最新紙片法抗菌藥物敏感實驗操作標(biāo)準(zhǔn)（精品課件）

1、紙片法抗菌藥物敏感實驗操作標(biāo)準(zhǔn)紙片法抗菌藥物敏感實驗操作標(biāo)準(zhǔn).3 標(biāo)準(zhǔn)比濁管 用硫酸鋇比濁管(0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn))，標(biāo)定接種菌液濃度。比濁管制備方法如下:(1）。48mol/L BaCl2，(17wvBaCl22HO)05ml,加到9.5的0.18molL(036N)H2S（1/v）溶液中,制成比濁管；（2）用光徑為c的分光光度計測定光吸收來標(biāo)定比濁管.0。5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管在2m波長的吸收光度應(yīng)為。08-1;(）選管徑與制備菌液試管相同的螺口試管，每管分裝m;(4）將試管帽擰緊，放室溫暗處保存；（)用前,將比濁管在旋轉(zhuǎn)振蕩器上混勻。如出現(xiàn)大顆粒，應(yīng)更換；（6）每個月更換比濁管或復(fù)檢比濁管的濁度

2、。 操作步驟51 制備接種菌液5.1。1 增菌法 步驟如下：（1）選瓊脂平板上形態(tài)相同的菌落至少5個，用接種環(huán)挑其頂部，移至ml肉湯或大豆酪蛋白消化液中；(2)置35培養(yǎng)至菌液濃度達到或超過比濁管濃度（一般需2-6小時）,濃度約12108C/ml；(3）用生理鹽水或肉湯校正菌液濃度,與比濁管相同?？捎霉怆姳葷?。目測比濁須在適當(dāng)光照下以黑色線條為反襯。5。1。2 直接菌懸液法 步驟如下：(1）做常規(guī)藥敏試驗,可直接用過夜培養(yǎng)的菌落（必須用無選擇性培養(yǎng)基平板，如普通瓊脂培養(yǎng)基)在鹽水或肉湯中制備接種菌液。菌液濃度調(diào)至0麥?zhǔn)瞎?；?)此法適用于在肉湯培養(yǎng)基中生長不好的細菌如嗜血桿菌、淋病奈瑟氏菌和鏈

3、球菌及葡萄球菌的甲氧苯青霉素或苯唑青霉素的耐藥試驗；（3）當(dāng)用此法做復(fù)方磺胺藥的試驗時,從平板上直接挑菌落時會攜帶相當(dāng)量的拮抗劑，造成敏感菌株的抑菌環(huán)內(nèi)出現(xiàn)輕微的生長菌膜。2接種平板 步驟如下：(1）校正的菌液須在5分鐘內(nèi)使用。用一無菌棉試子蘸取菌液并在上端管壁旋轉(zhuǎn)擠壓幾次，去掉過多的菌液;（2)用試子涂布整個瓊脂平板表面,反復(fù)涂布幾次，每次將平皿旋轉(zhuǎn)0度，保證涂布均勻。(3）將平皿蓋打開35分鐘，使培養(yǎng)基表面的水份吸收掉。然后貼藥敏紙片；(4）注意：避免用過濃的菌液,禁用未經(jīng)稀釋菌或其他不標(biāo)準(zhǔn)菌液接種平板。5.3 貼紙片 (1）接種平板后，貼上藥敏紙片.用鑷子或針尖壓一下紙片使其與培養(yǎng)基表面

4、貼牢。紙片要貼得均勻,紙片與紙片中心距離不得小于4mm。原則上,直徑0m得平板貼12張紙片,直徑10mm平板貼5張紙片。紙片貼后不應(yīng)再移動,因為有些藥物會立即擴散;(2）貼上紙片5分鐘內(nèi)，須把平板倒放在35恒溫箱中。因為抑菌環(huán)解釋標(biāo)準(zhǔn)是在普通環(huán)境中標(biāo)定的，所以除嗜血桿菌和淋病奈瑟氏菌外，平板不可放在高2的環(huán)境中。CO與某些因素作用可使抑菌環(huán)增大。5. 讀取結(jié)果（1)經(jīng)1618小時培養(yǎng)后，觀察結(jié)果。菌液濃度適合且涂得好,抑菌環(huán)規(guī)則，細菌呈融合生長。如果出現(xiàn)單個菌落，說明接種量小,需重做試驗，測量抑菌環(huán)直徑須包含紙片直徑：手持平皿從背面目測檢查每塊平板,借反射光(黑色無放光背景）,用卡尺、普通尺或

5、特制的模板量取抑菌環(huán)直徑，單位為毫米。培養(yǎng)基中如果加了血液，須打開平皿蓋,借反射光，從正面量抑菌環(huán)。如果是葡萄球菌或腸球菌，須培養(yǎng)2小時后，經(jīng)投射光檢查苯唑青霉素和萬古霉素的抑菌環(huán)內(nèi)有無耐藥菌株的生長.抑菌環(huán)內(nèi)有任何生長的表現(xiàn)都表明是耐藥菌株。（2）肉眼見不到細菌明顯生長的區(qū)域為抑菌環(huán)邊緣,有很難辨認(rèn)的細小菌落不算。如抑菌環(huán)內(nèi)有大量細菌生長,須再移植出來，重新鑒定，重新做藥敏試驗。變形菌在某些抗菌藥物紙片周圍可彌漫生長到抑菌的區(qū)域內(nèi),當(dāng)抑菌環(huán)邊緣清楚,彌漫生長不算。甲氧芐氨嘧啶和磺胺藥的拮抗劑會支持細菌生長，因而測這類藥時可忽略輕微生長（80以上受抑制），以濃密生長的區(qū)域作為抑菌環(huán)的界限。用加

6、血的培養(yǎng)基測鏈球菌，測量抑菌環(huán)時不包括溶血環(huán).（）參照表2的標(biāo)準(zhǔn)對抑菌環(huán)的大小作出解釋，以敏感、中介或耐藥的形式解釋結(jié)果. 嬌嫩細菌 uellr-Hiton培養(yǎng)基只適用于快速生長的細菌，一般不適于測定嬌嫩細菌。嬌嫩細菌的藥敏試驗如果要用紙片法做，培養(yǎng)基、質(zhì)量控制方法、解釋標(biāo)準(zhǔn)都須做修改以適合每種細菌。以下介紹的紙片方法用于流感嗜血桿菌,淋病奈瑟氏菌和肺炎鏈球菌等嬌嫩細菌,結(jié)果是準(zhǔn)確的.其他細菌須用稀釋法測定。厭氧菌不能用紙片擴散法測定抗菌藥物敏感性。結(jié)果解釋.1 抑菌環(huán)解釋標(biāo)準(zhǔn) 抑菌環(huán)解釋標(biāo)準(zhǔn)見表、A、2B和2C。表中所列的敏感類別首先是經(jīng)過將抑菌環(huán)直徑與肉湯或平板稀釋法測定的最低抑菌濃度（M

7、IC)進行比較,并且根據(jù)已知敏感和抗菌株的抑菌環(huán)或IC的群體分布得出的。然后再結(jié)合MIC與抑菌環(huán)直徑的相關(guān)分布，結(jié)合藥物常用劑量的臨床藥物代謝動力學(xué)關(guān)系進行分析。最終還要結(jié)合臨床的治療效果對體外試驗和藥理的數(shù)據(jù)做綜合評價。8。2 敏感度分級8。1敏感 表示被測菌株所引起的感染可以用該抗菌藥物的常用劑量治療有效。禁忌癥除外.8. 中介 指MC接近藥物的血液濃度或組織液濃度療效低于敏感菌。還表示被測菌株可以通過提高劑量（如-內(nèi)酰胺類藥物）被抑制，或在藥物生理性濃集的部位（如尿液)被抑制。另外，中介還表示“緩沖域，以防止由微小的技術(shù)因素失控，所導(dǎo)致較大的錯誤解釋(如某菌種極少對某藥物敏感或抑菌環(huán)完全

8、不會在此測定范圍內(nèi)，或培養(yǎng)基的差異影響了藥物，或藥物的中毒界限很窄）。8.2。3 耐藥 被測菌定為耐藥是指該菌不能被抗菌藥物的常用劑量在組織液內(nèi)或血液中所達到的濃度所抑制，或?qū)儆诰哂刑囟退帣C理(如內(nèi)酰胺酶），所以臨床治療效果不佳。8。與敏感度相關(guān)的MIC分界點 抑菌環(huán)直徑與用標(biāo)準(zhǔn)方法（一般指肉湯稀釋法）測得的MI呈負相關(guān)。表2,A,2B和C列出與抑菌環(huán)敏感度分界點相關(guān)的MIC分界點.這些與抑菌環(huán)直徑相對應(yīng)的MIC分界點是根據(jù)抑菌環(huán)和MIC相關(guān)性的研究，以及藥物代謝動力學(xué)和臨床療效的分析，并且與NL M7標(biāo)準(zhǔn)（Mthodsfr Diluion Antimicrobia Suptibiity e

9、ss fo Bacteria that Grw Aerobically）所定的MIC分界點相似得出的。然而，由于方法學(xué)上和原始數(shù)據(jù)方面的差異，會存在偶然的細小差別。9 質(zhì)量控制方法9。 目的 質(zhì)控的目的是監(jiān)測以下幾個方面：（1）藥敏試驗操作的精確度與準(zhǔn)確度。（2）試驗中試劑的情況。（3）操作者的工作情況.使用遺傳上穩(wěn)定的參考菌株即可達到上述目的。9. 質(zhì)控菌株 為了控制藥敏試驗的精確度和準(zhǔn)確度，須從可靠來源獲得指控菌株。質(zhì)控菌株如下:（1）大腸埃希氏菌 ACC 2922 ，（2）大腸埃希氏菌 ATCC 5，(）綠膿假單胞菌 ACC 275,（4)金黃色葡萄球菌 ATC 25923,(5)糞腸球

10、菌 ATC 222，（）流感嗜血桿菌C47（用于表3A的HM）,（）流感嗜血桿菌 ATCC 9766（用于表3A的HTM）,（8)淋病奈瑟氏菌ATC 4226(用于表B的瓊脂),（9）肺炎鏈球菌 CC 49(用于表C的羊血M瓊脂）。 大腸埃希氏菌AT 5218僅用于-內(nèi)酰胺酶抑制劑合劑的質(zhì)控.糞腸球菌AT 9212(或TC 3386)用于測試培養(yǎng)基中磺胺抑制劑的水平.糞腸球菌ATCC 29212還用于高濃度慶大霉素紙片的質(zhì)控。 質(zhì)控菌株測試和保存方法如下: （1）須用與臨床分離菌所用相同的抗生素測試質(zhì)控菌株。 (2)日常用的質(zhì)控菌株在大豆酪蛋白消化液瓊脂（MH瓊脂)上（普通菌株）或強化的巧克力

11、瓊脂上（嬌嫩細菌)4-8保存，每周傳代一次，如具備有長期保存的條件最好長期保存。用適當(dāng)?shù)谋Ｗo劑，如5%小牛血清肉湯或脫纖維羊血,在-20以下保存.以上方法都不會改變細菌的抗菌藥物敏感性。 （3）日常使用的質(zhì)控菌株應(yīng)至少一個月更換一次，由凍干保存菌種移種或購買新菌種。 （)測定時，先將菌種接種肉湯,孵育48小時，然后劃種平板，得到單個菌落. （）按推薦的方法,挑取菌落，制備接種菌液。 (6）用這種質(zhì)控菌株測出的抑菌環(huán)平均值如未出現(xiàn)明顯差異，該菌株就可以繼續(xù)用來監(jiān)測準(zhǔn)確度和精確度。如平均直徑有明顯改變，且該差異不可能是由方法學(xué)造成的,表示質(zhì)控菌株污染或敏感性發(fā)生變異，此時應(yīng)更換新菌株。3抑菌環(huán)質(zhì)量

12、控制界限 表3,3,3B和3C列出了一個質(zhì)控結(jié)果允許出現(xiàn)的最大和最小抑菌環(huán)直徑。一般情況下，每20個測定結(jié)果只允許有一個失控(即,超出列表中所列的準(zhǔn)確度控制范圍）。0個連續(xù)測定中任何多于一個以上的失控結(jié)果都必須對操作進行修正(如，一旦出現(xiàn)第二個失控結(jié)果,馬上修正）.另外,如果一個質(zhì)控結(jié)果超過質(zhì)量控制界限范圍中間值上下四個標(biāo)準(zhǔn)差范圍時也必須進行修正。修正后，繼續(xù)觀察連續(xù)20次測定的結(jié)果。 注意:本節(jié)指的是失控情況下如何處理，務(wù)必不要與在實驗條件穩(wěn)定時所進行的一周一次的質(zhì)量控制項混淆(見9。3節(jié)）。9。4 質(zhì)控測定的次數(shù) 每批新的H瓊脂或新的抗菌藥物紙片必須用質(zhì)控菌株檢測。質(zhì)控菌株每天與常規(guī)工作一

13、起測定，來檢測整個操作過程。只有在實驗結(jié)果合乎要求后，才能減少檢測次數(shù)。通過以下幾個方面可以判斷實驗是否符合要求。(1）同常規(guī)標(biāo)本一起連續(xù)測定質(zhì)控菌株0天。（）每種藥物對每種細菌，0個抑菌環(huán)中（如一個藥物對一種細菌的連續(xù)30天測定結(jié)果）,超出表3所給的范圍的應(yīng)不多于3個。 注意:本過程是為了建立穩(wěn)定的制片擴散法藥敏試驗的質(zhì)量控制方法,以達到最終可以進行每周監(jiān)測一次的目的，務(wù)必不要與93節(jié)中有關(guān)失控進行修正的措施相混淆. 達到以上要求,以后每周至少應(yīng)測一次。如果試劑有變動，須連續(xù)監(jiān)測。每周監(jiān)測一次時，如發(fā)現(xiàn)有不符合要求的結(jié)果,應(yīng)立即改為每日監(jiān)測,尋找原因以便解決。按下法查找原因：(）連續(xù)5天測定

14、質(zhì)控菌株。(2)每種藥物對每種細菌，所測的這5個抑菌環(huán)不得超出表3的準(zhǔn)確度范圍。每種藥物對每種細菌,連續(xù)測定的這5個抑菌環(huán)的范圍不應(yīng)超出表3，A,B和3的精確度范圍。 如果達不到上述要求（只要有一個抑菌環(huán)直徑超出準(zhǔn)確度范圍或抑菌環(huán)范圍大于精確度所允許的范圍），必須連續(xù)進行每日監(jiān)測。只有在以后連續(xù)測定了30次質(zhì)控菌株且結(jié)果合格后才可以改為每周監(jiān)測.。 產(chǎn)生誤差常見的原因 只要有一次質(zhì)控結(jié)果超出表3，3A，3B和C的允許范圍，應(yīng)從以下諸方面查找原因。（1）記錄質(zhì)控結(jié)果有無筆誤；(）測量抑菌環(huán)時是否讀錯；（3)質(zhì)控菌株污染或有其他改變;(4)接種菌液過濃或過淡；(）比濁管沒有混勻；（6）孵育溫度或孵

15、育環(huán)境不對;(7）M-H瓊脂有批間差-每批培養(yǎng)基用前應(yīng)鑒定；(8）藥敏紙片在保存和使用中是否失效. 一旦發(fā)現(xiàn)結(jié)果失控，先再仔細檢查一下平板,往往很容易解決。如果找不出明顯的操作失誤,就必須連續(xù)5天，每天測定質(zhì)控菌株。當(dāng)這連續(xù)5個結(jié)果均在允許的準(zhǔn)確度范圍且所有值都不大于允許的精確度最大范圍，則可改行每周監(jiān)測。但只要有一個抑菌環(huán)超出準(zhǔn)確度范圍或精密度允許范圍，就必須做每日監(jiān)測。直到當(dāng)按。4節(jié)方法另做了0次質(zhì)控并達到要求后，才可以恢復(fù)每周監(jiān)測.10 方法的局限性10。1 對各類細菌的適用性 本文介紹紙片方法是由快速生長的致病菌標(biāo)定的，菌株包括腸桿菌科、葡萄球菌、腸球菌、綠膿假單胞菌、不動桿菌。經(jīng)適當(dāng)改動可用來測定嗜血桿菌、淋病奈瑟氏菌和鏈球菌.對那些未在表中列出的細菌，如使用的培養(yǎng)基不同、孵育環(huán)境不同或生長率不同等，尚沒有重復(fù)性好的標(biāo)準(zhǔn)方法。這類細菌的實驗結(jié)果不易解釋,不應(yīng)用紙片法測定。0.2 易引起誤導(dǎo)的結(jié)果 當(dāng)用某些抗生素測試某特定細菌時,可能出現(xiàn)嚴(yán)重的誤導(dǎo)，主要包括以下幾種情況(但不限于這幾種）：第一、第二代頭孢菌素和氨基糖苷類測沙門氏菌和志賀氏菌；所有內(nèi)酰胺類抗生素（除了苯唑西林、甲氧西林和乙氧西林）測耐甲氧西林葡萄球菌；頭孢菌素、氨基糖苷類(除了高水平耐藥試驗)、林可霉素和甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲基異惡唑測腸球菌；頭孢菌素測李斯特菌。1.