蛋白質(zhì)不穩(wěn)定性及其對(duì)策

1、蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性1、物理不穩(wěn)定性變性、聚集、吸附、大分子的可溶性2、化學(xué)不穩(wěn)定性水解、氧化、消旋、與溶質(zhì)及表面間的反應(yīng)蛋白質(zhì)分子與小分子物質(zhì)穩(wěn)定性比較蛋白質(zhì)小分子大量潛在的反應(yīng)位點(diǎn)很少反應(yīng)位點(diǎn)大量離子化位點(diǎn)很少離子化位點(diǎn)緩沖作用通常是唯一的酸/堿催化緩沖作用通常是廣泛的酸/堿催化有二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)高級(jí)結(jié)構(gòu)沒有高級(jí)結(jié)構(gòu)分散（膠體）水相溶液中為單一相和連續(xù)相溫度效應(yīng)是間斷的（變性）溫度效應(yīng)是連續(xù)的易支持微生物生長蛋白質(zhì)藥品中添加劑的作用 1.抗微生物保藏劑 2.可溶性增強(qiáng)劑 3.凍干產(chǎn)品填充劑 4.等滲溶液添加劑蛋白質(zhì)中常見的穩(wěn)定性與相容性問題及解決方法穩(wěn)定性問題可能的解決方案水解、脫氨（如天冬酰

2、胺）控制PH、緩沖液、低離子強(qiáng)度氧化（如甲硫氨酸氧化）抗氧化劑、螯合劑、低PH、無氧加工與包裝過程-消除反應(yīng)低PH、螯合劑轉(zhuǎn)肽作用控制PH、低濃度外消旋作用控制PH、緩沖液二硫鍵交換硫醇的消除（如半胱氨酸）冷凍干燥過程中的變性防凍劑/防失水劑凝集、沉淀控制PH、表面活性劑、減低機(jī)械壓力表面吸附表面活性劑、白蛋白、預(yù)飽和化學(xué)穩(wěn)定性 1.PH、水解和緩沖液 2.氧化、抗氧化劑和其他抗氧化方法 3.其它化學(xué)不穩(wěn)定性及制劑方法1.PH、水解和緩沖液 穩(wěn)定性、可溶性和PH遵循一個(gè)規(guī)律： 高溶解度導(dǎo)致低化學(xué)穩(wěn)定性；低溶解度導(dǎo)致低物理穩(wěn)定性。 例子：胰島素溶解度與脫氨反應(yīng) 1.水解和脫氨反應(yīng) 氨基酸：天冬酰

3、胺和谷氨酰胺 影響因素：極端PH、溫度和離子強(qiáng)度 最明顯的例子：中性和堿性條件下提高蛋白質(zhì)的脫氨速度（主要是Asn-Gly），脫氨速率高于水解速率 改善方法：降低PH。酸性PH條件下脫氨速率低于中性和堿性PH，但是PH的降低可能導(dǎo)致Asp-X（小分子側(cè)鏈，甘氨酸或絲氨酸）殘基處的裂解或環(huán)化。緩沖液 目的：用于防止溶液中小的PH值改變，這些改變影響著蛋白質(zhì)可溶性和穩(wěn)定性。 注意的問題： 1.放大及生產(chǎn)規(guī)模中找到滿足要求的緩沖系統(tǒng)可能困難，需要借助于酸堿調(diào)節(jié)。它們可能改變緩沖系統(tǒng)的緩沖能力，離子強(qiáng)度。 2.為更好的控制PH，增強(qiáng)緩沖能力將顯著提高離子強(qiáng)度。 3.普通的酸和/或堿催化可能加速蛋白質(zhì)的

4、降解。 4.冷凍干燥過程中緩沖液的結(jié)晶化可能改變?nèi)芤豪鋬鰸饪s時(shí)的PH，影響藥物穩(wěn)定性。2.氧化、抗氧化劑和其他抗氧化方法 1.甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、組氨酸、色氨酸和酪氨酸對(duì)氧化和光解敏感，與蛋白質(zhì)構(gòu)型及氨基酸最終溶劑和環(huán)境條件相關(guān)，如氧、光、熱、金屬離子及各種自由基激活劑。 2.巰基氨基酸的氧化（蛋氨酸和半胱氨酸）可能導(dǎo)致二硫鍵的形成和生物活性的喪失。 3.游離巰基可能氧化形成不正確的二硫鍵，而且可能導(dǎo)致其它降解反應(yīng)，如烷基化、雙鏈加成作用和與重金屬發(fā)生配位作用。 4.空氣中的氧會(huì)引發(fā)蛋氨酸殘基的氧化反應(yīng)。 蛋白質(zhì)制劑中的抗氧化劑和螯合劑試劑制劑中的使用濃度/%抗氧化劑（所以水溶液）抗壞

5、血酸（異抗壞血酸、抗壞血酸鈉）0.1-1.0亞硫酸鹽（亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉）0.1-0.5硫甘油0.1-0.5巰基乙酸0.05-0.2半胱氨酸鹽酸鹽0.1-0.5螯合劑（所有水溶液）乙二胺四乙酸（EDTA）（通常為鈉鹽） 0.05-0.1檸檬酸/檸檬酸鹽0.02-1制劑中使用抗氧化劑常出現(xiàn)的問題 1.Fe3+和氧存在時(shí)，抗壞血酸誘導(dǎo)蛋氨酸氧化 2.與其它緩沖液相比（Tris、HEPES、MOPS ），磷酸鹽緩沖液在有抗壞血酸存在時(shí)加速蛋氨酸氧化 3.抗壞血酸-蛋氨酸氧化的氧化強(qiáng)化劑作用具濃度依賴性，多數(shù)發(fā)生在PH6-7 4.亞硫氨酸氫鹽導(dǎo)致的蛋白穩(wěn)定性問題：亞硫酸氫鹽加速胰島素破壞防止氧化降解的措施 1.低溫下制備與儲(chǔ)藏 2.使用螯合劑消除金屬催化反應(yīng) 3.提高離子強(qiáng)度，減少二硫鍵的形成 4.消除過氧化物和金屬污染物 5.避光 6.注意光反應(yīng)和磷酸鹽緩沖液條件下可能形成游離基的反應(yīng) 7.生產(chǎn)過程中用氮或氬代替氧 8.當(dāng)需維持所需蛋白質(zhì)的可溶性和抗水解穩(wěn)定性時(shí)，盡可能在低PH下進(jìn)行，因?yàn)榭寡趸€(wěn)定性與PH呈負(fù)相關(guān)。 9.為抑制游離基形成和微量金屬離子所導(dǎo)致的蛋白氧化，使用螯合劑其它蛋白質(zhì)化學(xué)不穩(wěn)定性及制劑方法 1.消除：發(fā)生在低溫和高PH，堿性條件下顯著加速； 氨基酸包括半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和賴氨酸 對(duì)策：降低PH 2.二硫鍵斷裂 原因：溫度過高 對(duì)策：降