測（0.7%瓊脂糖凝膠電泳）；6. 提取pMDC83rc質(zhì)粒：（1）3-5ml過夜菌12000rpm離心1min，棄上清；（2）加300L預(yù)冷溶液I，顛倒混勻6-8次；（3）加300l新鮮不預(yù)冷溶液II，顛倒混勻6-8次；（4）加300l預(yù)冷溶液III，顛倒混勻6-8次；（5）12000 rpm 15min，轉(zhuǎn)移上清液；（6）加入0.5倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置3min，如上離心12min；（7）棄上清，70%乙醇洗沉淀；（8）空氣干燥，20ml 蒸餾水溶解，-20貯存。7. 對提出的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；引物和擴(kuò)增體系同上述的PCR步驟；GFP引物GFP-F: 5- GCGGCGATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3， GFP-R: 5-TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTG-3（1）在0.2mlPCR管中，按照下表配制PCR反應(yīng)體系（25L）。無菌水10PCR BufferdNTP MixtureGFP-FGFP-REx-Taq 模板DNA14.2 ul2.5L1L0.5L0.5L0.3L1 ul（