熒光顯微成像技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用

1、姓名：何青 學(xué)號(hào)：1224143003 專業(yè)：生物醫(yī)學(xué)信息技術(shù)熒光顯微成像技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用隨著光電子技術(shù)，尤其是激光技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的現(xiàn)代顯微技術(shù)迅速發(fā)展起來(lái)。目前，通過(guò)激光光源以激發(fā)被測(cè)物體的熒光或者非線性光學(xué)現(xiàn)象從而獲得高分辨率的成像的技術(shù)就有：激光共聚焦顯微技術(shù)、雙光子熒光顯微技術(shù)、二次諧波顯微成像技術(shù)以及拉曼光譜成像技術(shù)等。通過(guò)能量密度比普通光源高數(shù)十乃至數(shù)百倍的激光可以激發(fā)被測(cè)物的各種非線性光學(xué)現(xiàn)象，而被測(cè)物內(nèi)部不同組織、不同成分的部分將顯示不同的光學(xué)性質(zhì)（如激發(fā)光的強(qiáng)度或者波長(zhǎng)不一樣），從而將這些不同部分區(qū)分開(kāi)來(lái)，提高了顯微系統(tǒng)的分辨率。熒光顯微成像技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研

2、究領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，技術(shù)發(fā)展也突飛猛進(jìn)，成為熱門的研究領(lǐng)域，并發(fā)展了突破衍射極限的超高分辨率熒光顯微成像系統(tǒng)1?，F(xiàn)就目前應(yīng)用比較廣泛的激光掃描共焦顯微鏡和多光子激光掃描顯微鏡進(jìn)行介紹。1 激光掃描共焦顯微鏡激光掃描共焦顯微鏡是近年來(lái)發(fā)展較為迅速的無(wú)創(chuàng)診斷技術(shù)。它以光學(xué)系統(tǒng)的共焦成像為基礎(chǔ)，利用光掃描技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行無(wú)創(chuàng)動(dòng)態(tài)測(cè)量，目前已經(jīng)發(fā)展成為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究診斷的重要工具，在生物醫(yī)學(xué)的各方面得到了廣泛的應(yīng)用。1.1 激光共聚焦掃描顯微鏡基本原理如圖1所示，激光共聚焦掃描顯微鏡（Confocal laser scanning microscope，CLSM）用激光作掃描光源，采用雙針孔的結(jié)構(gòu)以

3、形成物像共軛。激光通過(guò)透鏡聚焦在焦平面上針孔形成點(diǎn)光源，并在物鏡焦平面對(duì)樣品逐點(diǎn)掃描, 樣品上的每個(gè)照射點(diǎn)在像焦平面的探測(cè)孔處成像。進(jìn)行點(diǎn)掃描時(shí)，掃描點(diǎn)以外的點(diǎn)不會(huì)成像。，掃描的激光與熒光收集共用一個(gè)物鏡，物鏡的焦點(diǎn)即掃描激光的聚焦點(diǎn)，也是瞬時(shí)成像的物點(diǎn)。由于激光束的波長(zhǎng)較短，光束很細(xì)，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力，大約是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個(gè)平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時(shí)，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像。逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像，這些圖像信息都儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)內(nèi)，通過(guò)計(jì)算機(jī)分析和模擬，就能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。 圖1激光共聚焦掃描顯微鏡基本原理示意圖1

4、.2激光共聚焦顯微鏡的應(yīng)用領(lǐng)域激光掃描共聚焦顯微鏡是近代最先進(jìn)的細(xì)胞生物醫(yī)學(xué)分析儀器之一。既可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)，也可以用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計(jì)以及細(xì)胞形態(tài)的測(cè)量, 配合焦點(diǎn)穩(wěn)定系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察。目前，激光掃描共聚焦顯微技術(shù)已用于細(xì)胞形態(tài)定位、立體結(jié)構(gòu)重組、動(dòng)態(tài)變化過(guò)程等研究，并提供定量熒光測(cè)定、定量圖像分析實(shí)用研究手段，結(jié)合其他相關(guān)生物技術(shù)，在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。 激光共聚焦顯微鏡的具體應(yīng)用領(lǐng)域包括：多重?zé)晒庥跋?( Multi-Color Fluorescence Imaging ) 3D 立體影像重建 ( 3D Reconst

5、ruction ) 3D 動(dòng)態(tài)影像獲取與分析 ( Dynamic 3D imaging ) 神經(jīng)立體分布影像 ( 3D Neuron imaging ) 形態(tài)與動(dòng)態(tài)分析 ( Morphology ) 次微米單晶熒光影像技術(shù) ( Nano-crystal ) 多重?zé)晒獾鞍子跋窦夹g(shù) ( Multi-Color GFP Imaging ) 細(xì)胞離子流定量分析 ( Cellular Ion Concentration and Ratio Imaging ) 長(zhǎng)時(shí)間影像記錄 ( Time-Lapse Recording ) Z軸掃描與測(cè)量 ( Z-section and measurement ) 基因

6、影像分析 ( Genetic FISH imaging and quantification ) 染色體多重?zé)晒庠憩F(xiàn) ( Chromosome spectral analysis ) 活體胚胎研究 ( Embryo, Zebrafish / Drosophila embryo ) 穿透光影像 / 反射光影像 材料表面分析 ( Surface and roughness analysis ) 材料顯微硬度分析 ( Micro-Hardness analysis ) 晶園分析 ( Wafer analysis ) 薄膜分析 ( Thin layer analysis )2 多光子激光掃描熒光顯

7、微鏡近年來(lái)，光學(xué)顯微鏡技術(shù)中的一個(gè)最引人注目的成就是雙光子激發(fā)現(xiàn)象(two-photon excitation，簡(jiǎn)稱TPE)在共焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，簡(jiǎn)稱CLSM)中的廣泛應(yīng)用 隨著飛秒激光技術(shù)和光學(xué)顯微鏡技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在人們已經(jīng)能夠比較容易地制造并使用雙光子共焦激光掃描顯微鏡(twophoton laser scanning microscopy，簡(jiǎn)稱TPLSM)，對(duì)樣品在雙光子激發(fā)后發(fā)出的熒光進(jìn)行觀察和三維成像目前, 以雙光子技術(shù)為代表的多光子技術(shù)已經(jīng)在生物及醫(yī)學(xué)成像、單分子探測(cè)、三維信息存儲(chǔ)、微加工等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用, 為

8、開(kāi)拓新學(xué)科和促進(jìn)科學(xué)研究領(lǐng)域向更高層次發(fā)展起到了非常重要的作用利用雙光子共焦激光掃描顯微鏡的特點(diǎn)揭示了許多新現(xiàn)象和新規(guī)律， 展示了廣闊的發(fā)展前景。2.1多光子激光掃描熒光顯微鏡基本原理多光子激光掃描熒光顯微鏡在激光照射下，基態(tài)熒光分子或原子吸收一個(gè)光子后成為激發(fā)態(tài)，隨后又弛豫到某一基態(tài)，同時(shí)以光子形式釋放能量而發(fā)出熒光這一過(guò)程就是通常的單光子激發(fā)情況1931年，Maria G6ppertMayer預(yù)言一個(gè)分子或原子可以在同一個(gè)量子過(guò)程中，同時(shí)吸收兩個(gè)光子而成激發(fā)態(tài)，這種情況就是雙光子激發(fā)過(guò)程 1961年，Kaiser等在CaF2：Eu” 晶體中首次觀察到了這種雙光子激發(fā)現(xiàn)象比如在單光子激發(fā)情形

9、，NADH酶在350nm 的光激發(fā)下產(chǎn)生450nm的熒光，而在雙光子激發(fā)情形，NADH酶則需同時(shí)吸收兩個(gè)700nm的光子才能產(chǎn)生450rim的熒光這就是說(shuō)，雙光子技術(shù)可以使我們無(wú)需使用紫外光源就能達(dá)到檢測(cè)紫外熒光探針的目的，由于雙光子激發(fā)所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與激發(fā)光的光強(qiáng)平方成正比，因而與單光子激發(fā)的線性過(guò)程相比，雙光子激發(fā)就需要很強(qiáng)的激發(fā)光強(qiáng)，這就使雙光子激發(fā)具有很高的空間局域特點(diǎn)2。 圖2 光子激發(fā)示意圖2.2 多光子激光掃描熒光顯微鏡的應(yīng)用領(lǐng)域 多光子共焦激光掃描顯微鏡已延伸到各個(gè)研究和應(yīng)用領(lǐng)域. 它能對(duì)處在自然狀態(tài)下的樣品進(jìn)行三維無(wú)損觀察 ,并能提高系統(tǒng)的分辨率和信噪比.利用多光子激發(fā)后材

10、料性質(zhì)的變化 ,還可以實(shí)現(xiàn)三維高度數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和三維任意方向的微細(xì)加工 ,具有很高的應(yīng)用價(jià)值. 可以相信 ,隨著與多光子共焦顯微鏡相關(guān)的機(jī)械、材料、激光技術(shù)等的進(jìn)一步發(fā)展 多光子共焦激光掃描顯微鏡將得到更大的發(fā)展和更廣泛的應(yīng)用.3 激光掃描共焦顯微鏡和多光子激光掃描顯微鏡的比較激光共聚焦顯微鏡是80 年代隨著光學(xué)、視頻、計(jì)算機(jī)等技術(shù)的飛速發(fā)展而誕生的新一代顯微鏡。自從1957 年馬文·閔斯基在他的美國(guó)專利上首次闡明掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)的某些基本原理, 激光顯微鏡技術(shù)得到逐步發(fā)展。1970年牛津和阿姆斯特丹同時(shí)向科學(xué)界推薦了一種新型的掃描共聚焦顯微鏡, 它是在熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上加裝了激

11、光掃描裝置, 利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理, 使用紫外或激光激發(fā)熒光探針。能夠得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像,由于它采用激光作光源, 發(fā)射角小, 方向性好, 在發(fā)射光檢測(cè)光路上放置了一個(gè)與入射光針孔共軛的檢測(cè)針孔, 使焦平面的光可以通過(guò)檢測(cè)針孔, 而來(lái)自焦平面上、下的光被阻擋在針孔的兩邊。因此, 可得到高清晰度的圖像。目前, 激光共聚焦顯微鏡已發(fā)展到擁有12 通道, 0b 360b 旋轉(zhuǎn)掃描,配以微幼步進(jìn)馬達(dá)控制載物臺(tái)的升降, 對(duì)樣本進(jìn)行無(wú)損傷光學(xué)切片, 獲得其三維立體結(jié)構(gòu)可在亞細(xì)胞水平上觀察諸如Ca2+ 、pH 值、膜電位等生理信號(hào)及細(xì)胞形態(tài)的變化, 成為形態(tài)學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥

12、理學(xué)、遺傳學(xué)等領(lǐng)域中新一代強(qiáng)有力的研究工具。但激光共聚焦顯微鏡存在如下問(wèn)題: ( 1) 要求共聚焦即照明針孔與探測(cè)針孔共軛; ( 2)探針對(duì)樣品深度的干擾; ( 3) 樣本遭到光漂白作用和光致毒作用 。多光子激光掃描顯微鏡的應(yīng)用使這些問(wèn)題迎刃而解。多光子吸收的歷史可追溯到1931 年, 當(dāng)時(shí)M1 G1Meier做出了高光強(qiáng)度下多光子吸收會(huì)發(fā)生的理論預(yù)斷 3 , 1961年在貝爾實(shí)驗(yàn)室用脈沖紅寶石激光器激發(fā)銪離子熒光時(shí)首次觀察到雙光子吸收, 1989 年在美國(guó)康奈爾大學(xué)W1 Denk、J1H1 Stricker 和W1W1Webb 制成第一臺(tái)多光子激光顯微鏡。此后, 多光子激光顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)

13、域發(fā)揮了重要的作用。現(xiàn)將兩者作簡(jiǎn)單比較。（1） 多光子激光掃描顯微鏡采用飛秒激光器, 其驚人的應(yīng)用之一是敏感的生物結(jié)構(gòu)現(xiàn)象, 它容許的峰值功率密度大于1011WPcm2, 比激光共聚焦掃描顯微鏡105WPcm2 要高許多。激光共聚焦掃描顯微鏡采用可見(jiàn)光激光, 能量連續(xù)激發(fā), 多光子激光掃描顯微鏡采用波長(zhǎng)較長(zhǎng)的紅外激光, 能量脈沖式激發(fā), 紅外光比可見(jiàn)光在生物組織中的穿透力更強(qiáng), 因此多光子激光掃描顯微鏡更能解決生物組織中深層物質(zhì)的層析成像問(wèn)題, 擴(kuò)大了應(yīng)用范圍。（2） 激光共聚焦顯微鏡是單光子激發(fā), 在整個(gè)掃描焦平面以及掃描上下都產(chǎn)生熒光的激發(fā), 采用與照明針孔共軛的探測(cè)針孔, 使焦平面以外的

14、點(diǎn)不會(huì)在探測(cè)針孔處成像, 從而提高了顯微鏡的分辨率, 但與此同時(shí), 在生物樣品的整個(gè)掃描面及掃描面上下, 造成熒光大范圍的激發(fā), 從而導(dǎo)致整個(gè)組織的廣泛漂白和光動(dòng)力學(xué)損傷。多光子激光掃描顯微鏡采用多光子激發(fā), 這是一個(gè)非線性過(guò)程, 具有準(zhǔn)確的定位特征, 也就是只有在焦點(diǎn)處的光子才能激發(fā)熒光分子, 光漂白和光損傷僅局限于焦點(diǎn)附近, 且有利于減少測(cè)試樣品的自發(fā)熒光,這樣可以對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的觀察。（3） 激光共聚焦掃描顯微鏡因?yàn)橛袩晒獯蠓秶募ぐl(fā), 所以需要共焦針孔來(lái)選擇熒光。多光子激光掃描顯微鏡的熒光激發(fā)只發(fā)生在焦點(diǎn), 不需共焦針孔選擇熒光, 因此測(cè)量光路更加簡(jiǎn)單、可靠、有效, 設(shè)備簡(jiǎn)單易攜

15、, 故障率低。（4）多光子激光掃描顯微鏡比激光共聚焦掃描顯微鏡具有更準(zhǔn)確的定位, 因而保證了更高的三維分辨率, 使背景的干擾相對(duì)減少, 進(jìn)一步提高了圖像清晰度。（5）多光子激光掃描顯微鏡的熒光波長(zhǎng)遠(yuǎn)離激發(fā)光波長(zhǎng), 因此多光子顯微鏡可實(shí)現(xiàn)暗場(chǎng)成像。（6） 激光共聚焦掃描顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)方面經(jīng)常應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)游離鈣測(cè)量, 細(xì)胞內(nèi)pH 測(cè)量、熒光原位雜交分析, 免疫組化, 膜的流動(dòng)性, 胞間通訊等方面。多光子激光掃描顯微鏡除具有上述功能外, 在以下方面有著更多的應(yīng)用: 在特制的培養(yǎng)皿上可殺死或移動(dòng)不需要的細(xì)胞, 分離單層貼壁細(xì)胞, 在細(xì)胞生長(zhǎng)表面作微區(qū)劃分, 長(zhǎng)時(shí)間觀察細(xì)胞生長(zhǎng), 建立維護(hù)混合細(xì)胞體系

16、, 進(jìn)行腫瘤移植, 控制細(xì)胞生長(zhǎng)速度,建立穩(wěn)定的細(xì)胞系, 建立細(xì)胞原代培養(yǎng), 進(jìn)行藥物篩選。 由于多光子技術(shù)的發(fā)展時(shí)間短, 技術(shù)本身也存在一些局限。( 1) 只能對(duì)熒光成像;( 2) 由于紅外和近紅外光源的使用, 樣品可能受到熱損傷;( 3) 分辨率略有降低;( 4) 受昂貴的超快激光器限制, 目前多光子掃描顯微鏡的成本較高。圖3 激光掃描共焦顯微鏡和多光子激光掃描顯微鏡顯微成像圖像的比較參考文獻(xiàn)1 Javad N. Farahani , Matthew J. Schibler and Laurent A. Bentolila，Stimulated Emission Depletion (ST

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