生物工程實(shí)驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)一 克隆載體重組子的抽提 （重組質(zhì)粒的提取、電泳鑒定及酶切鑒定） 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、掌握堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。 2、掌握質(zhì)粒的電泳鑒定 3、學(xué)習(xí)質(zhì)粒的酶切鑒定 1）堿裂解提取質(zhì)粒原理：）堿裂解提取質(zhì)粒原理： 主要利用宿主染色體主要利用宿主染色體DNA與質(zhì)粒與質(zhì)粒DNA之間的結(jié)構(gòu)和大小的之間的結(jié)構(gòu)和大小的 差異進(jìn)行分離提取的。差異進(jìn)行分離提取的。 二、實(shí)驗(yàn)原理 染色體DNA質(zhì)粒DNA 二、實(shí)驗(yàn)原理 1）堿裂解提取質(zhì)粒原理：）堿裂解提取質(zhì)粒原理： 主要利用宿主染色體主要利用宿主染色體DNA與質(zhì)粒與質(zhì)粒DNA之間的結(jié)構(gòu)和大小的差異進(jìn)行分離之間的結(jié)構(gòu)和大小的差異進(jìn)行分離 提取的。提取的。 收集菌

2、收集菌 體并用體并用 GTEGTE懸浮懸浮 NaOHNaOH SDSSDS 裂解裂解 變變 性性 二者都沉淀二者都沉淀 加入加入KACKAC 小分子小分子 蛋白蛋白 大分子不溶性大分子不溶性 蛋白和殘?jiān)鞍缀蜌堅(jiān)?離心離心 分離分離 取上清取上清 異丙醇沉淀異丙醇沉淀 質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA 苯酚苯酚- -氯仿除蛋白氯仿除蛋白 獲得較純凈質(zhì)粒獲得較純凈質(zhì)粒 染色體染色體 DNADNA 二、實(shí)驗(yàn)原理 2）瓊脂糖凝膠電泳：）瓊脂糖凝膠電泳：agarose gel電泳是分離鑒定和純化電泳是分離鑒定和純化DNA分子的常用方分子的常用方 法，不同濃度的瓊脂糖膠可分離法，不同濃度的瓊脂糖膠可分離100bp-

3、60kb的的DNA片段，在瓊脂糖電泳片段，在瓊脂糖電泳 中，中，DNA遷移的速率不僅與其分子浪的對數(shù)值成反比，即分子量越大，遷移的速率不僅與其分子浪的對數(shù)值成反比，即分子量越大， 移動(dòng)速率越慢，而且還與分子構(gòu)型有關(guān)。如質(zhì)粒開環(huán)移動(dòng)速率越慢，而且還與分子構(gòu)型有關(guān)。如質(zhì)粒開環(huán)DNA線性線性DNA 共價(jià)閉合環(huán)狀共價(jià)閉合環(huán)狀DNA 染色體DNA 質(zhì)粒DNA 3）限制性核酸內(nèi)切酶）限制性核酸內(nèi)切酶: 是一類能夠識(shí)別雙鏈?zhǔn)且活惸軌蜃R(shí)別雙鏈DNA分子內(nèi)部的特異序列，并在識(shí)分子內(nèi)部的特異序列，并在識(shí) 別位點(diǎn)或其周圍產(chǎn)生切割作用的核酸水解酶，它存在于細(xì)菌別位點(diǎn)或其周圍產(chǎn)生切割作用的核酸水解酶，它存在于細(xì)菌 體內(nèi)

4、與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)即保護(hù)自身體內(nèi)與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)即保護(hù)自身 DNA，限制外源，限制外源DNA。4-6堿基對，具有回紋結(jié)構(gòu)的堿基對，具有回紋結(jié)構(gòu)的DNA 片段；片段；水解水解DNA分子的磷酸二酯鍵分子的磷酸二酯鍵切割方式有兩種：黏切割方式有兩種：黏 性末端和平末端性末端和平末端 切切4堿基，平均堿基，平均256bp出現(xiàn)一次切點(diǎn)，切出現(xiàn)一次切點(diǎn)，切6-8堿基堿基 時(shí)，每隔時(shí)，每隔4-65kb出現(xiàn)一次切點(diǎn)出現(xiàn)一次切點(diǎn) 二、實(shí)驗(yàn)原理 三、實(shí)驗(yàn)步驟三、實(shí)驗(yàn)步驟 1、質(zhì)粒、質(zhì)粒DNA的提?。旱奶崛。?在含抗生素、IPTG和X-gal的平板上隨機(jī)挑出數(shù)個(gè)白色菌落，接種到

5、5ml LB- AMP液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過夜至對數(shù)生長期。 取1.5ml對數(shù)生長期的菌體與EP管中，在臺(tái)式離心機(jī)上8000rpm離心30秒收集 菌體。 棄上清，將EP管倒置在吸水紙上，吸干溶液。 加100ul GTE緩沖液，用移液器輕輕吹打，使菌體重新懸浮，室溫放置5分鐘。 加入200ul NaOH-SDS溶液，顛倒混勻10次，然后置冰浴5分鐘。 加入150ul預(yù)冷的乙酸鉀溶液，充分混勻，置冰浴5分鐘。 在4下于臺(tái)式高速離心機(jī)12000rpm離心5分鐘，并將上清移至另一支新的EP 管中。 加等體積的酚、氯仿抽提一次，12000rpm離心5分鐘，取上層水相至另一支 新的 EP管中，加等體

6、積氯仿抽提一次，12000rpm離心5分鐘，取上層水相至另一 支新的EP管中。 加等體積異丙醇，置冰浴30min，12000rpm離心10分鐘，棄上清。 沉淀用70%乙醇0.5ml洗一次，棄上清并真空干燥。用30ulTE溶解沉淀的DNA， 加入2ug/ul Rnase溶液 2ul，3710min，置于4保存。 三、實(shí)驗(yàn)步驟 2、瓊脂糖凝膠電泳鑒定：、瓊脂糖凝膠電泳鑒定：DNA電泳時(shí)間為電泳時(shí)間為30-60min 1）用電泳緩沖液制作）用電泳緩沖液制作1.0%的瓊脂糖凝膠，冷卻至的瓊脂糖凝膠，冷卻至60后加入終濃度 0.5ug/ml的EB-紫外下的顯色物質(zhì) 2）待膠凝固后，拔出梳子，取出帶膠的托

7、盤，一起放入電泳槽，使電）待膠凝固后，拔出梳子，取出帶膠的托盤，一起放入電泳槽，使電 泳緩沖液的液面高出凝膠。泳緩沖液的液面高出凝膠。 3）?。┤?0ulPCR產(chǎn)物，加入產(chǎn)物，加入4ul 6 的上樣緩沖液（溴酚藍(lán)），混合后用微的上樣緩沖液（溴酚藍(lán)），混合后用微 量進(jìn)樣器小心加入樣品孔。量進(jìn)樣器小心加入樣品孔。 4）以靠近上樣端為負(fù)極，另一端為正極，接通電源，以）以靠近上樣端為負(fù)極，另一端為正極，接通電源，以5V/cm的電壓電的電壓電 泳泳30-60min。 5）電泳結(jié)束后，帶手套取出凝膠置透明薄膜上，紫外燈下觀察結(jié)果 三、實(shí)驗(yàn)步驟 3、質(zhì)粒的酶切鑒定：、質(zhì)粒的酶切鑒定： 1） 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA酶

8、切反應(yīng)體系酶切反應(yīng)體系 10 酶切酶切buffer 3 l 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA 10 l EcoR1（10u/ l） 1 l BamH1（ 10u/ l ） 1 l ddH2O加至加至 20 l 37水浴保溫水浴保溫1-2h；72 水浴水浴15min終止反應(yīng)。終止反應(yīng)。 3、電泳檢測目的基因片段（電泳方法同前）、電泳檢測目的基因片段（電泳方法同前） 4、結(jié)果分析、結(jié)果分析 四、注意事項(xiàng) 1、抽提質(zhì)粒過程應(yīng)盡量保持低溫 2、質(zhì)粒制備過程中要盡量除去蛋白，否則會(huì)影響后面的酶 切或連接 3、沉淀DNA常用等體積的異丙醇，但易將鹽也沉淀下來，可 以用二倍體積的冰乙醇避免鹽的沉淀。 4、EB是強(qiáng)致癌物，注意

9、操作安全； 5、瓊脂糖的濃度要根據(jù)分離鑒定的DNA的大小不同而配制不 同的濃度； 6、DNA的純度對酶切和連接很重要； 五、思考題 1、堿裂解法提取質(zhì)粒的原理？ 實(shí)驗(yàn)二 目的基因的回收、連接反應(yīng) （酶切體系的電泳鑒定、回收、純化、與載體連接） 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、掌握目的片段的電泳鑒定。 2、 DNA的膠回收實(shí)驗(yàn) 3、掌握克隆的原理 二、實(shí)驗(yàn)原理 1）瓊脂糖凝膠電泳：）瓊脂糖凝膠電泳：agarose gel電泳是分離鑒定和純化電泳是分離鑒定和純化DNA分子的常用方分子的常用方 法，不同濃度的瓊脂糖膠可分離法，不同濃度的瓊脂糖膠可分離100bp-60kb的的DNA片段，在瓊脂糖電泳片段，在瓊脂糖電

10、泳 中，中，DNA遷移的速率不僅與其分子量的對數(shù)值成反比，即分子量越大，遷移的速率不僅與其分子量的對數(shù)值成反比，即分子量越大， 移動(dòng)速率越慢，而且還與分子構(gòu)型有關(guān)。移動(dòng)速率越慢，而且還與分子構(gòu)型有關(guān)。 二、二、 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 2）T4DNA連接酶連接酶: DNA連接酶是一種封閉連接酶是一種封閉DNA鏈上的缺口的酶，借助于鏈上的缺口的酶，借助于ATP或或 NAD+水解提供的能量，催化水解提供的能量，催化DNA的的3-OH與與5的磷酸基團(tuán)生成磷酸二酯健。的磷酸基團(tuán)生成磷酸二酯健。 T4DNA連接酶則連接雙鏈連接酶則連接雙鏈DNA分子的粘性末端或平端。分子的粘性末端或平端。 二、二、 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)

11、驗(yàn)原理 3）TA克隆克隆;利用利用Taq酶在延伸過程中會(huì)在酶在延伸過程中會(huì)在DNA的末端加的末端加A的特性，使的特性，使PCR擴(kuò)增產(chǎn)擴(kuò)增產(chǎn) 物和帶物和帶T尾的載體在連接酶的作用下連接起來。尾的載體在連接酶的作用下連接起來。 三、實(shí)驗(yàn)步驟 1、瓊脂糖凝膠電泳鑒定：、瓊脂糖凝膠電泳鑒定：DNA電泳時(shí)間為電泳時(shí)間為30-60min 1）用電泳緩沖液制作）用電泳緩沖液制作1.0%的瓊脂糖凝膠，冷卻至的瓊脂糖凝膠，冷卻至60后加入終濃度 0.5ug/ml的EB-紫外下的顯色物質(zhì) 2）待膠凝固后，拔出梳子，取出帶膠的托盤，一起放入電泳槽，使電）待膠凝固后，拔出梳子，取出帶膠的托盤，一起放入電泳槽，使電 泳

12、緩沖液的液面高出凝膠。泳緩沖液的液面高出凝膠。 3）?。┤?0ulPCR產(chǎn)物，加入產(chǎn)物，加入4ul 6 的上樣緩沖液（溴酚藍(lán)），混合后用微的上樣緩沖液（溴酚藍(lán)），混合后用微 量進(jìn)樣器小心加入樣品孔。量進(jìn)樣器小心加入樣品孔。 4）以靠近上樣端為負(fù)極，另一端為正極，接通電源，以）以靠近上樣端為負(fù)極，另一端為正極，接通電源，以5V/cm的電壓電的電壓電 泳泳30-60min。 5）電泳結(jié)束后，帶手套取出凝膠置透明薄膜上，紫外燈下觀察結(jié)果 三、實(shí)驗(yàn)步驟 2、DNA的膠回收：的膠回收： 切取瓊脂糖凝膠上目的片段，稱量膠的重量切取瓊脂糖凝膠上目的片段，稱量膠的重量 1、按、按Binding Buffe ：

13、PCR產(chǎn)物產(chǎn)物=4：1比例加入比例加入Binding Buffer，混勻；置于，混勻；置于50-60 水浴10min，使膠徹底融化 2、把混合液轉(zhuǎn)移到收集管的、把混合液轉(zhuǎn)移到收集管的UNIQ-10柱中，室溫放置柱中，室溫放置 2min，8000rpm離心離心1min 3、倒掉收集管中的廢液，加、倒掉收集管中的廢液，加500ul Wash Solution 到到 UNIQ-10柱子中，柱子中，8000rpm室溫離心室溫離心1min 4、重復(fù)步驟、重復(fù)步驟3 5、倒掉收集管中的廢液，將、倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一收集柱放入同一收集 管中，管中，12000rpm離心離心15s 6

14、、將、將UNIQ-10柱放入新的柱放入新的1.5ml離心管中，在柱子膜中離心管中，在柱子膜中 央加央加30ul Elution Buffer或者水，室溫或或者水，室溫或37放置放置2min 7、12000rpm室溫離心室溫離心1min，離心管中的液體即為回收，離心管中的液體即為回收 的的DNA片段。片段。 三、實(shí)驗(yàn)步驟 3、與載體連接、與載體連接 PCR產(chǎn)物克隆試劑盒產(chǎn)物克隆試劑盒 連接反應(yīng)體系：連接反應(yīng)體系： 10 Ligation Buffer 1ul pUCm-T vector 1ul 純化的純化的PCR產(chǎn)物產(chǎn)物 3ul dd H2O 3ul T4 DNA Ligase 1ul Fina

15、l Volume 10ul 16 連接過夜連接過夜 四、注意事項(xiàng) 1、EB是強(qiáng)致癌物，注意操作安全； 2、瓊脂糖的濃度要根據(jù)分離鑒定的DNA的大小不同而配制不 同的濃度； 3、DNA的純度對酶切和連接很重要； 五、思考題 1、T4連接酶與大腸桿菌DNA連接酶作用上有何區(qū)別 ？ 實(shí)驗(yàn)三 感受態(tài)細(xì)胞的制備、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、掌握感受態(tài)細(xì)胞的制備。 2、掌握DNA轉(zhuǎn)化過程 3、掌握藍(lán)白斑篩選的原理 二、實(shí)驗(yàn)原理 1）感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的原理：）感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的原理： 受體細(xì)胞處于感受態(tài)即能從環(huán)境中吸取受體細(xì)胞處于感受態(tài)即能從環(huán)境中吸取DNA的一種生理狀態(tài)。在冰浴條的一種生理狀態(tài)。在冰浴條 件

16、先，用件先，用0.1M的的CaCl2溶液懸浮活化的溶液懸浮活化的E.coli DH5a菌，使其膜的通透性菌，使其膜的通透性 增大而成為感受態(tài)細(xì)胞，當(dāng)外源重組增大而成為感受態(tài)細(xì)胞，當(dāng)外源重組DNA與感受態(tài)細(xì)胞混合后在冰浴中與感受態(tài)細(xì)胞混合后在冰浴中 孵育后，外源重組質(zhì)粒孵育后，外源重組質(zhì)粒DNA就有可能進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，并通過自我復(fù)就有可能進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，并通過自我復(fù) 制實(shí)現(xiàn)遺傳信息轉(zhuǎn)移，使宿主細(xì)胞出現(xiàn)新性狀，即感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化制實(shí)現(xiàn)遺傳信息轉(zhuǎn)移，使宿主細(xì)胞出現(xiàn)新性狀，即感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化 2）轉(zhuǎn)化子藍(lán)白斑篩選的原理）轉(zhuǎn)化子藍(lán)白斑篩選的原理: 使用的載體帶有大腸桿菌的使用的載體帶有大腸桿菌的DNA短

17、區(qū)段，含有短區(qū)段，含有 -半乳糖苷半乳糖苷 酶基因（酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和）的調(diào)控序列和N端端146個(gè)氨基酸的編碼信息，個(gè)氨基酸的編碼信息， 這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)，它并不破壞讀框，宿這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)，它并不破壞讀框，宿 主細(xì)胞攜帶編碼主細(xì)胞攜帶編碼 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶C端部分序列，雖然宿主和質(zhì)端部分序列，雖然宿主和質(zhì) 粒的片段各自都沒有酶活性，但能融為一體，形成具有活性粒的片段各自都沒有酶活性，但能融為一體，形成具有活性 的酶蛋白質(zhì)的酶蛋白質(zhì)- -半乳糖苷酶，這種互補(bǔ)現(xiàn)象叫半乳糖苷酶，這種互補(bǔ)現(xiàn)象叫 互補(bǔ)，在生色互補(bǔ)，在生色 物質(zhì)物質(zhì)X-gal存在下形成

18、藍(lán)色菌落，但在外源基因插入到多克存在下形成藍(lán)色菌落，但在外源基因插入到多克 隆位點(diǎn)后，破壞了質(zhì)粒載體隆位點(diǎn)后，破壞了質(zhì)粒載體 -半乳糖苷基因讀框，不能編碼半乳糖苷基因讀框，不能編碼 -半乳糖苷酶，就形成白色菌落。半乳糖苷酶，就形成白色菌落。 二、實(shí)驗(yàn)原理 三、實(shí)驗(yàn)步驟 1、感受態(tài)細(xì)胞的制備：、感受態(tài)細(xì)胞的制備： 1）新活化的E.coli DH5菌平板挑取一單菌落，接種于3-5ml的LB液 體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)12小時(shí)左右，至對數(shù)生長期。 2.）上述菌液以1：50量接種到100ml液體培養(yǎng)基中。擴(kuò)大培養(yǎng)至 A600nm=0.7（振蕩培養(yǎng)2小時(shí)） 3）培養(yǎng)液在水浴中冷卻片刻后，取1.5ml菌液

19、用冰預(yù)冷的1.5ml離心管 0-4 8000rpm離心5min收集菌體。 4） 去上清，用0.5ml冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰 裕 放置，15-30分鐘 5）0-4 4000rpm離心10分鐘收集菌體 6）傾去上清，加入200ul預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞 置于冰裕中3-5min后待用轉(zhuǎn)化，或加15-20%的甘油置于-40保存 備用。 三、實(shí)驗(yàn)步驟 2、重組、重組DNA的轉(zhuǎn)化：的轉(zhuǎn)化： 1） 上述上述Ep管中加入管中加入10ul連接反應(yīng)混合物，輕輕連接反應(yīng)混合物，輕輕 搖勻，搖勻， 冰裕中放置冰裕中放置30分鐘。分鐘。 2） 再于再于42

20、水浴中保溫水浴中保溫90秒，然后迅速在冰裕中冷卻秒，然后迅速在冰裕中冷卻 3-5分鐘。分鐘。 3） 加入加入500ul LB培養(yǎng)液，搖勻后于培養(yǎng)液，搖勻后于37溫裕溫裕30-60分鐘。分鐘。 4） 將上述轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液涂于含氨芐青霉素、將上述轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液涂于含氨芐青霉素、IPTG和和X- Gal的的LB固體培養(yǎng)基中。固體培養(yǎng)基中。 5） 待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿，37培培 養(yǎng)過夜，觀察菌落。養(yǎng)過夜，觀察菌落。 四、注意事項(xiàng) 1、轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)必須在低溫中進(jìn)行，溫度波動(dòng)嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)化效 率，所用的試劑均應(yīng)冰浴，細(xì)菌保持在4以下； 2、轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)要做好對照，以

21、檢測感受態(tài)的細(xì)胞和重組質(zhì)粒； 以已知質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞做陽性對照；以TE緩沖也轉(zhuǎn)化 感受態(tài)細(xì)胞做陰性對照 五、思考題 1、重組DNA導(dǎo)入原核細(xì)胞有哪些方法？ 2、藍(lán)白斑篩選的原理？ 實(shí)驗(yàn)四 pET-28a-SOD表達(dá)重組質(zhì)粒的鑒定 （重組質(zhì)粒的提取、酶切及電泳鑒定） 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、學(xué)習(xí)掌握重組子的篩選與驗(yàn)證 2、掌握堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。 3、掌握質(zhì)粒的酶切電泳鑒定 1）堿裂解提取質(zhì)粒原理：）堿裂解提取質(zhì)粒原理： 主要利用宿主染色體主要利用宿主染色體DNA與質(zhì)粒與質(zhì)粒DNA之間的結(jié)構(gòu)和大小的之間的結(jié)構(gòu)和大小的 差異進(jìn)行分離提取的。差異進(jìn)行分離提取的。 二、實(shí)驗(yàn)原理 二、實(shí)驗(yàn)原理 1）堿裂

22、解提取質(zhì)粒原理：）堿裂解提取質(zhì)粒原理： 主要利用宿主染色體主要利用宿主染色體DNA與質(zhì)粒與質(zhì)粒DNA之間的結(jié)構(gòu)和大小的差異進(jìn)行分離之間的結(jié)構(gòu)和大小的差異進(jìn)行分離 提取的。提取的。 收集菌收集菌 體并用體并用 GTEGTE懸浮懸浮 NaOHNaOH SDSSDS 裂解裂解 變變 性性 二者都沉淀二者都沉淀 加入加入KACKAC 小分子小分子 蛋白蛋白 大分子不溶性大分子不溶性 蛋白和殘?jiān)鞍缀蜌堅(jiān)?離心離心 分離分離 取上清取上清 異丙醇沉淀異丙醇沉淀 質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA 苯酚苯酚- -氯仿除蛋白氯仿除蛋白 獲得較純凈質(zhì)粒獲得較純凈質(zhì)粒 染色體染色體 DNADNA 二、實(shí)驗(yàn)原理 2）瓊脂糖凝膠

23、電泳：）瓊脂糖凝膠電泳：agarose gel電泳是分離鑒定和純化電泳是分離鑒定和純化DNA分子的常用方分子的常用方 法，不同濃度的瓊脂糖膠可分離法，不同濃度的瓊脂糖膠可分離100bp-60kb的的DNA片段，在瓊脂糖電泳片段，在瓊脂糖電泳 中，中，DNA遷移的速率不僅與其分子浪的對數(shù)值成反比，即分子量越大，遷移的速率不僅與其分子浪的對數(shù)值成反比，即分子量越大， 移動(dòng)速率越慢，而且還與分子構(gòu)型有關(guān)。如質(zhì)粒開環(huán)移動(dòng)速率越慢，而且還與分子構(gòu)型有關(guān)。如質(zhì)粒開環(huán)DNA線性線性DNA 共價(jià)閉合環(huán)狀共價(jià)閉合環(huán)狀DNA 3）限制性核酸內(nèi)切酶）限制性核酸內(nèi)切酶: 是一類能夠識(shí)別雙鏈?zhǔn)且活惸軌蜃R(shí)別雙鏈DNA分子

24、內(nèi)部的特異序列，并在識(shí)分子內(nèi)部的特異序列，并在識(shí) 別位點(diǎn)或其周圍產(chǎn)生切割作用的核酸水解酶，它存在于細(xì)菌別位點(diǎn)或其周圍產(chǎn)生切割作用的核酸水解酶，它存在于細(xì)菌 體內(nèi)與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)即保護(hù)自身體內(nèi)與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)即保護(hù)自身 DNA，限制外源，限制外源DNA。4-6堿基對，具有回紋結(jié)構(gòu)的堿基對，具有回紋結(jié)構(gòu)的DNA 片段；片段；水解水解DNA分子的磷酸二酯鍵分子的磷酸二酯鍵切割方式有兩種：黏切割方式有兩種：黏 性末端和平末端性末端和平末端 切切4堿基，平均堿基，平均256bp出現(xiàn)一次切點(diǎn)，切出現(xiàn)一次切點(diǎn)，切6-8堿基堿基 時(shí)，每隔時(shí)，每隔4-65kb出現(xiàn)一次切點(diǎn)

25、出現(xiàn)一次切點(diǎn) 二、實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)步驟-PET-28a-Mn-SOD表達(dá)重組 質(zhì)粒的鑒定 1、用滅菌牙簽分別挑取5個(gè)菌落接種到2ml LB-Km（50ug/ml）液體培養(yǎng)基中，37振 蕩培養(yǎng)過夜； 2、用堿裂解法提取質(zhì)粒； 3、用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III酶切質(zhì)粒， 1.0 % 瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果： 切出600bp Mn-SOD基因DNA片段的為陽 性克隆。 流流 程程 圖圖 三、實(shí)驗(yàn)步驟三、實(shí)驗(yàn)步驟 一、質(zhì)粒一、質(zhì)粒DNA的提?。旱奶崛。?1. 在含抗生素、在含抗生素、IPTG和和X-gal的平板上隨機(jī)挑出數(shù)個(gè)白色菌落，接種到的平板上隨機(jī)挑出數(shù)個(gè)白色菌落，接種到

26、5ml LB-AMP液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過夜至對數(shù)生長期。振蕩培養(yǎng)過夜至對數(shù)生長期。 2. 取取1.5ml對數(shù)生長期的菌體與對數(shù)生長期的菌體與EP管中，在臺(tái)式離心機(jī)上管中，在臺(tái)式離心機(jī)上8000rpm離心離心 30秒收集菌體。秒收集菌體。 3. 棄上清，將棄上清，將EP管倒置在吸水紙上，吸干溶液。管倒置在吸水紙上，吸干溶液。 4. 加加100ul GTE緩沖液，用移液器輕輕吹打，使菌體重新懸浮，室溫放緩沖液，用移液器輕輕吹打，使菌體重新懸浮，室溫放 置置5分鐘。分鐘。 5. 加入加入200ul NaOH-SDS溶液，顛倒混勻溶液，顛倒混勻10次，然后置冰浴次，然后置冰浴5分

27、鐘。分鐘。 6. 加入加入150ul預(yù)冷的乙酸鉀溶液，充分混勻，置冰浴預(yù)冷的乙酸鉀溶液，充分混勻，置冰浴5分鐘。分鐘。 7. 在在4下于臺(tái)式高速離心機(jī)下于臺(tái)式高速離心機(jī)12000rpm離心離心5分鐘，并將上清移至另一分鐘，并將上清移至另一 支新的支新的EP管中。管中。 加等體積的酚、氯仿抽提一次，加等體積的酚、氯仿抽提一次，12000rpm離心離心5分鐘，取上層水相至分鐘，取上層水相至 另一支新的另一支新的EP管中，加等體積氯仿抽提一次，管中，加等體積氯仿抽提一次，12000rpm離心離心5分鐘，分鐘， 取上層水相至另一支新的取上層水相至另一支新的EP管中。管中。 8. 加加0.6倍體積異丙醇

28、，置冰浴倍體積異丙醇，置冰浴30min，12000rpm離心離心10分鐘，棄上清。分鐘，棄上清。 9. 沉淀用沉淀用70%乙醇乙醇0.5ml洗一次，棄上清并真空干燥。用洗一次，棄上清并真空干燥。用30ulTE（已加（已加 入入2ug/ul Rnase）溶液溶解沉淀的）溶液溶解沉淀的DNA，3710min，置于，置于4保存。保存。 三、實(shí)驗(yàn)步驟 3、質(zhì)粒的酶切鑒定：、質(zhì)粒的酶切鑒定： 1） 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA酶切反應(yīng)體系酶切反應(yīng)體系 10 酶切酶切buffer 3 l 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA 10 l EcoR1（10u/ l） 1 l BamH1（ 10u/ l ） 1 l ddH2O加至加至 20 l

29、37水浴保溫水浴保溫1-2h；72 水浴水浴15min終止反應(yīng)。終止反應(yīng)。 3、電泳檢測目的基因片段（電泳方法同前）、電泳檢測目的基因片段（電泳方法同前） 4、結(jié)果分析、結(jié)果分析 三、實(shí)驗(yàn)步驟 2、瓊脂糖凝膠電泳鑒定：、瓊脂糖凝膠電泳鑒定：DNA電泳時(shí)間為電泳時(shí)間為30-60min 1）用電泳緩沖液制作）用電泳緩沖液制作1.0%的瓊脂糖凝膠，冷卻至的瓊脂糖凝膠，冷卻至60后加入終濃度 0.5ug/ml的EB-紫外下的顯色物質(zhì) 2）待膠凝固后，拔出梳子，取出帶膠的托盤，一起放入電泳槽，使電）待膠凝固后，拔出梳子，取出帶膠的托盤，一起放入電泳槽，使電 泳緩沖液的液面高出凝膠。泳緩沖液的液面高出凝膠

30、。 3）?。┤?0ulPCR產(chǎn)物，加入產(chǎn)物，加入4ul 6 的上樣緩沖液（溴酚藍(lán)），混合后用微的上樣緩沖液（溴酚藍(lán)），混合后用微 量進(jìn)樣器小心加入樣品孔。量進(jìn)樣器小心加入樣品孔。 4）以靠近上樣端為負(fù)極，另一端為正極，接通電源，以）以靠近上樣端為負(fù)極，另一端為正極，接通電源，以5V/cm的電壓電的電壓電 泳泳30-60min。 5）電泳結(jié)束后，帶手套取出凝膠置透明薄膜上，紫外燈下觀察結(jié)果 四、注意事項(xiàng) 1、抽提質(zhì)粒過程應(yīng)盡量保持低溫 2、質(zhì)粒制備過程中要盡量除去蛋白，否則會(huì)影響后面的酶 切或連接 3、沉淀DNA常用等體積的異丙醇，但易將鹽也沉淀下來，可 以用二倍體積的冰乙醇避免鹽的沉淀。 4、

31、EB是強(qiáng)致癌物，注意操作安全； 5、瓊脂糖的濃度要根據(jù)分離鑒定的DNA的大小不同而配制不 同的濃度； 6、DNA的純度對酶切和連接很重要； 五、思考題 無 實(shí)驗(yàn)四(續(xù)) pET-28a-SOD表達(dá)重組質(zhì)粒的鑒定 （重組質(zhì)粒的提取、酶切及電泳鑒定） 1 1、菌落、菌落PCRPCR擴(kuò)增目的片段擴(kuò)增目的片段-初步鑒初步鑒 定表達(dá)轉(zhuǎn)化子的正確定表達(dá)轉(zhuǎn)化子的正確 2 2、電泳鑒定目的條帶的存在否？、電泳鑒定目的條帶的存在否？ 3 3、驗(yàn)證正確后用于誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋、驗(yàn)證正確后用于誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋 白白 實(shí)驗(yàn)六 重組蛋白的誘導(dǎo) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、學(xué)習(xí)目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的原理。 2、掌握接種、培養(yǎng)定時(shí)取樣、蛋白的

32、提 取分離純化 3、掌握目的蛋白的分離鑒定方法 二、實(shí)驗(yàn)原理 1 1）誘導(dǎo)表達(dá)的原理：）誘導(dǎo)表達(dá)的原理：pETpET系統(tǒng)也是在大腸桿菌系統(tǒng)也是在大腸桿菌E.coliE.coli中克隆表達(dá)重組蛋白功能最強(qiáng)中克隆表達(dá)重組蛋白功能最強(qiáng) 大的系統(tǒng)。目的基因的表達(dá)受噬菌體大的系統(tǒng)。目的基因的表達(dá)受噬菌體T7T7強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯信號(hào)的調(diào)控。表達(dá)系統(tǒng)是強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯信號(hào)的調(diào)控。表達(dá)系統(tǒng)是 以大腸桿菌以大腸桿菌laclac操縱子調(diào)控機(jī)理為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的，操縱子調(diào)控機(jī)理為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的，laclac操縱子的轉(zhuǎn)錄受正調(diào)控因子操縱子的轉(zhuǎn)錄受正調(diào)控因子 CAPCAP和負(fù)調(diào)控因子和負(fù)調(diào)控因子lacIlacI的調(diào)控，在無誘導(dǎo)物情況下，

33、的調(diào)控，在無誘導(dǎo)物情況下， lacIlacI形成四聚體阻遏蛋白，形成四聚體阻遏蛋白， 與啟動(dòng)子下游的操縱基因緊密結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄的起始，在與啟動(dòng)子下游的操縱基因緊密結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄的起始，在IPTG(IPTG( -D-D-硫代半乳糖硫代半乳糖 苷苷) )等乳糖類似物是等乳糖類似物是laclac操縱子的誘導(dǎo)物，它與阻遏蛋白結(jié)合使之改變構(gòu)象，導(dǎo)操縱子的誘導(dǎo)物，它與阻遏蛋白結(jié)合使之改變構(gòu)象，導(dǎo) 致其與操縱基因的結(jié)合而解離出來。致其與操縱基因的結(jié)合而解離出來。LacLac操縱子的轉(zhuǎn)錄因此激活。操縱子的轉(zhuǎn)錄因此激活。 LacLac操縱子具操縱子具 有可誘導(dǎo)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的性質(zhì)，因此用來構(gòu)建到表達(dá)載體中。有可誘

34、導(dǎo)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的性質(zhì)，因此用來構(gòu)建到表達(dá)載體中。PET28PET28就有就有l(wèi)acIlacI基基 因，可用因，可用IPTGIPTG誘導(dǎo)。誘導(dǎo)。 三、實(shí)驗(yàn)方法三、實(shí)驗(yàn)方法 一、一、PET-28a-Mn-SOD表達(dá)重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)表達(dá)重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) （1）用滅菌牙簽分別挑取陽性克隆和1個(gè)含PET-28a表達(dá)質(zhì) 粒菌落接種到2ml LB-Km（50ug/ml）液體培養(yǎng)基中， 37振蕩培養(yǎng)過夜； （2）按1：10接種到3ml LB-Km（50ug/ml）液體培養(yǎng)基中， 37 250rpm振蕩培養(yǎng)2小時(shí)（OD值約為0.2-0.6）； （3）于各管中加100mM IPTG 30ul（終濃度為1mM）

35、， 37 250rpm振蕩培養(yǎng)，分別在1小時(shí)、2小時(shí)和3小時(shí)各 取1ml菌液，6000rpm離心2分鐘收集菌體，用2ml PBS重 懸菌體，加10mg/ml溶菌酶至終濃度為0.3mg/ml，冰上放 置30分鐘，加入10% TritonX-100（終濃度為0.1%），混 勻，超聲（200W 3秒,間隔3秒，60次）破碎細(xì)菌至細(xì)菌 懸液變的清亮透明，12000rpm離心10分鐘，收集上清和 沉淀待用。 （4）取上清和沉淀分別加等體積2蛋白上樣液，沸水浴5分 鐘變性，SDS-PAGE（12%的分離膠）電泳，考馬斯亮藍(lán)染色分 析，見圖2。 （5）結(jié)果：發(fā)現(xiàn)分子量約為30 KD， IPTG誘導(dǎo)3小時(shí)時(shí)重

36、組 蛋白表達(dá)量最高，約占總蛋白的50%，將3號(hào)菌種接種到另一 含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上并用15%甘油保種。 參考內(nèi)容 5SDS上樣緩沖液上樣緩沖液10ml 1.0mol/L TrisHCl（pH6.8） 0.6 ml 2-巰基乙醇 0.5 ml 10%SDS 2.0 ml 1%溴酚藍(lán) 1.0 ml 50%甘油 5.0 ml DTT 300 mM 去離子水 0.9 ml （混勻后，分裝于1.5 ml離心管中，4保存） 考馬斯亮藍(lán)染液考馬斯亮藍(lán)染液 1000 ml 考馬斯亮藍(lán)R-250 1.0 g 甲醇 450 ml 冰醋酸 100 ml 去離子水 450 ml 考馬斯亮藍(lán)脫色液考馬斯亮藍(lán)脫色

37、液 1000 ml 甲醇 100 ml 冰醋酸 100 ml 蛋白樣品的電泳檢測（蛋白樣品的電泳檢測（SDS-PAGE） 1）用洗衣粉輕輕擦洗玻璃板，兩面都擦洗過后用自來水）用洗衣粉輕輕擦洗玻璃板，兩面都擦洗過后用自來水 沖，再用去離子水沖洗干凈后晾干備用。沖，再用去離子水沖洗干凈后晾干備用。 2）灌膠與上樣）灌膠與上樣 。將玻璃板對齊后放入制膠板中卡緊，加。將玻璃板對齊后放入制膠板中卡緊，加 入去離子水試漏，若不漏將水倒干凈。入去離子水試漏，若不漏將水倒干凈。 3）配）配12的分離膠，加入的分離膠，加入TEMED后立即搖勻，馬上注入后立即搖勻，馬上注入 兩玻璃板中。灌膠時(shí)，可用兩玻璃板中。灌

38、膠時(shí)，可用1 ml微量加樣器沿玻璃一側(cè)緩微量加樣器沿玻璃一側(cè)緩 緩傾注以防氣泡產(chǎn)生，待膠面升到離玻璃板口緩傾注以防氣泡產(chǎn)生，待膠面升到離玻璃板口2cm-3cm 時(shí)即可。時(shí)即可。 4）然后膠上加一層水趕走氣泡，且起到封閉的作用，水）然后膠上加一層水趕走氣泡，且起到封閉的作用，水 封后膠凝得更快并且膠面更平（灌膠時(shí)開始可以動(dòng)作快一封后膠凝得更快并且膠面更平（灌膠時(shí)開始可以動(dòng)作快一 些，膠面快到所需高度時(shí)放慢速度。加水封膠面時(shí)要慢，些，膠面快到所需高度時(shí)放慢速度。加水封膠面時(shí)要慢， 否則膠會(huì)被沖變型而且會(huì)使水混入膠內(nèi)改變膠的濃度）。否則膠會(huì)被沖變型而且會(huì)使水混入膠內(nèi)改變膠的濃度）。 蛋白樣品的電泳檢

39、測（蛋白樣品的電泳檢測（SDS-PAGE） 5）放置約）放置約50 min左右，當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，左右，當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)， 或者灌膠剩下的膠液已經(jīng)凝固了，說明膠已凝固完好。這或者灌膠剩下的膠液已經(jīng)凝固了，說明膠已凝固完好。這 時(shí)輕輕傾斜膠板倒去上面的水樣。時(shí)輕輕傾斜膠板倒去上面的水樣。 6）按上述方法配）按上述方法配5的濃縮膠，加入的濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻，后立即搖勻， 迅速灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠，迅速將梳子水平插入迅速灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠，迅速將梳子水平插入 濃縮膠中。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，減小加樣孔的濃縮膠中。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，減小加

40、樣孔的 上樣體積，所以在濃縮膠凝固的過程中要在兩邊補(bǔ)膠。約上樣體積，所以在濃縮膠凝固的過程中要在兩邊補(bǔ)膠。約 30-50 min后，待濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩后，待濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩 邊豎直向上輕輕將其拔出。邊豎直向上輕輕將其拔出。 7）將膠板放入電泳槽中，加入足夠的電泳緩沖液（電泳）將膠板放入電泳槽中，加入足夠的電泳緩沖液（電泳 緩沖液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板），用微量加樣器的緩沖液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板），用微量加樣器的 Tip插至加樣孔中緩慢加入樣品，并同時(shí)加入蛋白插至加樣孔中緩慢加入樣品，并同時(shí)加入蛋白Marker （加樣不要太快，太快可使樣品沖出加樣孔，如

41、果有氣泡（加樣不要太快，太快可使樣品沖出加樣孔，如果有氣泡 可能會(huì)使樣品溢出）。可能會(huì)使樣品溢出）。 蛋白樣品的電泳檢測（蛋白樣品的電泳檢測（SDS-PAGE） 8）接通電源電泳，電泳時(shí)間一般）接通電源電泳，電泳時(shí)間一般23 h，調(diào)節(jié)電壓為：，調(diào)節(jié)電壓為： 濃縮膠用濃縮膠用80-100V，到分離膠以后加大到，到分離膠以后加大到120-150V。電泳。電泳 至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳。至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳。 9）染色：小心將膠削離，放入盛有考馬斯亮藍(lán)（）染色：小心將膠削離，放入盛有考馬斯亮藍(lán)（20 ml已已 足夠）較大容器內(nèi)，對于足夠）較大容器內(nèi)，對于0.75 mm的膠可在搖床上緩慢震的膠

42、可在搖床上緩慢震 蕩蕩5-10 min，對于，對于1.5 mm的膠則需要的膠則需要10-20 min。 10）棄去染液，將膠在水中漂洗數(shù)次后，放入考馬斯亮藍(lán)）棄去染液，將膠在水中漂洗數(shù)次后，放入考馬斯亮藍(lán) 脫色液中（約脫色液中（約50 ml），在搖床上緩慢震蕩約），在搖床上緩慢震蕩約1 h，清晰條，清晰條 帶很快會(huì)顯現(xiàn)出來。帶很快會(huì)顯現(xiàn)出來。 11）將膠放入掃描儀中掃描拍照。）將膠放入掃描儀中掃描拍照。 四、注意事項(xiàng) 1、SDS-PAGE膠含有丙烯酰胺等有毒化合物物，注意操作安 全； 2、膠的濃度要根據(jù)分離鑒定蛋白的大小不同而配制不同的 濃度(有一表格)； 3、看清梳子插孔上樣，注意梳子孔不要

43、倒，倒下的，用上 樣針撥起； 五、思考題 實(shí)驗(yàn)七 重組蛋白免疫印跡分析 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、學(xué)習(xí)目的蛋白表達(dá)鑒定的原理。 2、掌握蛋白的SDS-PAGE、膠的制作、 染色、脫色鑒定的方法 3、掌握目的蛋白Western Blot鑒定方法 二、實(shí)驗(yàn)原理 1 1）實(shí)驗(yàn)原理：經(jīng)過）實(shí)驗(yàn)原理：經(jīng)過SDS-PAGESDS-PAGE蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體硝蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體硝 酸纖維素膜上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能酸纖維素膜上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能 保持電泳分離的多肽類型及生物學(xué)活性不變。以固相載體上保持電泳分離的多肽類型及生物學(xué)活性不變。以固相載體上 的蛋白或多

44、肽作為抗原與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或的蛋白或多肽作為抗原與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或 同位素標(biāo)記的第二抗體結(jié)合，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以同位素標(biāo)記的第二抗體結(jié)合，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以 檢查電泳分離的特異性目標(biāo)蛋白檢查電泳分離的特異性目標(biāo)蛋白 同樣樣品同時(shí)上樣到兩塊膠上，同時(shí)電泳，一塊膠 染色，一塊膠轉(zhuǎn)膜western blot 三、實(shí)驗(yàn)方法三、實(shí)驗(yàn)方法 一、轉(zhuǎn)膜一、轉(zhuǎn)膜 （1）切除凝膠多余的邊緣部分，用直尺量出膠的長 與寬，估算面積，將膠浸入轉(zhuǎn)移到緩沖液中平衡 10min(搖床) （2）剪切8張與膠同樣大小的濾紙和一張硝酸纖維 膜，均用轉(zhuǎn)移緩沖液平衡10min（搖床上）； （

45、3）從電極負(fù)極到正極依次順序?yàn)椋汉＞d濾紙一 層電泳凝膠硝酸纖維膜-三層濾紙海綿， 操作時(shí)不要有氣泡夾在里面，固定好后放入電泳 槽中，接通電源。轉(zhuǎn)移30-45min 三、實(shí)驗(yàn)方法三、實(shí)驗(yàn)方法 二、封閉二、封閉 轉(zhuǎn)膜結(jié)束，關(guān)閉電源，取出硝酸纖維膜，將膜浸入封閉液中 搖床上緩慢震蕩30min 三、加一抗 將膜用PBST洗3次，5min/次，然后加入已作稀釋的一抗， 37震蕩1h，或室溫緩慢震蕩2h，或4 過夜。 四、加酶標(biāo)二抗 用PBST洗膜3次， 5min/次，然后加入酶標(biāo)二抗， 37震蕩 1h，或室溫緩慢震蕩2h。 五、顯色 用PBST洗膜3次， 5min/次，然后將膜浸入到底物液中，輕 輕晃動(dòng)

46、數(shù)秒后避光靜止，待特異性條帶清晰顯現(xiàn) 時(shí)換ddH2O以終止反應(yīng)。 四、注意事項(xiàng) 1、接觸硝酸纖維膜時(shí)要帶手套 2、轉(zhuǎn)移電流不能太大以免產(chǎn)熱過多，影響條帶清 晰度； 3、封閉液中有小牛血清、脫脂奶粉等，若封閉液 中含有能與一抗結(jié)合的蛋白，就要避免使用這種 封閉液 五、思考題 生化工程學(xué)實(shí)驗(yàn) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康哪康?(1) 通過超氧化物歧化酶的分離純化,了解有機(jī)溶劑沉淀蛋 白質(zhì)以及纖維素離子交換層析方法的原理。 (2) 掌握測定超氧化物歧化酶活性和比活力的方法。 二二 、原理、原理 超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase) 簡稱SOD, 它廣 泛存在于各類生物體內(nèi), 按其所含金屬離子

47、的不同, 可分為 3種: CuZn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD。 SOD催化如下反應(yīng) : O2.- + O2- +2H+ H202+02 -自由基清除劑 實(shí)驗(yàn)一、SOD酶粗酶液的分離純化 分離純化的原理（1）Mn-SOD易溶于乙醇； （2）K2HP04極易溶于水；（3）極性有機(jī) 溶劑丙酮沉淀SOD;(4)纖維素陰離子交換柱 純化。 X X X X X X Y X Z X Y Z Z Y Y Y X Z X Z X Z Z X X X Y Z Y Z X X X X X X X OH nX 平衡上樣吸附洗雜 洗脫 三、實(shí)驗(yàn)步驟： 1、粗酶液的獲得：收集50 mL發(fā)酵液菌體，離心收集菌體。

48、 15mL磷酸鉀緩沖液重懸菌體，并加入75ul Triton冰上裂解 菌體10min，超聲破碎（400w,5-3,90次），8000rpm離 心10，上清即為SOD粗酶液,取上清12ml（留樣1mL測酶 活和蛋白含量-A）。 2、氯仿去蛋白： 上清中緩慢加入1/4體積的 4 下預(yù)冷過 的95% 乙醇 3mL, 然后再緩慢加入在4下預(yù)冷過的氯仿 1.8mL(0.15倍體積),充分?jǐn)嚢? 8000 rpm離心10min, 棄去 沉淀, 收集上清液約 10mL(留樣0.5mL測酶活和蛋白含量- -B)。 3、 K2HP04去水：加入K2HP04 3H20(按43g k2HP043H20/100mL粗

49、提液的比例), 約4g充分振搖，靜 止分層，收集上層，離心8000rpm，10min, 棄沉淀, 得上 清液約8mL(留樣0.5mL測酶活和蛋白含量-C ) 4、丙酮沉淀蛋白并透析：、丙酮沉淀蛋白并透析：上一步得到的上清液加 入0.75 倍體積在4下預(yù)冷過的丙酮 , Mn-SOD 便沉淀下來。離心8000rpm，10min, 收集灰白色 沉淀物。將沉淀物溶于約3mLddH2O中,在4下, 對250mL pH7.6,2.5mmol/L的磷酸鉀緩沖液透析, 每隔20 以上, 換透析外液1次, 共換 2-3 次。透析 內(nèi)液如出現(xiàn)沉淀, 需8000rpm，10min,棄去沉淀, 收集上清液約5ml(留

50、樣 0.3mL-D) 。 5、DE-52纖維素柱層析：纖維素柱層析： 將上一步所得離心上 清液過 DE-52 纖維素柱。用 pH7.6,2.5mmol/L磷 酸鉀緩沖液作層析柱平衡液, 用 pH7.6,2.5mmol/L(100mL)-200mmol/L(l00mL) 的 磷酸鉀緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。流速 30mL/h, 每管 收集3mL ,記錄總體積。 實(shí)驗(yàn)二、SOD蛋白濃度及酶活測定 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握蛋白含量和SOD酶活性的測定方法。 二、原理二、原理 酶的比活性用每毫克蛋白質(zhì)具有的活性單位來表示，因 此，測定樣品的比活性必須測定：（1）每毫升樣品中的 蛋白質(zhì)毫克數(shù)。（2）每毫

51、升樣品中的酶活性單位數(shù)。 SOD測定方法采用鄰苯三酚自氧化法:鄰苯三酚在堿性條 件下, 能迅速自氧化,釋放出 O2-, 生成帶色的中間產(chǎn)物。 中間物在420nm波長處有強(qiáng)烈光吸收, 當(dāng)有SOD存在時(shí), 由于它能催化O2-與 H+ 結(jié)合生成02和H202, 從而阻止了 中間物的積累, 因此,通過計(jì)算就可求出SOD的酶活性。 非變性電泳分離膠分離膠配方 分離膠10%共12ml H2O5ml 30%凝膠貯存液4ml 4X分離膠緩沖液 （PH=8.8） 3ml 10%過硫酸銨200ul TEMED16ul 非變性電泳濃縮膠濃縮膠配方 濃縮膠4.5%共8ml H2O4.8ml 30%凝膠貯存液1.2ml

52、 4X濃縮膠緩沖液 （PH=8.8） 2ml 10%過硫酸銨100ul TEMED10ul 三、實(shí)驗(yàn)步驟 1.1.測蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制測蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 （1 1）蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣）蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣0.4mg/ml0.4mg/ml： 立即混勻，室溫放置2-3分鐘，595nm比色，空白管調(diào)零。 （2 2）計(jì)算出各階段樣品的蛋白濃度。）計(jì)算出各階段樣品的蛋白濃度。 mlABCDE空白 蛋白標(biāo) 準(zhǔn)樣ml 0.050.100.150.200.25 DD水0.200.150.100.050.25 G2505.05.05.05.05.05.0 三、實(shí)驗(yàn)步驟 1.1.卡馬斯亮藍(lán)法測蛋白卡馬斯亮藍(lán)法測蛋白 （1 1）?。┤?7 7只試管，編號(hào)，按下表操作：只試管，編號(hào)，按下表操作： 立即混勻，室溫放置2-3分鐘，595nm比色，空白管調(diào)零。 （2 2）計(jì)算出各階段樣品的蛋白濃度。）計(jì)算出各階段樣品的蛋白濃度。 mlABCDE空白 各段樣 品ml 0.010.010.010.050.25 DD水0.240.240.240.200.25 G2505.05.05.05.05.05.0 三、實(shí)驗(yàn)步驟 2.2.酶活性的測定酶活性的測定 （1 1） 鄰苯三酚自氧化速率的測定鄰