核酸化學32hr修改稿實用課件

1、第三章第三章 核酸化學核酸化學 一核酸研究的歷史和重要性一核酸研究的歷史和重要性 歷史： l l1896年瑞士青年科學家F.Miescher首先發(fā)現(xiàn) 核酸。 從外科繃帶的膿細胞核中分離到含磷很高的酸性 化 合物稱為核素。 l l后經40-50年的證明核酸的組成核苷酸單體 l l19世紀末20世紀20年代發(fā)現(xiàn)： 核酸的四種堿基；核糖核酸 (RNA)(RNA) 根據(jù)核糖不同核酸可分為 脫氧核糖核酸 (DNA)(DNA) l l1944年Avery（美）OswaldTheodore Avery， ( (18771955）加拿大生物化學家 通過細菌轉化實驗證明DNA是遺傳物質 功能。 l l1953年

2、Watson（美）Crick（英） 提出了DNA的雙螺旋結構模型。 l l1960年Crick提出了中心法則。 l l1973年初DNA體外重組成功。 l l2002年人類基因組計劃。 重要性：重要性：核酸是遺傳變異的物質基礎； 多數(shù)生物的遺傳物質是DNA； 少數(shù)病毒以RNA作為遺傳物質。 二核酸的分類 根據(jù)含戊糖的不同分為：RNA核糖核酸 DNA脫氧核糖 核酸 DNA：含脫氧核糖，98%以上存在于細胞核中。 在核中與組蛋白結合成核蛋白，形成染 色體； 少量存在于線粒體、葉綠葉、質粒中。 RNA：90%存在于細胞質中，10%在核中。 信使核糖核酸mRNA RNA按功能分為轉運核糖核酸t(yī)RNA

3、核糖體核糖核酸rRNA l l信使核糖核酸mRNA： 在核中合成，存在于細胞質中； 作為蛋白質合成的模板，是將DNA的遺傳信息 傳遞 到蛋白質的橋梁。 l l轉運核糖核酸t(yī)RNA： 在核中合成，存在于細胞質中； 作為搬運的工具，攜帶轉運氨基酸到核糖體。 l l核糖體核糖核酸rRNA： 在核仁中合成，存在于細胞質中； 與蛋白質結合構成核糖體，作為蛋白質合成場 所。 三核酸的組成 （一）元素組成 C、H、O、N、P，個別含S P含量比較恒定，約910%，是核酸的特征元 素。 測核酸含量常用定P法： 各種核酸含磷量比較接近； 磷易于測定。 1gP10.5g核酸 （二）化學組成核酸的基本組成單位是核苷

4、酸 兩類核酸（DNA，RNA）經不同程度的水解可 得到 一系列產物，完全水解的三類終產物是： 磷酸、戊糖（5C）、堿基。 磷酸 核酸核苷酸戊糖（核糖或脫氧 核糖） 核苷 堿基（嘌呤或嘧啶） 兩類核酸（DNA與RNA）的區(qū)別:戊糖、堿基差異。 戊糖（D核糖） RNA 堿基（腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧 啶） 戊糖（D2脫氧核糖） DNA 堿基（腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧 啶） 1磷酸：RNA、DNA兩類核酸均含有。 2核糖和脫氧核糖 O H H OH H OH OH H HOCH2 HOCH2 O H H OH H H OH H D-核糖D-2-脫氧核糖 1 1 2 23 3 4 5 4 5

5、 3堿基嘌呤堿和嘧啶堿 堿基：是一些含N的雜環(huán)化合物，是嘌呤和嘧啶的 衍生 物，具有堿性。 （1）嘧啶堿 三種基本嘧啶堿基： 嘧啶 稀有堿基：核酸中一些含量甚少的堿基，大多是由 基本 堿基上發(fā)生甲基化。 （2）嘌呤堿： 由一個嘧啶環(huán)和一個咪唑環(huán)形成的雜稠環(huán)。 兩種基本嘌呤堿基： 嘌呤 NHNH2 2 糖苷鍵 4核苷：由堿基和戊糖脫水縮合而成的糖苷。 堿基與糖連接方式：糖苷鍵 （N糖苷鍵） 嘧啶核苷：C1N1 ：由糖C1與嘧啶N1相連 。 嘌呤核苷：C1N9 ：由糖C1與嘌呤N9相連。 根據(jù)所含戊糖不同分為核糖核苷核苷 脫氧核糖核苷脫氧核苷 嘧啶核苷嘌呤核 苷 堿基環(huán)元素編號：1,2,3等； 糖

6、環(huán)元素編號：1,2,3等。 核苷命名：先讀堿基名稱。如：腺苷，胞苷，尿苷。 (OH) (OH) 5核苷酸 核苷酸：由核苷與磷酸形成的磷酸酯叫核苷酸。 由核苷的戊糖的OH與磷酸成酯。 核糖核糖上有三個自由羥基（2、3、5）可與磷 酸成酯， 可形成三種形式的核苷酸：2-核苷酸； 3-核苷 酸； 5-核苷 酸。 舉例： 脫氧核糖脫氧核糖有兩個自由羥基（3、5）可與磷 酸成酯， 可形成兩種形式的核苷酸：3-脫氧核苷酸； 5-脫氧 核苷酸。 舉例： 生物體內存在的核苷酸多為生物體內存在的核苷酸多為5 5- -核苷酸。核苷酸。 6多磷酸核苷酸 核苷酸含有不止一個磷酸，為多磷酸核苷酸，在 體 內具有重要的生

7、理作用。 如：參與體內多種物質合成代謝。 AMP：腺苷一磷酸 ADP：腺苷二磷酸 ATP：腺苷三磷酸 7環(huán)狀核苷酸。 如：3、5-環(huán)狀腺苷酸。 磷酸與核糖的3及5位碳同時以兩個酯鍵相 連。 作用：環(huán)狀核苷酸含量很少，但是在體內的代謝 中起 重要的調節(jié)作用。常見的有cAMP， cGMP。 四、四、DNADNA的結構的結構（deaxyribonucleicacid- DNA） DNA形狀：多為雙鏈，少數(shù)單鏈； 多為線狀（單、雙）， 少數(shù)環(huán)狀（單、雙）； 無支鏈。 分子量大：106109。 一級結構 DNA的結構二級結構 空間結構 三級結構 （一）DNA的一級結構 1構成DNA的各種脫氧核苷酸的排列

8、順序。 核苷酸連接方式：3,5磷酸二酯鍵。 5 5 3 3 簡寫式 （1）線條式： 豎線表示核糖的碳鏈； A、T、G、C堿基； P磷酸基； P一端與C3相連，另一端 與C5相連； （2）文字式： P在堿基左側表示P與 C5相連； 在堿基右側表示P 與C3相連。 （二）DNA的二級結構DNA的雙螺旋結構 DNA的雙螺旋結構，由Watson，Crick于1953年提出。 1雙螺旋結構的模型要點: （1）DNA由兩條多核苷酸鏈圍繞同一中心軸向右纏繞成 雙螺 旋，兩鏈彼此平行，走向相反。 2.0 nm 小小 溝溝 大大 溝溝 （2）每條鏈以脫氧核糖和磷酸為骨架(主鏈），處 在 雙螺旋的外側； 糖與磷酸

9、之間以磷酸二酯鍵相連； 糖環(huán)平面基本與螺旋軸平行。 2.0 nm 小小 溝溝 大大 溝溝 （3）堿基在雙螺旋內側，堿基環(huán)平面與螺旋軸相 垂 直，兩相鄰堿基之間的距離為0.34nm 堿基堆 積距離。 2.0 nm 小小 溝溝 大大 溝溝 （4）兩條鏈之間通過堿基之間的氫鍵結合在一起； 兩 鏈間形成氫鍵具有一定的堿基配對原則。 配對原則：由一條鏈的嘌呤堿與另一條鏈的嘧啶堿 配對堿基互補； 而且必須A與T配對，形成兩條氫鍵 A=T； G與C配對，形成三條氫鏈GC。. 配對的堿基彼此稱為互補堿基。 根據(jù)堿基互補原則，當一條多核苷酸鏈的序列確定 后即 可推知另一條互補鏈的序列。 （5）螺旋每上升一圈，含

10、十對堿基，上升一圈的 距離 3.4nm，兩相鄰核苷酸之間的夾角為36， 螺旋 直徑為2nm。 成對堿基大致在同一平面，堿基與螺旋軸垂 直； 兩相鄰堿基之間的距離為0.34nm 堿基堆積距離。 上述為B-型DNA的結構，生物體主要為B-DNA。 其他結構：A-DNA,； C-DNA； Z-DNA。 （6）多數(shù)天然DNA為雙鏈結構（dsDNA），少數(shù) 病毒 DNA為單鏈（ssDNA）。 2維持DNA雙螺旋結構的穩(wěn)定的作用力 （1）互補堿基對之間的H鍵不是主要力 因為H鍵的力很小，而且斷裂時具有協(xié)同 性。 （2）堿基堆積力主要作用力 堿基對之間電子云可以在一定程度上相互 交蓋， 形成堿基堆積力。 (

11、3)離子鍵 由磷酸基團的負電荷與介質中陽離子之間 形成。 減少了DNA分子自身的斥力。 （三）DNA的三級結構 三級結構：指DNA在二級結構的基礎上，進一步 卷曲 或再次螺旋，即為三級結構。 四、DNA與基因組 （一）DNA與基因 基因：DNA分子中最小的功能單位稱為基因。 基因：結構基因 調節(jié)基因 基因組：某種生物體所含的全部基因的總和稱為該 生物 的基因組。 （二）原核生物與真核生物基因組特點 原核生物：基因組比較簡單，通常只有一個DNA分 子 （一個染色體，且分子比較小。 真核生物：基因組比較復雜，一般含有若干個DNA 分 子（多個染色體）。 如：人23對染色體。 五、RNA的結構與功能

12、 RNA主要存在于細胞質中，有多種不同功能， 多數(shù)天然RNA分子為一條單鏈，一些區(qū)域可自身 回折，形成局部的雙螺旋。 堿基組成：四種：腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、 胞嘧啶（C）、尿嘧啶 （U）； 還有一些稀有堿基。 堿基之間不像DNA那樣有嚴格的組成規(guī)律 即：AU，GC； 但：AU，GC。 原因：RNA分子為單鏈不是雙螺旋，只有局部回折 形 成雙螺旋。 (一)tRNA 含量：占全部RNA的15%。 功能：功能： 1攜帶轉運AA到核糖體，合成蛋白質； tRNA的AA臂與AA結合攜帶AA，每種AA只 能由特 定的tRNA搬運； 2識別密碼反密碼子環(huán)上的反密碼子能與 mRNA 上的密碼子通過堿基互補

13、配對而識別、結合。 特點：特點：每種AA至少有一種特定的tRNA。 細胞內一般有50種以上不同的tRNA。 真核細胞生物細胞tRNA甚至可多達100 多種。 結構特點： 1分子量比較小25000道爾頓左右，由70-90個 堿基組 成，沉降系數(shù)4s左右。 2堿基組成有較多的稀有堿基。 33-端都為CpCpA-OH。接合活化的氨 基酸（與 氨基酸結合）故稱為接受末端。 45端，大多為pG或者pC.。 5二級結構都呈類似的三葉草結構： 葉柄：有局部雙螺旋構成，A=U，G=C 配對。 三片小葉：由突環(huán)構成。 三葉草分為以下幾部分： l l氨基酸臂： 7對堿基對組成，富含G，包括3和5兩個末 端。 3-

14、末端最后三個堿基CCA-OH，接受活化氨基 酸。 l l二氫尿嘧啶環(huán)：含兩個二氫尿嘧啶。 環(huán)：由8-12個核苷酸組成。 臂：由3-4對堿基對二氫尿嘧啶臂。 l l反密碼子環(huán) 環(huán)：7個核苷酸組成，環(huán)正中三個核苷酸為反密碼 子。 臂：由5對堿基組成。 l l額外環(huán) 由3-18個核苷酸組成，環(huán)大小變化較大，不同 的 tRNA具有大小不同的額外環(huán)。 l lTC環(huán) 環(huán)：由7個堿基組成，大多tRNA均含T和。 T胸腺嘧啶核糖核苷 假尿嘧啶核苷 臂：由5對堿基組成。 6三級結構 在二級結構基礎上，整個分子的扭曲使未配對堿基 按堿基配對原則形成氫鍵，構成三維結構，似一倒 “L”形。 （二）rRNA 含量：占全

15、部RNA的80%左右，存在于核糖體內。 作用： （1）與蛋白質結合形成核糖體，作為蛋白質合成 場所。 核糖體核糖體rRNA（60%）+蛋白質 （40%） （2 2）在蛋白質合成中起催化作用。 核糖體（核蛋白體，核糖核蛋白體）： 分布在細胞質內的微小顆粒，直徑20 30nm。 游離存在（少）；附著在內質網上（多 數(shù)）。 特點：成分穩(wěn)定代謝不活躍，分子量大10-6。 核糖體為一大一小兩個亞基，原核真核不 同。 rRNA結構類三葉草 （三）mRNA 含量：占全部RNA的3-5%。 作用：以DNA為模板合成，作為蛋白質合成的模 板， mRNA的核苷酸序列，決定相應蛋白質 的氨基 酸序列。 將DNA的遺

16、傳信息傳向蛋白質的橋梁。 特點：代謝活躍，更新快，分子量差異較大。 （四）RNA的其它功能 1981年發(fā)現(xiàn)有些RNA具有生物催化劑的功能。 核酶：具有催化活性的RNA。 四、核酸的性質 （一）一般理化性質 1兩性性質 核酸含酸性的磷酸基和堿性的堿基（嘌呤，嘧 啶） 為兩性電解質，但是通常表現(xiàn)為酸性。 2DNA、RNA分子量都很大DNARNA。 DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末。 微溶于水，不溶于有機溶劑。常用乙醇從溶液 中沉 淀核酸。 3粘度很大 DNA為線性或環(huán)狀分子，長約1um-4um不等， 直徑 2nm。 直徑：長度可達到10-7，故黏度很大。 RNA粘度pH10。 變性結果：

17、（）紫外吸收增加-增色效應： 由于核酸變性而引起紫外吸收增加的現(xiàn) 象。 原因：變性后堿基暴露，光吸收增強。 （）粘度下降。（） 原因：分子由雙螺旋（具有一定剛性）變成 線 團狀。 （）浮力密度上升。（） （）生物活性喪失。 2.DNA熱變性和Tm： 過程： DNA溶于稀鹽溶液加溫到80-100雙螺旋 H鍵斷 裂成兩股單鏈，紫外吸收驟然增加。 熱變性特點： 爆發(fā)式的變性作用發(fā)生在一個很窄的溫度范圍 內， 而不是隨溫度升高而逐漸發(fā)生， 類似固態(tài) 結晶的熔解。 DNA熱變性溫度稱為熔點（融點），用Tm表示 T Tm m：紫外吸收的增加量（增色效應）達最大量一半 時的 溫度。 （加熱變性使DNADNA

18、雙螺旋結構失去一半時的溫 度。） DNATDNATm m值一般在707085 85 ，不同的DNADNA，T Tm m不同。 3影響Tm的因素 （1）G-C含量： 含G-C高，Tm高；因為G-C含3對氫鍵； 含A-T高，Tm低；因為A-T含2對氫鍵。 （2）溶液的離子強度： 離子強度低，Tm低。 （3）溶液pH：高pH使核酸失去質子，喪生成H 鍵的 能力。低pH易脫嘌呤。 （4）變性劑破壞H鍵 （四）復性 復性：變性的DNA在適當條件下，兩條彼此分開的 互補 鏈重新堿基配對形成雙螺旋的過程。 DNA熱變性及復性示意圖 復性后一系列理化物性及生物學活性可恢復。 減色效應：核酸在復性過程中紫外吸收

19、值降低的現(xiàn) 象。 影響復性的因素： (1)熱變性的DNA：緩慢冷卻可復性，且可逆復 性。 退火 (Annealing)。 驟然冷卻不可復性。 （2）單鏈濃度高，隨機碰撞機會多，復性速度快。 （3）片斷大，不易復性。 （4）片斷重復序列高，易復性。 （5）維持溶液一定的離子強度，以減少核酸磷酸 基的 負電荷斥力。 五、核酸的分子雜交和印跡技術 分子雜交：不同來源的單鏈DNA，如有相同區(qū)段 （堿 基互補區(qū)），互補形成雙鏈 DNADNA， or單鏈DNA與RNA互補形成 DNARNA 雜合雙鏈的過程叫分子雜交。 雜交可發(fā)生在： DNADNA:Southernblotting1975 DNARNA:N

20、orthernblotting1979 RNA-RNA 抗原抗體:Westernblotting1979 雙向蛋白質電泳:Easternblotting1982 印跡技術：是一種核酸轉移技術。 1975年由Edwen Southern 發(fā)明 過程： 用限制性酶切割DNA成較小片段 凝膠電泳 DNA變性 轉移到薄膜（硝酸纖維素膜） 用標記的DNA片段（探針） 與膜上的DNA雜交 用放射自顯影或顯色探測未知 片段。 六、PCR技術聚合酶鏈式反應技術 （polymerasechainreactionPCR） 體外快速擴增DNA的技術。 1985年由美國Cetus公司的KarryMullis 發(fā)明。

21、材料：材料： 1.模板待擴增的DNA。 2.反應物（底物）dATP，dGTP，dCTP， dTTP。 3.引物寡核苷酸（20個左右核苷酸長度）。 引物A與模板5端互補。 引物B與模板3端互補。 4.TaqDNA聚合酶。(耐熱） 步驟：步驟： 變性（95）DNA雙鏈單鏈，作為合成新 鏈 的模板。 退火（55）快速冷卻接近Tm,使引物與模板 結合。 延伸（72）調節(jié)溫度到72左右，TaqDNA 聚 合酶催化合成出與模板互補 的新鏈。 上述步驟反復循環(huán)20-40次，DNA可擴增100 萬倍。 七核酸的顯色反應 核酸中含有核糖（或者脫氧核糖）與一些化學試劑 發(fā)生顏色反應定性、定量 1RNA與地衣酚3,5-二硝基甲苯反應 核糖+地衣酚深綠色化合物 675nm測定