液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用

1、液相色譜-質(zhì)譜連用的結(jié)構(gòu)及樣品的預(yù)處理技術(shù)1.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用背景氣相色譜氣相色譜- -質(zhì)譜聯(lián)用在我國(guó)已有質(zhì)譜聯(lián)用在我國(guó)已有2020多年的歷史，氣相色多年的歷史，氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)成熟運(yùn)用至今，人們?cè)絹?lái)越不滿足僅僅分析那譜質(zhì)譜技術(shù)成熟運(yùn)用至今，人們?cè)絹?lái)越不滿足僅僅分析那些具有揮發(fā)性和低分子量的化合物，面對(duì)日益增加的大分些具有揮發(fā)性和低分子量的化合物，面對(duì)日益增加的大分子量和不揮發(fā)化合物分析，迫切需要用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用子量和不揮發(fā)化合物分析，迫切需要用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用解決實(shí)際問(wèn)題。解決實(shí)際問(wèn)題。液相色譜（液相色譜（HPLC)HPLC)可以直接分離難揮發(fā)、大分子、強(qiáng)極性可以直接分離難揮發(fā)、大分子、

2、強(qiáng)極性及熱穩(wěn)定性差的化合物，及熱穩(wěn)定性差的化合物，LC/MSLC/MS聯(lián)用是分析界所期待。聯(lián)用是分析界所期待。由由于于LCLC流動(dòng)相與流動(dòng)相與MSMS傳統(tǒng)電離源的高真空難以相容，還要在溫和的傳統(tǒng)電離源的高真空難以相容，還要在溫和的條件下使樣品帶上電荷而樣品本身不分解，大量的樣品不得不條件下使樣品帶上電荷而樣品本身不分解，大量的樣品不得不采取脫機(jī)方式采取脫機(jī)方式MSMS鑒定，或制成衍生物用鑒定，或制成衍生物用 GCGCMSMS分析。經(jīng)過(guò)努分析。經(jīng)過(guò)努力相繼出現(xiàn)了多種液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用接口，實(shí)現(xiàn)了液相色譜力相繼出現(xiàn)了多種液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用接口，實(shí)現(xiàn)了液相色譜質(zhì)譜的聯(lián)用。特別是大氣壓電離質(zhì)譜（質(zhì)譜的聯(lián)用

3、。特別是大氣壓電離質(zhì)譜（APIMSAPIMS）的實(shí)現(xiàn)為）的實(shí)現(xiàn)為L(zhǎng)CLCMSMS的兼容創(chuàng)造了機(jī)會(huì)，商品化的小型的兼容創(chuàng)造了機(jī)會(huì)，商品化的小型 LCLCMSMS作為成熟的常作為成熟的常規(guī)分析儀器在九十年代已經(jīng)在生物醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)室發(fā)揮著重要作用。規(guī)分析儀器在九十年代已經(jīng)在生物醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)室發(fā)揮著重要作用。2.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用適用范圍液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的基本流程液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的基本流程為：混合的樣品經(jīng)高效液為：混合的樣品經(jīng)高效液相色譜柱分離后成為多個(gè)單一組分，依次通過(guò)液相色譜相色譜柱分離后成為多個(gè)單一組分，依次通過(guò)液相色譜質(zhì)譜接口進(jìn)入質(zhì)譜儀的離子源，離子化后的樣品經(jīng)過(guò)質(zhì)量質(zhì)譜接口進(jìn)入質(zhì)譜儀的離子源，離子化

4、后的樣品經(jīng)過(guò)質(zhì)量分析器分析后由檢測(cè)系統(tǒng)記錄，后經(jīng)數(shù)據(jù)系統(tǒng)采集處理，分析器分析后由檢測(cè)系統(tǒng)記錄，后經(jīng)數(shù)據(jù)系統(tǒng)采集處理，得到帶有結(jié)構(gòu)信息的質(zhì)譜圖。得到帶有結(jié)構(gòu)信息的質(zhì)譜圖。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用主要可以解決以下的問(wèn)題液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用主要可以解決以下的問(wèn)題：不揮發(fā)性化：不揮發(fā)性化合物的測(cè)定；極性化合物的分析測(cè)定；熱不穩(wěn)定性化合物合物的測(cè)定；極性化合物的分析測(cè)定；熱不穩(wěn)定性化合物的分析測(cè)定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物的分析測(cè)定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析測(cè)定；沒有商品化的譜庫(kù)可對(duì)比查詢，只能自等）的分析測(cè)定；沒有商品化的譜庫(kù)可對(duì)比查詢，只能自己建庫(kù)或自己解析圖譜。己建庫(kù)或自

5、己解析圖譜。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用基本流程3.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)構(gòu)分析離子源：使被分析樣品的原子或分子離離子源：使被分析樣品的原子或分子離化為帶電粒子（離子）的裝置，并對(duì)離子化為帶電粒子（離子）的裝置，并對(duì)離子進(jìn)行加速使其進(jìn)入分析器，根據(jù)離子化方進(jìn)行加速使其進(jìn)入分析器，根據(jù)離子化方式不同，有機(jī)質(zhì)譜中常用的有：式不同，有機(jī)質(zhì)譜中常用的有：EIEI，ESIESIEI:電子轟擊電離硬電離ESI:電噴霧電離屬最軟的電離方式。適宜極性分子的分析，能分析大分子小分子APCI:大氣壓化學(xué)電離，更加適用于非極性分子的電離實(shí)驗(yàn)室中現(xiàn)有的離子源：EI,APCI電噴霧電離接口的結(jié)構(gòu)和工作原理配套的電噴霧電離接口主要由

6、兩個(gè)功能部分組成：接口本身以及由氣體加熱，真空度指示，附加機(jī)械泵開關(guān)組成的控制單元。較新的設(shè)計(jì)中，接口操作包含在系統(tǒng)的整體控制之內(nèi)。接口示意圖如圖所示的接口主要由大氣壓離子化室和離子聚焦透鏡組件構(gòu)成。噴口一般由雙層同心管組成，外層通入氮?dú)庾鳛閲婌F氣體，內(nèi)層輸送流動(dòng)相及樣品溶液。某些接口還增加了“套氣”設(shè)計(jì)，其主要作用為改善噴霧條件以提高離子化效率。離子化室和聚焦單元之間由一根內(nèi)徑為0.5mm的帶惰性金屬包頭的玻璃毛細(xì)管相通，它的主要作用為形成離子化室和聚焦單元的真空差，造成聚焦單元對(duì)離子化室的負(fù)壓，傳輸由離子化室形成的離子進(jìn)入聚焦單元并隔離加在毛細(xì)管入口處的3-8kv的高壓，此高壓的極性可通過(guò)

7、化學(xué)工作站方便的切換以造成不同的離子化模式，適應(yīng)不同的需要。離子聚焦部分一般由兩個(gè)錐形分離器和靜電透鏡組成，并可以施加不同的調(diào)諧電壓。較新的接口設(shè)計(jì)采用六級(jí)桿或八級(jí)桿作為離子導(dǎo)較新的接口設(shè)計(jì)采用六級(jí)桿或八級(jí)桿作為離子導(dǎo)向器或離子聚焦手段，取代或部分取代了原先的向器或離子聚焦手段，取代或部分取代了原先的錐形分離器和靜電透鏡組件。六級(jí)桿或八級(jí)桿被錐形分離器和靜電透鏡組件。六級(jí)桿或八級(jí)桿被供給大約供給大約5MHz5MHz的射頻電壓以有效地提高離子傳輸?shù)纳漕l電壓以有效地提高離子傳輸效率（效率（90%),90%),靈敏度有很大提高。靈敏度有很大提高。離子化過(guò)程：以一定流速進(jìn)入噴口的樣品溶液及液相色譜流動(dòng)

8、相，經(jīng)噴霧作用被分散成直徑約為1-3um的細(xì)小液滴。在噴口和毛細(xì)管入口之間設(shè)置的幾千伏的高壓下，這些液滴由于表面電荷的不均勻分布和靜電引力而被破碎成更細(xì)小的液滴。在加熱的干燥氮?dú)庾饔孟?，液滴中的溶劑被快速蒸發(fā)，直至表面電荷增大到庫(kù)倫排斥力大于表面張力而爆裂，產(chǎn)生帶電的子液滴，子液滴中的溶劑繼續(xù)蒸發(fā)引起再次爆裂。此過(guò)程循環(huán)往復(fù)直至液滴表面形成很強(qiáng)的電場(chǎng)，而將離子由液滴表面排入氣相中，離子化過(guò)程完成。APCI接口的結(jié)構(gòu)及工作原理APCI接口構(gòu)成與ESI接口的區(qū)別增加了一根電暈放針，并將其對(duì)共地點(diǎn)的電壓設(shè)置為+-（12002000）V，其功能為發(fā)射自由電子并啟動(dòng)后續(xù)的離子化過(guò)程對(duì)噴霧氣體加熱，同時(shí)也

9、加大了對(duì)干燥氣體的可加熱范圍。由于對(duì)噴霧U氣體的加熱以及APCI的離子化過(guò)程對(duì)流動(dòng)相的組成依賴較小，故APCI操作中可采用組成較為簡(jiǎn)單的，含水較多的流動(dòng)相。工作原理：放電針?biāo)a(chǎn)生的自由電子首先轟擊空氣中氧氣、氮?dú)?、水產(chǎn)生 O2+ N2+ NO+ H2+O等初級(jí)離子，再由這些離子與樣品分子進(jìn)行質(zhì)子或電子交換而使其離子化并進(jìn)入氣相。電噴霧（電噴霧（ESIESI）的特點(diǎn)）的特點(diǎn) 通常小分子得到M+H+ +,M+Na+ 或M-H-單電荷離子，生物大分子產(chǎn)生多電荷離子，由于質(zhì)譜儀測(cè)定質(zhì)/荷比，因此質(zhì)量范圍只有幾千質(zhì)量數(shù)的質(zhì)譜儀可測(cè)定質(zhì)量數(shù)十幾萬(wàn)的生物大分子。電噴霧電離是最軟的電離技術(shù)，通常只產(chǎn)生分子離子

10、峰，因此可直接測(cè)定混合物，并可測(cè)定熱不穩(wěn)定的極性化合物；其易形成多電荷離子的特性可分析蛋白質(zhì)和DNA等生物大分子；通過(guò)調(diào)節(jié)離子源電壓控制離子的碎裂（源內(nèi)CID）測(cè)定化合物結(jié)構(gòu)。大氣壓化學(xué)電離（大氣壓化學(xué)電離（APCIAPCI）特點(diǎn)）特點(diǎn) 大氣壓化學(xué)電離也是軟電離技術(shù)，只產(chǎn)生單電荷峰，適合測(cè) 定 質(zhì) 量 數(shù) 小 于2000Da的弱極性的小分子化合物；適應(yīng)高流量的梯度洗脫/高低水溶液變化的流動(dòng)相；通過(guò)調(diào)節(jié)離子源電壓控制離子的碎裂。質(zhì)量分析器是：質(zhì)譜儀中將離子按照荷質(zhì)比分開質(zhì)量分析器是：質(zhì)譜儀中將離子按照荷質(zhì)比分開的部分，離子通過(guò)分析器后，按不同荷質(zhì)比的部分，離子通過(guò)分析器后，按不同荷質(zhì)比(M/Z)

11、(M/Z)分分開，將相同的開，將相同的M/ZM/Z離子聚焦在一起，組成質(zhì)譜。離子聚焦在一起，組成質(zhì)譜。 檢測(cè)接收器：接收離子束流的裝置，有電子倍增檢測(cè)接收器：接收離子束流的裝置，有電子倍增器、光電倍增器、微通道板器、光電倍增器、微通道板數(shù)據(jù)及供電系統(tǒng)：將接收來(lái)的信號(hào)放大、處理并數(shù)據(jù)及供電系統(tǒng)：將接收來(lái)的信號(hào)放大、處理并分析給出結(jié)果及控制質(zhì)譜儀每個(gè)部分工作分析給出結(jié)果及控制質(zhì)譜儀每個(gè)部分工作3.液相色譜-質(zhì)譜分析條件選擇優(yōu)化（一）接口的選擇：（一）接口的選擇：EIEI適合于中等極性到強(qiáng)極性的化合物分子，特別適合于中等極性到強(qiáng)極性的化合物分子，特別是那些在溶液中能預(yù)先形成離子的化合物和可以是那些在

12、溶液中能預(yù)先形成離子的化合物和可以獲得多個(gè)質(zhì)子的大分子（如蛋白質(zhì)）獲得多個(gè)質(zhì)子的大分子（如蛋白質(zhì)）APCIAPCI不適合可帶多個(gè)電荷的大分子，其優(yōu)勢(shì)在于不適合可帶多個(gè)電荷的大分子，其優(yōu)勢(shì)在于弱極性或中等極性的小分子的分析弱極性或中等極性的小分子的分析。（二）正負(fù)離子模式的選擇選擇的一般原則：正離子模式正離子模式: :適合于堿性樣品，可用乙酸或甲適合于堿性樣品，可用乙酸或甲酸對(duì)樣品加以酸化。樣品中含有仲氮或叔酸對(duì)樣品加以酸化。樣品中含有仲氮或叔氮時(shí)可優(yōu)先考慮使用正離子模式。氮時(shí)可優(yōu)先考慮使用正離子模式。負(fù)離子模式：適合于酸性樣品，可用氮水或負(fù)離子模式：適合于酸性樣品，可用氮水或三乙胺對(duì)樣品進(jìn)行堿

13、化。樣品中含有較多三乙胺對(duì)樣品進(jìn)行堿化。樣品中含有較多的強(qiáng)伏電性基團(tuán)，如含氯、含溴和多個(gè)羥的強(qiáng)伏電性基團(tuán)，如含氯、含溴和多個(gè)羥基時(shí)可嘗試使用負(fù)離子模式?；鶗r(shí)可嘗試使用負(fù)離子模式。（三）流動(dòng)相的選擇常用的流動(dòng)相為甲醇、乙腈、水和它們不同比例常用的流動(dòng)相為甲醇、乙腈、水和它們不同比例的混合物以及一些易揮發(fā)鹽的緩沖液，如甲酸胺、的混合物以及一些易揮發(fā)鹽的緩沖液，如甲酸胺、乙酸銨等。還可以加入易揮發(fā)酸堿如甲酸、乙酸乙酸銨等。還可以加入易揮發(fā)酸堿如甲酸、乙酸和氨水等調(diào)節(jié)和氨水等調(diào)節(jié)PHPH。LC/MSLC/MS接口避免進(jìn)入不揮發(fā)的緩沖液，避免含磷和接口避免進(jìn)入不揮發(fā)的緩沖液，避免含磷和氯的緩沖液，含鈉和

14、鉀的成分必須氯的緩沖液，含鈉和鉀的成分必須1mmol/l(1mmol/l(鹽分鹽分太高會(huì)抑制離子源信號(hào)和堵塞噴霧針及污染儀器）太高會(huì)抑制離子源信號(hào)和堵塞噴霧針及污染儀器）含甲酸（或乙酸）含甲酸（或乙酸）2%2%，含三氟乙酸，含三氟乙酸0.5%0.5%，含三，含三乙胺乙胺1%1%，含醋酸銨，含醋酸銨10-5mmol/l10-5mmol/l送樣前一定要摸好送樣前一定要摸好LCLC條件，能夠基本分離，緩沖條件，能夠基本分離，緩沖體系符合體系符合MSMS要求。要求。（四）流量和色譜柱的選擇不加熱的不加熱的ESIESI的最佳流速是的最佳流速是1-50ul/min,1-50ul/min,應(yīng)用應(yīng)用4.6mm

15、4.6mm內(nèi)徑內(nèi)徑LCLC柱時(shí)要求柱后分流，目前大多數(shù)采用柱時(shí)要求柱后分流，目前大多數(shù)采用1-1.2mm1-1.2mm內(nèi)徑的微柱。內(nèi)徑的微柱。APCIDAPCID的最佳流速的最佳流速1ml/min1ml/min，常規(guī)直徑，常規(guī)直徑4.6mm4.6mm柱最為柱最為合適。合適。為了提高分析效率，常采用為了提高分析效率，常采用100mm100mm的短柱，這對(duì)的短柱，這對(duì)于大批量定量分析可以節(jié)約大量的時(shí)間。于大批量定量分析可以節(jié)約大量的時(shí)間。（五）輔助氣體流量和溫度的選擇霧化氣對(duì)流出液形成噴霧有影響，干燥氣影響噴霧化氣對(duì)流出液形成噴霧有影響，干燥氣影響噴霧去溶劑的效果，碰撞氣影響二級(jí)質(zhì)譜的產(chǎn)生。霧去溶

16、劑的效果，碰撞氣影響二級(jí)質(zhì)譜的產(chǎn)生。操作中溫度的選擇和優(yōu)化主要是指接口的干燥氣操作中溫度的選擇和優(yōu)化主要是指接口的干燥氣體而言，體而言，一般情況下選擇干燥氣溫度高于分析物的沸點(diǎn)20 左右即可。對(duì)熱不穩(wěn)定性化合物，要選用更低的溫度以避免顯著的分解。選用干燥氣溫度和流量大小時(shí)還要考慮流動(dòng)相的組成，有機(jī)溶劑比例高時(shí)可采用適當(dāng)?shù)偷臏囟群土髁啃∫稽c(diǎn)的。樣品的預(yù)處理為什么要進(jìn)行樣品的預(yù)處理：從保護(hù)儀器角度出發(fā)，防止固體小顆粒堵塞進(jìn)樣從保護(hù)儀器角度出發(fā)，防止固體小顆粒堵塞進(jìn)樣管道和噴嘴，防止污染儀器，降低分析背景，排管道和噴嘴，防止污染儀器，降低分析背景，排除對(duì)分析結(jié)果的干擾。除對(duì)分析結(jié)果的干擾。要求獲得最

17、佳的分析結(jié)果，從要求獲得最佳的分析結(jié)果，從ESIESI電離的過(guò)程分析：電離的過(guò)程分析：ESIESI電荷是在液滴的表面電荷是在液滴的表面，樣品與雜質(zhì)在液滴表面樣品與雜質(zhì)在液滴表面存在競(jìng)爭(zhēng)存在競(jìng)爭(zhēng)，不揮發(fā)物不揮發(fā)物（如磷酸鹽等）（如磷酸鹽等）防礙帶電液防礙帶電液滴表面揮發(fā)滴表面揮發(fā)，大量雜質(zhì)防礙帶電樣品離子進(jìn)入氣大量雜質(zhì)防礙帶電樣品離子進(jìn)入氣相狀態(tài)相狀態(tài)，增加電荷中和的可能。，增加電荷中和的可能。樣品制備要求：樣品要力求干凈，不含顯著量的雜質(zhì)，樣品要力求干凈，不含顯著量的雜質(zhì)，尤其是與分析無(wú)關(guān)的蛋白質(zhì)和肽類尤其是與分析無(wú)關(guān)的蛋白質(zhì)和肽類不含有高濃度的難揮發(fā)酸不含有高濃度的難揮發(fā)酸( (磷酸、硫酸等

18、）磷酸、硫酸等）及其鹽，難揮發(fā)性酸及其鹽的侵入會(huì)引起及其鹽，難揮發(fā)性酸及其鹽的侵入會(huì)引起很強(qiáng)的噪聲，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成儀器噴口處放很強(qiáng)的噪聲，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成儀器噴口處放電。電。樣品粘度不能過(guò)大，防止堵塞柱子、噴樣品粘度不能過(guò)大，防止堵塞柱子、噴口及毛細(xì)管入口?？诩懊?xì)管入口。樣品的預(yù)處理常用方法a a）超濾）超濾b b）溶劑萃取去鹽）溶劑萃取去鹽c c）固相萃?。┕滔噍腿 d）灌注（）灌注（PerfusionPerfusion）凈化去鹽）凈化去鹽e e）色譜分離）色譜分離 反相色譜分離反相色譜分離 親和技術(shù)分離親和技術(shù)分離f f）甲醇或乙腈沉淀蛋白）甲醇或乙腈沉淀蛋白g g）酸水解，酶解）酸水解，酶解h h）衍生化）衍生化1.固相萃取固相萃取材料與柱色譜固相萃取材料與柱色譜 中所用類似，要根據(jù)被分析物和中所用類似，要根據(jù)被分析物和樣品基質(zhì)的性質(zhì)，對(duì)于一般的有機(jī)物、帶有烷基的疏水化樣品基質(zhì)的性質(zhì)，對(duì)于一般的有機(jī)物、帶有烷基的疏水化合物和非極性化合物可用合物和非極性化合物可用C C1818、C C8 8、C C2 2 的非極性填料；對(duì)的非極性填料；對(duì)于親水化合物、胺類和含羥基化合物可用氰基和二醇等鍵于親水化合物、胺類和含羥基化合物可用氰基和二醇等鍵合的極性填料。對(duì)離子化合物可用離子交換樹脂為填料。合的極性填料。對(duì)離子