酶工程復(fù)習(xí)要點.

1、名詞解釋：酶工程：酶的生產(chǎn)、改性與應(yīng)用的技術(shù)過程稱為酶工程。固定化酶：固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行的催化反應(yīng)的酶固定化活細(xì)胞：固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動的細(xì)胞稱為固定化細(xì)胞。固定化細(xì)胞能進(jìn)行正常的生長、繁殖和新陳代謝 固定化原生質(zhì)體： 固定在載體上，在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行新陳代謝的原生質(zhì)體。膜分離技術(shù)：借助一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、 形狀、性質(zhì)的顆粒或分子進(jìn)行分離 的技術(shù)。酶促破碎法：通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎的方法。 結(jié)晶：是指物質(zhì)以晶體的狀態(tài)從蒸汽或溶液中析出的過程。萃取分離：利用溶質(zhì)在互不相溶的兩相之

2、間分配系數(shù)的不同而使溶質(zhì)得到純化或濃縮的 方法。酶分子修飾：通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過程稱為酶分子修飾。大分子結(jié)合修飾：采用水溶性大分子與酶的側(cè)鏈基團(tuán)共價結(jié)合，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的催化特性的方法。肽鏈有限水解修飾： 肽鏈的水解在限定的肽鍵上進(jìn)行，稱為肽鏈有限水解。 利用肽鏈的有限水解， 其分子質(zhì)量減少，既可以在基本保持酶活力的同時使酶的抗原性降低或消失，又可以使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性和功能的方法，稱為肽鏈有限水解修飾。氨基酸置換修飾：將酶分子肽鏈上的某一個氨基酸置換成另一個氨基酸，從而改變酶的催化特性

3、的修飾方法。原生質(zhì)體融合育種： 就是把兩個親本的細(xì)胞分別去掉細(xì)胞壁，獲得原生質(zhì)體，將兩親 本的原生質(zhì)體在高滲條件下混合，由聚乙二醇（PEG作為助融劑，使它們互相凝集，發(fā)生細(xì)胞質(zhì)融合，接著兩親本基因組由接觸到交換，從而實現(xiàn)遺傳重組的方法進(jìn)行育種基因工程育種：改變細(xì)胞調(diào)節(jié)基因，使菌種由誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型。增加結(jié)構(gòu)基因的拷貝數(shù)，增加細(xì)胞專一性酶的生產(chǎn)組成酶：細(xì)胞固有的酶類。 誘導(dǎo)酶：是細(xì)胞為適應(yīng)外來底物或其結(jié)構(gòu)類似 物而臨時合成的一類酶。 分解代謝物阻遏：指細(xì)胞內(nèi)同時有兩種分解底物（碳源或氮源）存 在時，利用快的那種分解底物會阻遏利用慢的底物的有關(guān)酶合成的現(xiàn)象反饋阻遏：酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物或代謝途徑的末端

4、產(chǎn)物使該酶的生物合成受到阻遏的現(xiàn)象反饋抑制：是最終產(chǎn)物抑制作用，在合成過程中，有些微生物合成途徑的終點產(chǎn)物對該途徑酶的活性調(diào)節(jié)，所引起的抑制作用。發(fā)酵動力學(xué)：研究發(fā)酵過程中細(xì)胞生長速率、產(chǎn)物生成速率、基質(zhì)消耗速率以及環(huán)境因素對這些速率的影響的學(xué)科。細(xì)胞定向進(jìn)化：是在細(xì)胞水平上進(jìn)行定向進(jìn)化的過程，以各種細(xì)胞為進(jìn)化對象，目的是改良細(xì)胞的各種特征，主要包括微生物細(xì)胞的定向進(jìn)化、動物細(xì)胞的定向進(jìn)化、植物細(xì)胞的定向進(jìn)化等。酶反應(yīng)器：用于酶進(jìn)行催化反應(yīng)的容器及其附屬設(shè)備。固定化酶膜反應(yīng)器：由膜狀或板狀固定化酶或固定化微生物組裝的反應(yīng)器。1何謂酶工程，試述其主要內(nèi)容和任務(wù)。答：酶的生產(chǎn)、改性與應(yīng)用的技術(shù)過程

5、稱為酶工程。 酶的生產(chǎn)：微生物發(fā)酵產(chǎn)酶、動植物培養(yǎng)產(chǎn)酶、酶的提取和分離純化酶的改性：酶分子修飾、酶固定化、酶非水相催化和酶的定向進(jìn)化 酶的應(yīng)用：通過酶的催化作用獲得人們所需的 酶，并通過各種方法使酶的催化特性得以改進(jìn)，充分發(fā)揮其催化功能。酶工程的內(nèi)容：微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶，動植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶，酶的提取與分離純化，酶分子的修飾，酶、細(xì)胞、 原生質(zhì)體固定化，酶非水相催化，酶定向進(jìn)化，酶反應(yīng)器和酶的應(yīng)用等。酶工程的任務(wù)：經(jīng)過預(yù)先設(shè)計，通過人工操作獲得人們所需的酶，并通過各種方法使酶的催化特性得以改進(jìn)，充分發(fā)揮其催化功能。3、影響酶催化作用的主要因素。一、底物濃度的影響 二、酶濃度的影響三、溫度的影響四

6、、pH的影響五、抑制劑的影響 六、激活劑的影響4、酶活力單位和酶比活力的概念。在實驗室規(guī)定的條件下，每分鐘催化lumol底物變化所需要的酶量為一個酶活力國際單位（用“ IU ”表示，簡寫為U）。酶的比活力是指在特定的條件下，單位質(zhì)量（mg）蛋白質(zhì)或RNA所具有的酶活單位數(shù)。5、如何測定固定化酶的比活力？固定化酶常用的活力測定方法有哪些？ 在固定化酶中，一般采用每克（g）干固定化酶所具有的酶活力單位數(shù)表示。固定化酶常用的活力測定方法：振蕩測定法、酶柱測定法、連續(xù)測定法1提高酶的產(chǎn)量的措施。（一）遺傳控制（一勞永逸）誘變育種（1）使誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型一一選育組成型突變株（2）使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜?基

7、因工程育種改變細(xì)胞調(diào)節(jié)基因，使菌種由誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型。 增加結(jié)構(gòu)基因的拷貝數(shù)，增加細(xì)胞專一性酶的生產(chǎn)。（二）條件控制（1）添加誘導(dǎo)物（2）降低阻遏物濃度（3）添加表面活性劑（4）添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑2、酶生物合成的模式及每種模式的特征。1 同步合成型特征：生物合成伴隨著細(xì)胞的生長而開始；在細(xì)胞進(jìn)入旺盛生長期時，酶大量合成；當(dāng)細(xì) 胞生長進(jìn)入平衡期后，酶的合成隨著停止。2 延續(xù)合成型特征：酶的合成在細(xì)胞的生長階段開始，在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后酶還可以延續(xù)合成一段時間的一種酶生物合成模式。3 中期合成型特征：酶在細(xì)胞生長一段時間后才開始，而在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期以后，酶的生物合成也隨之停止。4 滯后合成型特征

8、：酶在細(xì)胞生長一段時間或者進(jìn)入平衡期以后才開始合成并大量積累。3、影響酶生物合成模式的主要因素1）mRNA勺穩(wěn)定性高：可在細(xì)胞停止生長后繼續(xù)合成酶差：隨著細(xì)胞停止生長而終止酶的合成2）培養(yǎng)基中阻遏物的存在不受阻遏：隨著細(xì)胞的生長而開始酶的合成。受阻遏：細(xì)胞生長一段時間或平衡期后，酶才開4、優(yōu)良產(chǎn)酶微生物菌種應(yīng)具備的條件。1. 酶產(chǎn)量高2.容易培養(yǎng)和管理（生長速率高、營養(yǎng)要求低）3.產(chǎn)酶穩(wěn)定性好4.利于酶的分離提純 5.安全可靠，無毒性（不是致病菌）1、酶固定化方法有哪幾種？各自的特點及適用范圍五種方法：熱處理法、吸附法、包埋法、共價結(jié)合法、交聯(lián)法 熱處理法：該法只適應(yīng)于那些熱穩(wěn)定性較好的酶的固

9、定化。物理吸附法：物理吸附法的優(yōu)點是操作簡單，條件溫和，對細(xì)胞活性影響小，酶活力損失 小等，但細(xì)胞易受環(huán)境影響而脫落，操作穩(wěn)定性差，另外，吸附的細(xì)胞數(shù)量少。包埋法：優(yōu)點：不與酶蛋白氨基酸殘基反應(yīng)，很少改變酶的高級結(jié)構(gòu)，酶活回收率高。缺點：只適合作用于小分子底物和產(chǎn)物的酶。共價結(jié)合法：結(jié)合牢固，不易脫落，可連續(xù)使用較長的時間 載體活化操作復(fù)雜，對酶的活性有影響。交聯(lián)法：交聯(lián)法制備的固定化酶或固定化菌體結(jié)合牢固，可以長時間使用。但由于交聯(lián)反應(yīng)條件較激烈，酶分子的多個基因被交聯(lián)，致使酶活力損失較大，而且制備成的固定化酶或固 定化菌體的顆粒較小，給使用帶來不便。交聯(lián)法也用于含酶菌體或菌體碎片的固定化。

10、2、 酶固定化后性質(zhì)會發(fā)生什么變化？原因是什么？酶固定化后穩(wěn)定性提高中，包括哪幾方面 的穩(wěn)定性？（一）酶的活性 ：通常低于天然酶（有例外）。（二）酶的穩(wěn)定性酶的耐熱性、對變性劑、 抑制劑、蛋白酶的抵抗力增加，固定化可以增強(qiáng)貯存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性。可能的原因：固定化增加了酶活性構(gòu)象的牢固程度，可防止酶分子伸展變形；抑制酶的自身降解。固定化部分阻擋了外界不利因素對酶的侵襲。（三）酶的最適溫度最適溫度與酶穩(wěn)定性有關(guān)。多數(shù)酶固定化后熱穩(wěn)定性上升，最適溫度也上升（有例外）。（四）酶的最適 pH帶負(fù)電荷載體：最適pH向堿性偏移。 帶正電荷載體：最適pH向酸性偏移（五）酶的動力學(xué)特征固定化酶的表觀米氏常數(shù)

11、Km隨載體的帶電性能變化。 固定化載體與底物電荷相反,固定化酶的表觀Km值降低。 固定化載體與底物電荷相同，固定化酶的表觀Km值顯著增加。（六）酶的作用專一性與自然酶基本相同。但大分子底物難于接近酶分子，導(dǎo)致酶的專一性發(fā)生改變。3、細(xì)胞固定化的方法有哪些？細(xì)胞種類多種多樣， 大小和特征各不相同，故此細(xì)胞固定化的方法也有多種。歸納起來，主 要可分為吸附法和包埋法兩大類方法。吸附法簡介：物理吸附法主要是利用細(xì)胞與載體之間的靜電引力和專一的親和力作用，使細(xì)胞固定在不同的載體（如硅藻土、陶瓷、玻璃和塑料）上。包埋法：包埋法可分為凝膠包埋法和半透膜包埋法。 凝膠包埋法是應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞固定化方法，各種微

12、生物、動植物細(xì)胞都可用此方法固定化。一般采用的載體為瓊脂、海藻酸鈣、角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺等。其中聚丙烯酰胺應(yīng)用 最早。特點：包埋法固定細(xì)胞具有很多優(yōu)點，如：方法簡便、條件溫和，對細(xì)胞活性影響小，穩(wěn)定 性好、機(jī)械強(qiáng)度較好和包埋容量較高等。但此法也有缺點，只適用于小分子底物4、簡述固定化原生質(zhì)體的制備方法與特點原生質(zhì)體制備好后，把離心收集到的原生質(zhì)體重新懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖液中，配成一定濃度的原生質(zhì)體懸浮液。然后采用包埋法制成固定化原生質(zhì)體。特點：解除了細(xì)胞壁擴(kuò)散障礙，可增加細(xì)胞膜的通透性，有利于氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞和吸收，也有利于胞內(nèi)物質(zhì)的分泌，可顯著提高產(chǎn)率。由于有載體的保護(hù)作用

13、，具有較好的操作穩(wěn)定性和保存穩(wěn)定性，可反復(fù)使用或連續(xù)使用較長時間，利于連續(xù)化生產(chǎn)。易于和發(fā)酵產(chǎn)物分開，有利于產(chǎn)物的分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量。發(fā)酵的培養(yǎng)基中需要添加穩(wěn)定劑，以保持原生質(zhì)體的穩(wěn)定性。這些滲透壓穩(wěn)定劑在發(fā)酵結(jié)束后，可采用層析或膜分離技術(shù)等方法與產(chǎn)物分離。固定化原生質(zhì)由于沒有細(xì)胞壁，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，失去增殖能力，但由于細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)沒有受其影響，保持了細(xì)胞原有的新陳代謝特性1細(xì)胞破碎的目的、方法。大多數(shù)酶都存在于細(xì)胞內(nèi)部，為了獲得細(xì)胞內(nèi)的酶，首先要收集細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞破碎，使細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，然后進(jìn)行酶的提取與分離純化。1. 機(jī)械法2.物理法3.化學(xué)法4.酶促破碎法（酶解）2選擇細(xì)胞破碎方

14、法的依據(jù)。（1）細(xì)胞的處理量：大規(guī)模用機(jī)械法，小規(guī)模用非機(jī)械法。（2）細(xì)胞壁的強(qiáng)度與結(jié)構(gòu)（3）目標(biāo)產(chǎn)物對破碎條件的影響。機(jī)械法考慮剪切力，酶法考慮對目標(biāo)產(chǎn)物是否具有降解作用。（4）破碎程度：高壓勻漿法，細(xì)胞碎片細(xì)小，固液分離困難。（5）提取分離的難易3. 酶抽提的目標(biāo)及方法。提取目標(biāo)：a.將目的酶最大限度地溶解出來。 b.保持生物活性。提取原則a 相似相溶。b.遠(yuǎn)離等電點的pH值，溶解度增加。4. 三種離心方法（差速離心、密度梯度離心和等密度梯度離心）的特點。（1）差速離心特點：用于分離大小和密度差異較大的顆粒。（2） 密度梯度離心特點：1.區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì)2.顆粒的密度。適宜

15、分離 密度相近而大小不同的固相物質(zhì)。（3）等密度梯度離心特點：1.介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離物質(zhì)的密度。2. 適于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同的物質(zhì)。5. 酶的分離純化過程中常用沉淀法的種類及原理。種類：中性鹽沉淀（鹽析法）基本原理（鹽溶和鹽析）向蛋白質(zhì)或酶的水溶液中加入中性鹽，可產(chǎn)生兩種現(xiàn)象：1）鹽溶（salting in ）:低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。2）鹽析（salting out ）:高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。有機(jī)溶劑沉淀利用酶等蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同而使之分離的方法。1. 沉淀機(jī)理：1.降低溶液的介電常數(shù) 2.部分地引起蛋白質(zhì)脫水2. 常用有機(jī)溶劑丙酮乙

16、醇甲醇，用量一般為酶液體積的2倍左右，終濃度為 70%選擇性沉淀（熱變性和酸堿變性）選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白質(zhì)變性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法。熱變性幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固，加熱升高溫度使雜蛋白變性沉淀而保留目的物在溶液中。pH變性等電點沉淀法是pH變性法中的一種變體。有機(jī)溶劑變性使那些對有機(jī)溶劑敏感的雜蛋白變性沉淀。等電點沉淀原理：蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低 不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點 有機(jī)聚合物沉淀作用機(jī)理：與有機(jī)溶劑類似，是發(fā)展較快的一種新方法。沉淀劑：常用聚乙二醇（簡寫PEG ）多用分子量為 600020000的PEG。6. 雙水相萃取、超臨界流體萃取的概念

17、。超臨界萃取，又稱為超臨界流體萃取，是利用欲分離物質(zhì)與雜質(zhì)在超臨界流體中的溶解度 不同而達(dá)到分離的一種萃取技術(shù)。利用溶質(zhì)在兩個互不相溶的水相中的溶解度不同而達(dá)到分離。7. 膜分離的原理及應(yīng)用。? 膜分離過程中，薄膜的作用是選擇性地讓小于其孔徑的物質(zhì)顆?；蚍肿油ㄟ^，而把大于其孔徑的顆粒截留。? 應(yīng)用（自己整理）超濾法在蛋白質(zhì)溶液除鹽、濃縮及分離純化中有廣泛的應(yīng)用。? 反滲透：海水淡化? 電場膜分離：脫鹽，海水淡化，純水制備，從發(fā)酵液中分離檸檬酸、谷氨酸及凝膠 電洗脫。8. 比較吸附層析、疏水層析、離子交換層析、凝膠過濾、親和層析，高效液相色譜的概念及原理上的不同點。? 吸附層析是利用吸附劑對不同

18、物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離的層析方 法。? 離子交換層析是利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對各種離子的親和力 不同而達(dá)到分離目的的一種層析分離方法。? 凝膠層析又稱為凝膠過濾、分子排阻層析、分子篩層析等，是指以各種凝膠為固定 相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離的一種層析技 術(shù)。? 親和層析是利用生物分子與配基之間所具有的可逆的親和力，使生物分子分離純化 的層析技術(shù)。? HPLC是利用樣品中的溶質(zhì)在固定相和流動相之間分配系數(shù)的不同，進(jìn)行連續(xù)的無數(shù)次的交換和分配而達(dá)到分離的過程。9. 比較連續(xù)與非連續(xù)、變性與非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)別。 連續(xù)電泳：采

19、用相同孔徑的凝膠和相同的緩沖系統(tǒng)，只有分離膠；不連續(xù)電泳：采用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系，有分離膠和濃縮膠。 連續(xù)PAGE電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)不連續(xù)PAGE電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、濃縮效應(yīng)1） 電荷效應(yīng)：分離膠中，蛋白質(zhì)表面凈電荷不同，遷移率不同。2） 分子篩效應(yīng)：大小和形狀不同的樣品分子通過一定孔徑的分離膠時，受阻滯的程度不同 而表現(xiàn)出不同的遷移率。3）濃縮效應(yīng)：使樣品在濃縮膠中被濃縮成一條窄帶，然后再進(jìn)入分離膠進(jìn)行分離。 系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個方面：1. 凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。2. 緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同

20、。電極緩沖液為 pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.7的Tris-HCI緩沖液，而分離膠為 pH8.9的Tris-HCI緩沖液。3. 在電場中形成不連續(xù)的電位梯度。因此，在這樣一個不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即樣品的濃縮效應(yīng)，凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，提高了分辨率。變性聚丙烯酰胺凝膠電泳：加了SDS非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳：不加SDS10. 蛋白質(zhì)濃度測定方法及酶活力測定方法。蛋白質(zhì)濃度測定1. 紫外吸收法：酪氨酸、色氨酸殘基中苯環(huán)有共軛雙鍵，在A280有最大吸收。特點：簡便、快速、不損耗樣品，但干擾因素多。2. 雙縮脲法：具有兩個或兩個以上肽鍵的化合物均有雙縮脲反應(yīng)。

21、優(yōu)點：快速；缺點：靈敏度差3. 酚試劑（Folin-酚）測定法：繁瑣，但靈敏度、準(zhǔn)確度高。4. 染料結(jié)合法（考馬斯亮藍(lán)染色法）：又稱Bradford法，靈敏、簡便、快速、干擾少，是 近年來常用的檢測法。11. 比活力、提純倍數(shù)、回收率的含義及用途。 酶的比活力（純度）=活力單位數(shù)/毫克蛋白比活力越高，酶純度也越好。表示酶制劑純度的一個指標(biāo)。純化倍數(shù)=提純后比活力/提純前比活力表示提純過程中純度提高的倍數(shù)。提純倍數(shù)越大，表示該方法純化效果越好?？偦盍?酶活力單位數(shù)酶液總體積即樣品中全部酶活力?；厥章?提純后酶總活力/提純前酶總活力x 100% 表示提純過程中酶損失程度的大小?；厥章试礁?，損失越小

22、。判斷一個分離純化方法的優(yōu)劣，常用總活力的回收率和比活力的提純倍數(shù)兩個指標(biāo)?；厥章剩悍从趁傅膿p失情況。 提純倍數(shù)：表示方法的有效程度。 一個好的純化步驟是回收率較高，提純倍數(shù)也較大。12. 電泳的基本原理是什么？在一定pH條件下（用buffer ）,不同大小、形狀及帶電顆粒在電場中的移動速度不同（用 遷移率表示），各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶。14.影響凝膠過濾分辨率的因素有哪些？分配系數(shù)的含義及作用。凝膠對溶質(zhì)的排阻程度可用分配系數(shù)Kd表示：Ve-VoKd=ViVo外水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積（ml）Vi內(nèi)水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部各微孔體積的總和（ml）Ve某組分

23、的洗脫體積，從加進(jìn)層析柱到流出液中該組分出現(xiàn)高峰時的洗脫液體積（ml） 分配系數(shù)Kd的意義：1）可定量地衡量各組分的流出順序。2）判斷分離效果，Kd差異大，分離效果好，Kd差異小，分離效果差。15 .酶的分離純化中，純化方法的排序.先選用粗放、快速、有利于縮小樣品體積的方法。精確、費(fèi)時、需樣品少的方法，宜后選用。16.酶結(jié)晶的主要方法有哪些？1、鹽析結(jié)晶法；2、有機(jī)溶劑結(jié)晶法；3、等電點結(jié)晶法4、透析平衡結(jié)晶法5、溫度差結(jié)晶 法6、金屬離子復(fù)合結(jié)晶法1、酶活性中心的特點。（1）活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。（2）活性部位是一個三維實體。（3）活性中心位于酶分子表面的疏水性裂縫中。

24、（4）活性中心構(gòu)象不是固定不變的（誘導(dǎo)契合）。（5）酶與底物通過鹽鍵、氫鍵、范德華力和疏水作用等次級鍵結(jié)合。2、研究酶活性中心的方法。1物理學(xué)方法：用X射線衍射法直接檢測底物或其類似物與酶形成的中間復(fù)合物（包括酶和底物）的相對 2化學(xué)修飾法：根據(jù)所用修飾試劑不同，分為1）非專一性化學(xué)修飾 2）專一性化學(xué)修飾（基團(tuán)專一性修飾）3）親和標(biāo)記（位點專一性修飾）3蛋白質(zhì)工程：將酶相應(yīng)的cDNA定點突變，突變的 cDNA只表達(dá)一個或幾個氨基酸被置換的酶蛋白，測 定其活性可知被置換的氨基酸是否為活力所必需。4、酶分子的概念和作用酶分子是具有完整的化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)的生物大分子。作用：通過酶分子修飾，可以使

25、酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生某些合理的改變，就有可能提高酶的催化效率、增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性、降低或消除酶的抗原性、改變酶的底物專一性等。同時通過酶分子修飾，研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對酶分子空間的構(gòu)象的影響，可以進(jìn)一步探討其結(jié)構(gòu)與催化特性之間的關(guān)系。5、酶分子修飾的方法有哪些對酶分子的修飾方法分為化學(xué)法、生物法和物理法。化學(xué)法：金屬離子置換法、大分子修飾法、肽鏈有限水解法、蛋白側(cè)鏈基團(tuán)的小分子修飾法等。生物法：通過基因工程的手段改變蛋白質(zhì)，即基于核酸水平對蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，利用基因操作技術(shù)對DNA或mRNA進(jìn)行改造和修飾以期獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)更為合理的蛋白質(zhì)。物理修飾法：不改變酶的組成

26、和基團(tuán)，酶分子的共價鍵不發(fā)生變化。6、何謂金屬離子置換修飾？簡述其主要修飾過程和作用。把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的催化特性發(fā)生改變的修飾方法稱為金屬離子置換修飾。作用：1闡明金屬離子對酶催化作用的影響2提高酶的催化效率 3增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性 4.改變酶的動力學(xué)特征純酶一加入金屬離子的螯合劑*除去金屬螯合物測酶活力變化分別加入不同的金屬離 子，使其與酶蛋白結(jié)合確定較優(yōu)的離子各種固定化方法的比較吸附法”包埋法共價鍵結(jié)合法交聯(lián)法物理吸附法離子吸附法制備易易難弱中等強(qiáng)強(qiáng)活力回收率高，酶易流尖咼高低中等再生可能可能不可能不可能不可能固定化成本低低低高中等底物專性不變不變TT.不變可變可變與

27、網(wǎng)格型包埋法相比，微囊型包埋法的優(yōu)點：1）固定化酶顆粒小，有利于底物和產(chǎn)物擴(kuò)散。2）半透膜能阻止蛋白質(zhì)分子滲漏和進(jìn)入，注入體內(nèi)既可避免引起免疫過敏反應(yīng)，也可使酶 免遭蛋白水解酶的降解，具有較大的醫(yī)學(xué)價值。缺點：反應(yīng)條件要求高，制備成本也較高。影響共價結(jié)合的因素 酶分子中可以形成共價鍵的基團(tuán) 載體的物化性質(zhì)載體應(yīng)為親水性，應(yīng)選用小顆?；蚨嗫纵d體；有一定的機(jī)械強(qiáng)度，具有在溫和條件下與 酶結(jié)合的功能團(tuán)。載體的活化方法重氮法、疊氮法、溴化氰法、異氰酸法、異硫氰酸法、縮合法、酰氯法、活化脂法、酸 酐法、烷化反應(yīng)法、巰基-二硫交換反應(yīng)法，金屬鹽螯合法、硅烷化法固定化酶的性質(zhì)酶在水溶液中以自由的游離狀態(tài)存在

28、，但是固定后酶分子便從游離的狀態(tài)變?yōu)槔喂痰亟Y(jié)合于載體的狀態(tài)，其結(jié)果往往引起酶的性質(zhì)的改變。酶活力固定化酶的活力在多數(shù)情況下比天然酶的活力低，其原因可能是： 酶活性中心的重要氨基酸殘基與水不溶性載體相結(jié)合； 當(dāng)酶與載體結(jié)合時，它的高級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，其構(gòu)象的改變導(dǎo)致了酶與底物結(jié)合能 力或催化底物轉(zhuǎn)化能力的改變； 酶被固定化后，雖不失活，但酶與底物間的相互作用受到空間位阻的影響。 固定化酶的穩(wěn)定性游離酶的一個突出缺點是穩(wěn)定性差，而固定化酶的穩(wěn)定性一般都比游離酶提高得多，這 對酶的應(yīng)用是非常有利的。（1）操作穩(wěn)定性（2）貯藏穩(wěn)定性（3）熱穩(wěn)定性（4）對蛋白酶的穩(wěn)定性（5）酸堿穩(wěn)定性 固定化酶的反應(yīng)特

29、性（1）底物特異性一般來說，當(dāng)酶的底物為小分子化合物時，固定化酶的底物特異性大多數(shù)情況下不 發(fā)生變化。酶底物為大分子化合物時， 底物分子量不同，對固定化酶底物特異性的影響也不同， 一般隨著底物分子量的增大，固定化酶的活力下降。（2）反應(yīng)的最適pH酶被固定后，其最適 pH和pH曲線常會發(fā)生偏移，原因可能有以下三個方面： 一是酶本身電荷在固定化前后發(fā)生變化；二是由于載體電荷性質(zhì)的影響致使固定化酶分子內(nèi)外擴(kuò)散層的氫離子濃度產(chǎn)生差 異；三是由于酶催化反應(yīng)產(chǎn)物導(dǎo)致固定化酶分子內(nèi)部形成帶電荷微環(huán)境（3 ）反應(yīng)的最適溫度固定化酶的最適反應(yīng)溫度多數(shù)較游離酶高，如色氨酸酶經(jīng)共價結(jié)合后最適溫度比固 定前提高515

30、C，但也有不變甚至降低的。（4 ）米氏常數(shù)米氏常數(shù)Km反映了酶與底物的親和力。酶經(jīng)固定化后，酶蛋白分子的高級結(jié)構(gòu)的變化以及 載體電荷的影響可導(dǎo)致底物和酶的親合力的變化（5）最大反應(yīng)速度固定化酶的最大反應(yīng)速度與游離酶大多數(shù)是相同的。有些酶的最大反應(yīng)速度會因固定化方法的不同而有所差異。固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞按其生理狀態(tài)又可分為固定化死細(xì)胞和活細(xì)胞兩大類。特點2.1優(yōu)點 無需進(jìn)行酶的分離和純化，減少酶的活力損失，同時大大降低了成本； 可進(jìn)行多酶反應(yīng)，且不需添加輔助因子，； 對于活細(xì)胞來說，保持了酶的原始狀態(tài)，酶的穩(wěn)定性更高，對污染的抵抗力更強(qiáng)； 細(xì)胞生長停滯時間短，細(xì)胞多，反應(yīng)快等等缺點必須保持菌體的

31、完整，需防止菌體的自溶，否則影響產(chǎn)物的純度；必須抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對目的酶的分解；胞內(nèi)多酶的存在，會形成副產(chǎn)物； 載體、細(xì)胞膜或細(xì)胞壁會造成底物滲透與擴(kuò)散的障礙等制備方法固定化活細(xì)胞的制備條件比固定化酶更要溫和，其制備方法主要有物理吸附法和包埋法兩種物理吸附法物理吸附法主要是利用細(xì)胞與載體之間的靜電引力和專一的親和力作用，使細(xì)胞固定在不同的載體（如硅藻土、陶瓷、玻璃和塑料）上。特點：物理吸附法的優(yōu)點是操作簡單，條件溫和，對細(xì)胞活性影響小，酶活力損失小等，但細(xì)胞易受環(huán)境影響而脫落，操作穩(wěn)定性差，另外，吸附的細(xì)胞數(shù)量少包埋法包埋法可分為凝膠包埋法和半透膜包埋法。凝膠包埋法是應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞固定化方法

32、，各種微生物、動植物細(xì)胞都可用此方 法固定化。一般采用的載體為瓊脂、海藻酸鈣、角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺等。 其中聚丙烯酰胺應(yīng)用最早。特點包埋法固定細(xì)胞具有很多優(yōu)點，如：方法簡便、條件溫和，對細(xì)胞活性影響小，穩(wěn) 定性好、機(jī)械強(qiáng)度較好和包埋容量較高等。但此法也有缺點，只適用于小分子底物 固定化細(xì)胞及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用固定化細(xì)胞應(yīng)用于食品工業(yè)的主要優(yōu)點在于它能保護(hù)細(xì)胞不受外界不利條件）如酸、堿、有害離子等的影響，并且能起到連續(xù)生產(chǎn)的目的，目前固定化細(xì)胞主要用 于乳制品工業(yè)中。酵母固定化酸奶生產(chǎn)奶酪生產(chǎn)保護(hù)有益微生物延長細(xì)胞的存活率固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用1. 氨基?；福ˋmi no acyl

33、ase）世界上第一種工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶2葡萄糖異構(gòu)酶世界上生產(chǎn)規(guī)模最大，應(yīng)用最為成功的一種固定化酶。固定化酶在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用1. 消血栓纖溶酶是異源蛋白質(zhì)，在人體內(nèi)引起免疫反應(yīng)，無法長期使用。酶的不穩(wěn)定性使其在較短的時間內(nèi)失活。用包埋法制備的酶固定化技術(shù)可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物質(zhì) 能自由進(jìn)出。2. 人工腎：原理：將病人血液中的尿素經(jīng)脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微膠囊活性炭組成人工腎固定化原生質(zhì)體 原生質(zhì)體的制備1.1要求在破壞細(xì)胞壁的時候，不能影響到細(xì)胞膜的完整性，更不能使細(xì)胞內(nèi)部的結(jié)構(gòu)受到 破壞。過程離心收集細(xì)胞懸浮在高滲緩沖液中一加入水解酶去除細(xì)胞壁碎

34、 得原生質(zhì)體片,及未作用的細(xì)胞和醜原生質(zhì)體固定化凝膠包埋法(1) 常用膠瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、卡拉膠方法(角叉菜膠固定法)用還有滲透壓的緩沖液配成一定濃度(38%)的角叉菜膠，加熱溶解，滅菌后冷卻50C左右，與等體積的原生質(zhì)體懸浮液混合，將混懸液滴到一定濃度的預(yù)冷的KCI溶液中，即得球狀固定化的原生質(zhì)體特點 解除了細(xì)胞壁擴(kuò)散障礙，可增加細(xì)胞膜的通透性，有利于氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞 和吸收，也有利于胞內(nèi)物質(zhì)的分泌，可顯著提高產(chǎn)率。 由于有載體的保護(hù)作用，具有較好的操作穩(wěn)定性和保存穩(wěn)定性，可反復(fù)使用或連 續(xù)使用較長時間，利于連續(xù)化生產(chǎn)。 易于和發(fā)酵產(chǎn)物分開，有利于產(chǎn)物的分離純化，提高產(chǎn)品

35、質(zhì)量。 發(fā)酵的培養(yǎng)基中需要添加穩(wěn)定劑，以保持原生質(zhì)體的穩(wěn)定性。這些滲透壓穩(wěn)定劑 在發(fā)酵結(jié)束后，可采用層析或膜分離技術(shù)等方法與產(chǎn)物分離。1、細(xì)胞破碎的目的、方法。? 大多數(shù)酶都存在于細(xì)胞內(nèi)部，為了獲得細(xì)胞內(nèi)的酶，首先要收集細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞破碎，使細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，然后進(jìn)行酶的提取與分離純化。? 機(jī)械法? 物理法? 化學(xué)法? 酶促破碎法(酶解)2選擇細(xì)胞破碎方法的依據(jù)。?(1)細(xì)胞的處理量：大規(guī)模用機(jī)械法，小規(guī)模用非機(jī)械法。?(2)細(xì)胞壁的強(qiáng)度與結(jié)構(gòu)? (3)目標(biāo)產(chǎn)物對破碎條件的影響。機(jī)械法考慮剪切力， 酶法考慮對目標(biāo)產(chǎn)物是否具有降解作用。?(4 )破碎程度：高壓勻漿法，細(xì)胞碎片細(xì)小，固液分離困難

36、。?(5 )提取分離的難易3. 酶抽提的目標(biāo)及方法。提取目標(biāo)：? a.將目的酶最大限度地溶解出來。? b.保持生物活性。提取原則? a.相似相溶。? b.遠(yuǎn)離等電點的pH值，溶解度增加。4. 三種離心方法（差速離心、密度梯度離心和等密度梯度離心）的特點。（1）差速離心特點：用于分離大小和密度差異較大的顆粒。（2）密度梯度離心特點：? 區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì)? 顆粒的密度。? 適宜分離密度相近而大小不同的固相? 物質(zhì)。（3 ）等密度梯度離心特點：? 介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離物質(zhì)的密度。? 適于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同的物質(zhì)。5. 酶的分離純化過程中常用沉淀法的種類及原理。種

37、類：中性鹽沉淀（鹽析法）基本原理（鹽溶和鹽析）向蛋白質(zhì)或酶的水溶液中加入中性鹽，可產(chǎn)生兩種現(xiàn)象：1）鹽溶（salting in ）:低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。2）鹽析（salting out ）:高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。有機(jī)溶劑沉淀利用酶等蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同而使之分離的方法。1. 沉淀機(jī)理降低溶液的介電常數(shù)部分地引起蛋白質(zhì)脫水2. 常用有機(jī)溶劑丙酮乙醇甲醇，用量一般為酶液體積的2倍左右，終濃度為 70%選擇性沉淀（熱變性和酸堿變性）選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白質(zhì)變性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法。熱變性幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固，加熱升高溫度使雜蛋

38、白變性沉淀而保留目的物在溶液中。pH變性等電點沉淀法是pH變性法中的一種變體。有機(jī)溶劑變性使那些對有機(jī)溶劑敏感的雜蛋白變性沉淀。等電點沉淀原理：蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點有機(jī)聚合物沉淀作用機(jī)理：與有機(jī)溶劑類似，是發(fā)展較快的一種新方法。沉淀劑：常用聚乙二醇（簡寫PEG ）多用分子量為 600020000的PEG。6. 雙水相萃取、超臨界流體萃取的概念。? 超臨界萃取，又稱為超臨界流體萃取，是利用欲分離物質(zhì)與雜質(zhì)在超臨界流體中的 溶解度不同而達(dá)到分離的一種萃取技術(shù)。? 利用溶質(zhì)在兩個互不相溶的水相中的溶解度不同而達(dá)到分離。7. 膜分離的原理及應(yīng)用。? 膜分離過程中，薄膜

39、的作用是選擇性地讓小于其孔徑的物質(zhì)顆粒或分子通過，而把大于其孔徑的顆粒截留。? 應(yīng)用（自己整理）超濾法在蛋白質(zhì)溶液除鹽、濃縮及分離純化中有廣泛的應(yīng)用。? 反滲透：海水淡化? 電場膜分離：脫鹽，海水淡化，純水制備，從發(fā)酵液中分離檸檬酸、谷氨酸及凝膠 電洗脫。8. 比較吸附層析、疏水層析、離子交換層析、凝膠過濾、親和層析，高效液相色譜的概念及原理上的不同點。? 吸附層析是利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離的層析方 法。? 離子交換層析是利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對各種離子的親和力 不同而達(dá)到分離目的的一種層析分離方法。? 凝膠層析又稱為凝膠過濾、分子排阻層析、分子

40、篩層析等，是指以各種凝膠為固定 相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離的一種層析技 術(shù)。? 親和層析是利用生物分子與配基之間所具有的可逆的親和力，使生物分子分離純化 的層析技術(shù)。? HPLC是利用樣品中的溶質(zhì)在固定相和流動相之間分配系數(shù)的不同，進(jìn)行連續(xù)的無數(shù)次的交換和分配而達(dá)到分離的過程。9. 比較連續(xù)與非連續(xù)、變性與非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)別。連續(xù)電泳（continuous electrophoresis）采用相同孔徑的凝膠和相同的緩沖系統(tǒng)不連續(xù)電泳（discontinuous electrophoresis） 采用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系連續(xù)PAGE電荷效應(yīng)、分

41、子篩效應(yīng)不連續(xù)PAGE電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、濃縮效應(yīng)系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個方面：1. 凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。2. 緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同。電極緩沖液為 pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.7的Tris-HCl緩沖液，而分離膠為 pH8.9的Tris-HCl緩沖液。3. 在電場中形成不連續(xù)的電位梯度。因此，在這樣一個不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即樣品的濃縮效應(yīng)，凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，提高了分辨率。變性聚丙烯酰胺凝膠電泳：加了SDS非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳：不加SDS10. 蛋白質(zhì)濃度

42、測定方法及酶活力測定方法。蛋白質(zhì)濃度測定1. 紫外吸收法：酪氨酸、色氨酸殘基中苯環(huán)有共軛雙鍵，在A280有最大吸收。特點：簡便、快速、不損耗樣品，但干擾因素多。2. 雙縮脲法：具有兩個或兩個以上肽鍵的化合物均有雙縮脲反應(yīng)。優(yōu)點：快速；缺點：靈敏度差3. 酚試劑（Folin-酚）測定法：繁瑣，但靈敏度、準(zhǔn)確度高。4. 染料結(jié)合法（考馬斯亮藍(lán)染色法）：又稱Bradford法，靈敏、簡便、快速、干擾少，是 近年來常用的檢測法。11. 比活力、提純倍數(shù)、回收率的含義及用途。 酶的比活力（純度）=活力單位數(shù)/毫克蛋白比活力越高，酶純度也越好。表示酶制劑純度的一個指標(biāo)。純化倍數(shù)=提純后比活力/提純前比活力

43、表示提純過程中純度提高的倍數(shù)。提純倍數(shù)越大，表示該方法純化效果越好?？偦盍?酶活力單位數(shù)酶液總體積即樣品中全部酶活力?；厥章?提純后酶總活力/提純前酶總活力x 100% 表示提純過程中酶損失程度的大小?；厥章试礁撸瑩p失越小。判斷一個分離純化方法的優(yōu)劣，常用總活力的回收率和比活力的提純倍數(shù)兩個指標(biāo)?；厥章剩悍从趁傅膿p失情況。 提純倍數(shù)：表示方法的有效程度。 一個好的純化步驟是回收率較高，提純倍數(shù)也較大。12. 電泳的基本原理是什么？在一定pH條件下（用buffer ）,不同大小、形狀及帶電顆粒在電場中的移動速度不同（用 遷移率表示），各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶。13. 凝膠過濾層析

44、有哪四個方面的應(yīng)用。1）脫鹽2）生物大分子物質(zhì)的分離純化3）分子量的測定4）溶液濃縮14. 影響凝膠過濾分辨率的因素有哪些？分配系數(shù)的含義及作用。凝膠對溶質(zhì)的排阻程度可用分配系數(shù)Kd表示：Ve-VoKd=ViVo外水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積（ml）Vi內(nèi)水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部各微孔體積的總和（ml）Ve某組分的洗脫體積，從加進(jìn)層析柱到流出液中該組分出現(xiàn)高峰時的洗脫液體積（ml）分配系數(shù)Kd的意義：1）可定量地衡量各組分的流出順序。2）判斷分離效果，Kd差異大，分離效果好，Kd差異小，分離效果差。15 .酶的分離純化中，純化方法的排序.先選用粗放、快速、有利于縮小樣品體積的方法

45、。精確、費(fèi)時、需樣品少的方法，宜后選用。16.酶結(jié)晶的主要方法有哪些？?1、鹽析結(jié)晶法；?2、有機(jī)溶劑結(jié)晶法；?3、等電點結(jié)晶法?4、透析平衡結(jié)晶法?5、溫度差結(jié)晶法?6、金屬離子復(fù)合結(jié)晶法 1酶活性中心的特點。（1）活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。（2）活性部位是一個三維實體。（3）活性中心位于酶分子表面的疏水性裂縫中。（4）活性中心構(gòu)象不是固定不變的（誘導(dǎo)契合）。（5）酶與底物通過鹽鍵、氫鍵、范德華力和疏水作用等次級鍵結(jié)合。2、研究酶活性中心的方法。1物理學(xué)方法：用X射線衍射法直接檢測底物或其類似物與酶形成的中間復(fù)合物（包括酶和底物）的相對 2化學(xué)修飾法：根據(jù)所用修飾試劑不同，

46、分為1）非專一性化學(xué)修飾2）專一性化學(xué)修飾（基團(tuán)專一性修飾）3）親和標(biāo)記（位點專一性修飾）3蛋白質(zhì)工程：將酶相應(yīng)的cDNA定點突變，突變的 cDNA只表達(dá)一個或幾個氨基酸被置換的酶蛋白，測 定其活性可知被置換的氨基酸是否為活力所必需。3、那些蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)可以被修飾？20種不同氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)中只有極性氨基酸的側(cè)鏈易被修飾，它們一般具有親核性。 側(cè)鏈基團(tuán)：組成蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的功能團(tuán)。主要有：氨基、羧基、胍基、巰基、酚基、 咪唑基。4、酶分子的概念和作用酶分子是具有完整的化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)的生物大分子。作用：通過酶分子修飾，可以使酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生某些合理的改變，就有可能提高酶的催化效率、增強(qiáng)酶

47、的穩(wěn)定性、降低或消除酶的抗原性、改變酶的底物專一性等。同時通過酶分子修飾，研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對酶分子空間的構(gòu)象的影響，可以進(jìn)一步探討其結(jié)構(gòu)與催化特性之間的關(guān)系。5、酶分子修飾的方法有哪些對酶分子的修飾方法分為化學(xué)法、生物法和物理法?；瘜W(xué)法：金屬離子置換法、大分子修飾法、肽鏈有限水解法、蛋白側(cè)鏈基團(tuán)的小分子修飾法等。生物法：通過基因工程的手段改變蛋白質(zhì)，即基于核酸水平對蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，利用基因操作技術(shù)對DNA或mRNA進(jìn)行改造和修飾以期獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)更為合理的蛋白質(zhì)。物理修飾法：不改變酶的組成和基團(tuán)，酶分子的共價鍵不發(fā)生變化。6、何謂金屬離子置換修飾？簡

48、述其主要修飾過程和作用。把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的催化特性發(fā)生改變的修飾方法稱為金屬離子置換修飾。純酶一加入金屬離子的螯合劑除去金屬螯合物測酶活力變化分別加入不同的金屬離 子，使其與酶蛋白結(jié)合確定較優(yōu)的離子作用：1闡明金屬離子對酶催化作用的影響2提高酶的催化效率 3增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性 4改變酶的動力學(xué)特征8、酶分子化學(xué)修飾和酶的固定化在目的方法上的異同點。相同點：側(cè)鏈基團(tuán)修飾中的分子內(nèi)交聯(lián)修飾實際就是酶的固定化中的交聯(lián)法固定化酶。不同點：其他：二、活性中心的共性活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。（2）活性部位是一個三維實體。（3）活性中心位于酶分子表面的疏水性裂縫中。

49、（4）活性中心構(gòu)象不是固定不變的（誘導(dǎo)契合）。（5）酶與底物通過鹽鍵、氫鍵、范德華力和疏水作用等次級鍵結(jié)合。限制酶大規(guī)模應(yīng)用的原因：1）細(xì)胞外穩(wěn)定性差；2）酶活性不夠高；3）具有抗原性。改變酶特性有兩種主要的方法1）通過分子修飾的方法來改變已分離出來的天然酶的活性。2）通過基因工程方法改變編碼酶分子的基因而達(dá)到改造酶的目的。3. 酶化學(xué)修飾的概念酶的化學(xué)修飾（chemical modification ）:通過化學(xué)基團(tuán)的引入或除去，使蛋白質(zhì)共價結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。酶選擇性化學(xué)修飾：在較溫和的條件下，以可以控制的方式使一種蛋白質(zhì)同某些化學(xué)試 劑起特異反應(yīng)，從而引起單個氨基酸殘基或其功能基發(fā)生共價的化學(xué)

50、變化。二、酶化學(xué)修飾的目的1）提高酶的生物活性（酶活力）。2）增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性、體內(nèi)半衰期）。3）消除抗原性（針對特異性反應(yīng)降低生物識別能力）。4）產(chǎn)生新的催化能力。酶化學(xué)修飾的原理一、如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性修飾劑分子存在多個反應(yīng)基團(tuán)，可與酶形成多點交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生剛性”結(jié)構(gòu)。二、如何保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，遮蓋”了酶的活性部位。如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶酶化學(xué)修飾后通過兩種途徑抗蛋白水解酶：1. 大分子修飾劑產(chǎn)生空間障礙阻擋蛋白水解酶接近酶分子。遮蓋”酶分子上敏感鍵免遭破壞。2. 酶分子上許

51、多敏感基團(tuán)交聯(lián)上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性 如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境1. 酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成了共價鍵。破壞了抗原決定簇 一一抗原性降低乃至消除遮蓋”了抗原決定簇一一阻礙抗原、抗體結(jié)合2. 大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表面形成 緩沖外殼”，抵御外界環(huán)境的極性變化，維持酶活性部位微環(huán)境相對穩(wěn)定。一、酶的表面化學(xué)修飾（一）大分子修飾（大分子結(jié)合修飾）1定義：利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改 變酶的特性與功能的方法。2. 修飾劑： 聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextra n ）、肝素（hepari n）、

52、蔗糖聚合物（Ficoll） 修飾方法：修飾前活化”然后在一定條件下與酶分子共價結(jié)合。（二）小分子修飾（酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾）定義：通過選擇性的試劑或親和標(biāo)記試劑與酶分子側(cè)鏈上特定的功能基團(tuán)發(fā)生化學(xué) 反應(yīng)。側(cè)鏈基團(tuán)：組成蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的功能團(tuán)。主要有：氨基、羧基、胍基、巰基、 酚基、咪唑基。側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑：采用的各種小分子化合物。20種不同氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)中只有極性氨基酸的側(cè)鏈易被修飾，它們一般具有親核性。特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾1）氨基的化學(xué)修飾：來源：Lys, Arg, His, Gln修飾反應(yīng)：?；c烷基化酰基化修飾劑：三硝基苯磺酸（TNBS ）、丹磺酰氯（DNS）烷基化修飾劑

53、：2，4二硝基氟苯（DNFB ）、碘乙酸、碘乙酰胺、亞硝酸等2）羧基的化學(xué)修飾修飾羧基的反應(yīng)專一性較差。常用水溶性碳化二亞胺修飾天冬氨酸和谷氨酸。可定量測定酶分子中羧基的數(shù)目3）胍基的化學(xué)修飾來源：Arg修飾反應(yīng)：本質(zhì)上是羰基對氨基酰基化4）巰基的化學(xué)修飾來源：Cys修飾反應(yīng)：烷基化修飾劑：碘乙酸（IAA）.碘乙酰胺（IAM）?5）二硫鍵的化學(xué)修飾? 還原：巰基乙醇、二硫蘇糖醇（ DTT ）?6）咪唑基的化學(xué)修飾?來源：His?修飾反應(yīng)：酰基化與烷基化??；揎梽?常用焦碳酸二乙酯（diethyl paracarbo nate）?7）酚羥基的化學(xué)修飾? 來源：Tyr? 修飾反應(yīng)：芳香環(huán)取代

54、反應(yīng)? 修飾劑：碘、硝化試劑（四硝基甲烷）?8）吲哚基的化學(xué)修飾? 來源：Trp? 修飾反應(yīng)：氧化反應(yīng)? 修飾劑：N-溴代琥珀酰亞胺但解釋修飾效果須十分小心，因為： 任何一種修飾劑不是絕對專一的。 有些修飾劑引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化一一失活，不一定是活性中心基團(tuán)被共價修飾。 不同部分的相同基團(tuán)，修飾效果不同，分子內(nèi)部的必需基團(tuán)，不易被修飾。（三）交聯(lián)修飾（交聯(lián)法）用雙功能基團(tuán)試劑（如戊二醛），與酶分子內(nèi)不同肽鏈部分共價交聯(lián)，使酶分子空間構(gòu)象 更加穩(wěn)定。（四）固定化修飾（共價偶聯(lián)法）通過酶表面的酸性或堿性殘基，將酶共價連接到惰性載體上，由于酶所處的微環(huán)境發(fā)生 改變，使酶的最適 pH、最適溫度和穩(wěn)定性發(fā)生改變。酶分子內(nèi)部修飾（一）蛋白主鏈修飾（肽鏈有限水解修飾）蛋白主鏈修飾采用酶法（用專一性較強(qiáng)的蛋白酶或肽酶為修飾劑）。酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下三種情況中的一種：1引起酶活性中心的破壞，酶失去催化功能。2仍