豬瘟病毒研究進(jìn)展

1、豬瘟病毒研究進(jìn)展摘要：豬瘟（CSF）是一種高度接觸傳染性致死性疾病，對家豬和野豬都有危害。豬瘟的爆發(fā)能夠?qū)︷B(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。防控和凈化該病的主要策略是通過系統(tǒng)的疫苗免疫和免疫穩(wěn)定后的不免疫凈化策略。對于該病防控及凈化措施的探索使得學(xué)術(shù)界和養(yǎng)豬界取得了長足的進(jìn)步，并且通過不間斷的探索，我們對CSFV的復(fù)制機(jī)制、毒力有了明確的認(rèn)識，并有助于我們研發(fā)相應(yīng)的疫苗。該綜述中，我們對最近在CSFV流行病學(xué)、基因組分子結(jié)構(gòu)與特征、病毒毒力的分子機(jī)制及抗病毒技術(shù)的發(fā)展等方面的最新研究成果進(jìn)行綜述。關(guān)鍵詞：CSFV、流行病學(xué)、反向遺傳學(xué)、豬瘟病毒生存期、蛋白質(zhì)功能、病毒毒力1 豬瘟的流行特點(diǎn)和免疫策略豬

2、瘟（CSF、HC）是一種高度接觸傳染性致死性疾病，對養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。該病被OIE陸生動物衛(wèi)生法典列為必須通報(bào)的疾病。該病最早于1810年在美國田納西州被發(fā)現(xiàn)，隨后迅速傳播至世界各地。該病在加拿大（1963）、美國（1978）、澳大利亞和新西蘭等國已被成功凈化，但是仍肆虐在亞洲國家、南美、東歐以及部分前蘇聯(lián)國家。該病的病原是豬瘟病毒（CSFV），屬于黃病毒科瘟病毒屬成員，與牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）及邊界病毒同屬一科?？刂艭SFV的策略主要包括兩個方面，即撲滅措施（不免疫）和系統(tǒng)的免疫凈化措施。在采用不免疫策略時，豬瘟疫情的爆發(fā)會給高密度養(yǎng)豬區(qū)域帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。因此，在除了歐盟之外

3、的許多國家都是用系統(tǒng)的免疫和免疫后凈化策略來控制CSFV。例如，中國當(dāng)前采取的即是免疫凈化策略，國家規(guī)定養(yǎng)豬區(qū)域每年的免疫密度必須達(dá)到90%以上。自1904年該病的病原被定性為病毒以后，許多CSFV疫苗被研發(fā)。改良活疫苗（通過在非易感宿主體內(nèi)連續(xù)傳代得到的減毒活疫苗）被大量使用，其中最主要的毒株是商品化的C株疫苗，該毒株相對其他毒株而言具有安全高效的特點(diǎn)。C株疫苗能夠上調(diào)抗體水平，并且能夠活化T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，而基于E2蛋白的亞單位疫苗僅僅能夠誘導(dǎo)一種抗CSFV的抗體產(chǎn)生。通過對CSFV毒株的進(jìn)化分析得知，該病毒分為三種基因型，其中又分為高毒力毒株、中等毒力毒株和低毒力或無毒力毒株（大多數(shù)疫苗

4、株）。高毒力毒株和改良的或疫苗毒株都屬于基因1型，而基因2型和3型毒株具有較低的毒力。如我們之前報(bào)道的一樣，基因1型CSFV在田間能夠發(fā)生多種突變，發(fā)生在歐洲和亞洲的基因2型CSFV疫情越來越多。這種現(xiàn)象表明來源于基因1型毒株的E2亞單位疫苗可能不能對基因2型毒株的高毒力CSFV產(chǎn)生有效的保護(hù)作用。C株疫苗在很長一段時間內(nèi)應(yīng)該都是有效的，得益于它能夠誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞免疫。GPE毒株疫苗在豬體內(nèi)傳代后毒力有返強(qiáng)現(xiàn)象。C株疫苗的毒力不能通過連續(xù)的豬與豬之間的傳播試驗(yàn)而返強(qiáng)，但是該毒株能夠與田間流行毒株發(fā)生基因重組，從而產(chǎn)生新的特性未知的毒株?；谝陨系难芯拷Y(jié)果，對DIVA標(biāo)記的基因2型疫苗的研制顯得

5、特別重要，這有助于我們對CSFV進(jìn)行控制和凈化。該產(chǎn)品的實(shí)現(xiàn)依賴于對反向遺傳系統(tǒng)的操作和對CSFV蛋白功能的了解。2 反向遺傳系統(tǒng)和CSFV毒力研究2.1 反向遺傳系統(tǒng)反向遺傳學(xué)（RG）能夠建立一種有著全長病毒基因拷貝的病毒，該方法是現(xiàn)代病毒學(xué)研究中一種強(qiáng)有力的手段。RG在探究病毒的復(fù)制、感染、病毒蛋白的功能、重組的發(fā)生率、病毒與宿主的相互作用、抗病毒研究及標(biāo)記疫苗研究等方面發(fā)揮重要作用。截至目前，已有至少五種拯救CSFV病毒的方法，這些方法從很大程度上促進(jìn)了CSFV研究的進(jìn)程。1996年的一項(xiàng)極具重要性的研究報(bào)道了一種體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，研究發(fā)現(xiàn)，SK6細(xì)胞系在被轉(zhuǎn)染了體外轉(zhuǎn)錄得到的RNA后拯救得

6、到了感染性的CSFV。然而，體外轉(zhuǎn)錄的RNA的含量很低，隨后，四種更好的反向遺傳系統(tǒng)被構(gòu)建，一是Fan等于2009年報(bào)道的BHK-21細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率是PK15細(xì)胞的10倍之多，他們創(chuàng)建了一種新的程序，使用高效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（BHK-21）轉(zhuǎn)染體外合成的RNA，利用PK15 IX細(xì)胞評價(jià)BHK-21細(xì)胞（沒有CSFV受體）和PK15細(xì)胞（有CSFV受體）的轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將被感染的PK15細(xì)胞的上清作用后，相比于只用體外轉(zhuǎn)錄的RNA 轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，能夠提高8倍的效率。二是Van Gennip等于1999年研究出的一種新奇的、更加方便高效的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，該系統(tǒng)與體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)相比能提高200倍左

7、右的病毒量，他們建立了一種穩(wěn)定的能表達(dá)T7 RNA聚合酶（SK6-T7RNApol）的豬腎細(xì)胞系，并且將一種線性化的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)了SK6-T7RNApol中。三是Bergeron and Perreault于2002年插入了丁型肝炎病毒核糖酶以發(fā)揮其催化形成準(zhǔn)確的3非編碼區(qū)的作用。病毒的3非編碼區(qū)在一種重要的叫做SrfI的酶的幫助下能夠規(guī)避模板DNA的線性化（Zou et al., 2011）。為了避免線性化，Van Gennip等于1999年利用SK6-T7RNA-pol與環(huán)狀DNA一起進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)錄，該操作與體內(nèi)轉(zhuǎn)錄相比提高了20倍的病毒滴度，但是與線性DNA的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄相比，病毒滴度降低

8、了近10倍。Huang等2013年使PK-15細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶（PK15-T7RNApol），而后利用它進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)錄。四是Li等于2013年構(gòu)建的CSFV 的一個5非編碼區(qū)被CMV啟動子、T7啟動子和錘頭狀核酶（HamRZ）標(biāo)記、3非編碼區(qū)被HdvRZ、T7終止子和SV40標(biāo)記的cDNA克隆。HamRZ在被設(shè)計(jì)的CSFV中能夠形成一個精確的5非編碼區(qū)，并且該cDNA克隆能夠被T7 RNA聚合酶或者RNA聚合酶2系統(tǒng)（CMV啟動子）所拯救，由CMV啟動子在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成的病毒的量是由T7啟動子在體外轉(zhuǎn)錄量的120倍左右。一些派生出的cDNA克隆被建立以便進(jìn)行CSFV的調(diào)查研究。重組

9、的能夠穩(wěn)定表達(dá)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）基因的CSFV病毒能被當(dāng)做一種對病毒復(fù)制和基因表達(dá)情況進(jìn)行定量分析的有效工具?；谶@些改變，Qiu的實(shí)驗(yàn)室研究出了三種相似的重組cDNAs：一是EGFP-CSFV cDNA，它是由CSFV N蛋白的13和14個氨基酸之間插入EGFP基因后生成的用于一種簡單的血清中和試驗(yàn)。然而，對于EGFP的檢測需要大量的、昂貴的自動化圖像處理設(shè)備，并且不能與高效篩選試驗(yàn)（HTS）進(jìn)行有效的結(jié)合。為了解決這一問題，一株能夠穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶（Fluc）的CSFV N-Fluc 病毒被研制，該病毒中熒光素酶基因被插入到N蛋白基因中以便于進(jìn)行快速和定量篩選，并能評價(jià)CSFV抗病

10、毒藥物的效果。另外，一種N蛋白N末端有半胱氨酸短肽標(biāo)簽（TC）（CCPGCC）的cDNA被構(gòu)建，用于對N蛋白進(jìn)出核進(jìn)行可視化的檢測。這些可視化的修飾能被用作標(biāo)記疫苗的候選物，并且有助于我們更進(jìn)一步地研究CSFV。迄今為止許多具有重大意義的發(fā)現(xiàn)都是基于反向遺傳系統(tǒng)的，這些發(fā)現(xiàn)對于研究CSFV的毒力機(jī)制和蛋白的功能建立了較好的基礎(chǔ)。這些結(jié)果有助于我們開發(fā)有效的標(biāo)記疫苗，盡管CSFV的基因組在發(fā)生著突變、重組和其他的一些變化。2.2 CSFV毒力的分子機(jī)制我們可以輕易地通過在與病毒的侵入、釋放、復(fù)制速度、與宿主蛋白相互作用及其他的一些必要的生理過程有關(guān)的保守區(qū)引進(jìn)突變獲得改變了毒力的CSFV。迄今為

11、止，通過我們對CSFV的cDNA進(jìn)行反向遺傳修飾，發(fā)現(xiàn)有7種蛋白（Npro, Core, Erns, E1, E2, P7, NS4B）與病毒的毒力有關(guān)。對N蛋白的敲除能夠降低病毒的毒力，并且能夠誘導(dǎo)SPF豬的免疫反應(yīng)，該結(jié)果提示我們N蛋白在一定程度上與病毒的毒力有關(guān)。核心蛋白的四個保守區(qū)域（I, II, III和IV）能夠與IQGAP蛋白（Rac1和Cdc42的效應(yīng)器）相互作用，核心蛋白I和 III保守區(qū)的插入能夠與宿主細(xì)胞蛋白IQGAP1相互作用，導(dǎo)致病毒毒力的完全喪失。核心蛋白中的氨基酸替換如K11A, K12A 和 K53A能夠擾亂核心蛋白與SUMO-1之間的相互作用，另外，K220A

12、這一替換能夠阻止核心蛋白和UBC9之間的聯(lián)系。所有的這些替換都能夠降低CSFV的毒力。另一種致弱CSFV的方法是在Erns蛋白中插入N2A/Q以破壞其糖基化位點(diǎn)，這表明糖基化反應(yīng)與病毒的毒力有關(guān)。迄今為止，所有被分析的瘟病毒屬成員包括四個分子內(nèi)二硫鍵，它們是由Erns中八個保守的半胱氨酸殘基組成。內(nèi)部的二硫鍵是由第九個半胱氨酸殘基（171Cys）組成，該二硫鍵能夠穩(wěn)定Erns的二聚體結(jié)構(gòu)并且能夠影響病毒的毒力。當(dāng)Erns蛋白中的30His和79His（79AA定位在Rnase T2家族的保守區(qū)）被刪除后也能夠降低CSFV的毒力，原因是降低了Rnase的活性。高致病性毒株Brescia的E1蛋白

13、C末端被插入19個氨基酸后其毒力能夠完全被消除，表明C末端對病毒的毒力維持至關(guān)重要。特別地，高毒力毒株BICv在E1蛋白中的N6A、N19A和N100A發(fā)生替換后，毒株的繁殖能力和毒力都能被降低。當(dāng)Brescia毒株的E2蛋白被替換后也能降低該毒株的毒力，表明E2蛋白是CSFV毒力的主要決定蛋白。CSFV E2蛋白中A區(qū)域的保守表位140-TAVSPTTLR-148對病毒的毒力起著重要作用。E2基因有一個O-連接的糖基化位點(diǎn)和留個N連接的糖基化位點(diǎn)，所有的這些糖基化位點(diǎn)都與病毒毒力有關(guān)，并且對豬體產(chǎn)生保護(hù)性抗體和亞單位疫苗的研制具有重要作用。E2蛋白中710位Leu向His的突變只有伴隨著Er

14、ns蛋白的一些突變?nèi)?76R, 476R, 477I才能夠減弱病毒的毒力。對E2蛋白C末端多個氨基酸的替換也能夠影響CSFV的毒力。P7能夠影響CSFV的毒力、復(fù)制和感染型病毒的組裝。NS4B蛋白中有一個假定的Toll/白介素-1 受體樣區(qū)域，該區(qū)域中有兩個保守盒子區(qū)域（盒子1：195IYKTYLSIRR204；盒子2：228SVGIAVML235），這些保守區(qū)域的突變也能夠影響CSFV的毒力?；谶@些研究發(fā)現(xiàn)，我們推測針對CSFV保守區(qū)進(jìn)行的修飾或改變能夠?qū)е略摬《径玖Φ淖兓?。然而，CSFV的毒力可能還與別的蛋白有關(guān)，如Npro, C, Erns, E2, P7和NS4B。3 CSFV病毒復(fù)

15、制周期和基因組分子結(jié)構(gòu)3.1 病毒復(fù)制周期近幾年在CSFV復(fù)制周期方面有了大量的研究和結(jié)論，當(dāng)然還有很多環(huán)節(jié)是不清楚的。一旦CSFV到達(dá)宿主體內(nèi)的靶細(xì)胞后，就通過E1和E2糖蛋白介導(dǎo)的粘附和侵入過程開始其感染周期，但是細(xì)胞表面受體至今尚未被研究透徹，但是CSFV的受體有可能是CD46，它是BVDV的受體。另外，CSFV的內(nèi)吞機(jī)制也尚未明了（BVDV的侵入依賴于網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用）。病毒侵入后，即開始由依賴pH的糖蛋白介導(dǎo)的膜融合，該過程由酸化作用起始，另外，E2蛋白中的短肽129CPIGWTGVIEC139也可能參與了膜融合過程。病毒囊膜與細(xì)胞膜融合后，病毒核衣殼被釋放到被侵染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)

16、中，此時不依賴于帽子結(jié)構(gòu)的翻譯過程導(dǎo)致多聚蛋白的產(chǎn)生并且病毒基因組的復(fù)制被啟動。CSFV的復(fù)制需要負(fù)鏈RNA的合成，它在合成后代RNA的過程中起著模板的作用，研究發(fā)現(xiàn)NS5B蛋白能夠更有效地與負(fù)鏈RNA的3非編碼區(qū)結(jié)合而不是正鏈RNA的3非編碼區(qū)。NS2-3與輔因子NS4A一起介導(dǎo)病毒粒子的形態(tài)發(fā)生。最終，感染性粒子成熟以后，病毒體從宿主細(xì)胞中被釋放。所有成熟的蛋白（除了N蛋白）和輔因子N2-3對于豬瘟病毒的復(fù)制周期來說是必要的，而NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B對于CSFV RNA的復(fù)制來說是必需的。細(xì)胞被感染后，細(xì)胞內(nèi)的許多生物過程被調(diào)控以加強(qiáng)病毒的復(fù)制并在一定程度上

17、介導(dǎo)免疫逃避。這些過程被核蛋白的類泛素化途徑調(diào)節(jié)，在actin和E2蛋白之間相互作用，NS2作用導(dǎo)致S期阻滯，NS5A刺激自噬，N蛋白和Erns調(diào)控先天性免疫力。3.2 CSFV基因組和蛋白的結(jié)構(gòu)特征Erns蛋白是一個高度糖基化蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量的50%大都由碳水化合物構(gòu)成。Erns以二硫鍵形成同源二聚體，分子質(zhì)量大約為97ku， 并且以兩種形式存在于宿主細(xì)胞中，一種是病毒蛋白，另一種是分泌蛋白。Erns蛋白不僅是一種結(jié)構(gòu)蛋白，而且也是一種多功能性蛋白。它具有神經(jīng)毒性，抗蠕蟲活性以及轉(zhuǎn)導(dǎo)特性， 參與病毒粒子粘附和侵入宿主細(xì)胞的過程，并且能夠通過介導(dǎo)宿主淋巴細(xì)胞的凋亡而使宿主產(chǎn)生免疫抑制導(dǎo)致持續(xù)感

18、染。Erns還具有高度特異的RNA酶活性，在其編碼序列的活性位點(diǎn)區(qū)域中存在有Rh/T2/S RNA酶超家族的同源性序列，在病毒感染早期RNA的合成調(diào)控中發(fā)揮重要作用。另外，F(xiàn)ernandez Sainz1等為了探究Erns糖基化位點(diǎn)對病毒感染力和毒力的影響，對糖基化位點(diǎn)進(jìn)行突變后發(fā)現(xiàn)，將N269用A或Q替換后會降低病毒的復(fù)制能力，毒力減弱，因而此糖基化位點(diǎn)對病毒的致病性具有重要意義。E2蛋白位于病毒粒子的外表面，具有跨膜區(qū)，不僅可與E1形成異源二聚體，還可自身形成同源二聚體。很多研究已經(jīng)證明E2蛋白是豬瘟病毒一個重要的免疫蛋白，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體從而提供保護(hù)性免疫，因此研究人員對E2蛋白

19、的抗原區(qū)結(jié)構(gòu)開展了廣泛研究。E2蛋白含有個相對獨(dú)立的抗原區(qū)，分別為A、B、C和D，而且A又有3個亞區(qū)（A1、A2和A3），其中，中和表位均位于A、B和C區(qū)，而且 A1、B、C還能夠以一種協(xié)同的方式激發(fā)中和反應(yīng)。E2蛋白基因上存在有6個假定的N-糖基化位點(diǎn)和一個 O-糖基化位點(diǎn)，而且對這些糖基化位點(diǎn)進(jìn)行突變后會產(chǎn)生無活力的病毒粒子，單獨(dú)的N-糖基化位點(diǎn)對病毒粒子的形成和毒力并不重要，但是對多個糖基化位點(diǎn)進(jìn)行突變后會影響病毒的毒力和自我保護(hù)能力。Helle F等將疫苗弱毒株E2蛋白N-糖基化位點(diǎn)N1、N2、N4、N6和N11移除后，病毒粒子在與抗體發(fā)生中和反應(yīng)時，表現(xiàn)出高度敏感性，說明這些位點(diǎn)能夠

20、降低中和抗體與E2表位結(jié)合的親和力，因此，N-糖基化位點(diǎn)在維持E2蛋白結(jié)構(gòu)的完整性和增強(qiáng)其抗原性方面都發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用。此外Chang CY等研究發(fā)現(xiàn)，不同毒株之間的抗原特異性取決于B/C區(qū)，此區(qū)位于E2基因N端的90個堿基處，D/A區(qū)在豬瘟病毒不同毒株之間則相對保守，E2基因中692C和737C之間的二硫鍵連接以及序列771LLFD774對病毒的完整性以及 B/C的構(gòu)象識別意義重大。近來，Deng M C等通過抗原模擬試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，E2 基因上還存在一個以前未知的抗原決定區(qū)，即753 RYLASLH-KKALPTSV767，其對表位識別構(gòu)象形成的完整性十分重要，而且這段氨基酸序列在不同毒株間

21、都相對保守，或許是群特異性抗原的組成部分，這使我們對E2基因的抗原性又有了更深層次的了解E1是一類小分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量約為33ku，能夠與E2蛋白形成異二聚體。E1蛋白的二級結(jié)構(gòu)對病毒的復(fù)制，細(xì)胞趨性以及病毒的傳播都很重要，改變E1的二級結(jié)構(gòu)可能會直接影響E1上的毒力決定基團(tuán)，或者影響E1與E2或其他結(jié)構(gòu)蛋白之間的相互作用，從而影響病毒的毒力。對豬瘟病毒的E1蛋白進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)其有3個高度保守的糖基化位點(diǎn)（N500N513N594），并且有2個（N513N594）在 BVDV 型和型也同樣保守，表明這些糖基化位點(diǎn)在瘟病毒屬病毒成員中發(fā)揮著重要的作用。通過對糖基化位點(diǎn)進(jìn)行突變發(fā)現(xiàn)，若3個

22、糖基化位點(diǎn)都進(jìn)行突變后，將無法產(chǎn)生存活的子代病毒粒子，改造除N594之外的任一或兩個糖基化位點(diǎn)后并不影響感染細(xì)胞中病毒粒子的形成和病毒的感染力，但是，如果單獨(dú)改變N594 堿基或包含N594 堿基在內(nèi)的任何2個堿基都會使病毒的毒力減弱，因此對糖基化位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變也是研究弱毒疫苗的新思路C蛋白在多聚蛋白中位于N端蛋白酶Npro和糖蛋白Erns之間，其是一種富含有賴氨酸和精氨酸的小蛋白質(zhì)。成熟的C蛋白含有86個氨基酸，分子質(zhì)量為14ku，N端169Ser 在Npro自身酶活性的調(diào)節(jié)下被切除，緊隨其后的是Erns，由信號肽催化產(chǎn)生N端268Asp，C蛋白是一種調(diào)節(jié)病毒轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)因子，參與病毒復(fù)制中

23、RNA結(jié)構(gòu)重組，RNA組裝以及病毒形態(tài)變化過程，在病毒的復(fù)制中發(fā)揮著重要作用。通過間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）和免疫過氧化酶單層細(xì)胞含量測定（IPMA）分析顯示，CSFV 病毒粒子自身的C蛋白能與在大腸埃希菌中表達(dá)重組C蛋白作為免疫原產(chǎn)生的多克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，說明C 蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性和反應(yīng)原性，將C蛋白切割后發(fā)現(xiàn)，其表面含有一個線性表位，對應(yīng)的氨基酸序列為61 TQDGLYHNKN70，而且此段氨基酸序列在瘟病毒屬成員中高度保守另外進(jìn)行激光共焦分析后還發(fā)現(xiàn)病毒粒子感染 PK-15細(xì)胞后，C蛋白主要位于細(xì)胞核質(zhì)和核仁內(nèi)，但 C蛋白進(jìn)入細(xì)胞核的機(jī)制還沒有確定，或許與核孔復(fù)合體的主動轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，這

24、還有待于進(jìn)一步的研究。對 C蛋白進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)其中含有與莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）M蛋白具有同源性的堿基序列（標(biāo) 記 為、 區(qū)），而且能夠與核內(nèi)蛋白質(zhì)IQGAP1相互結(jié)合，Gladue D P 等為了研究 C 蛋白與IQ-GAP1結(jié)合是否對病毒毒力有影響，對、和區(qū)進(jìn)行堿基替換后，發(fā)現(xiàn)病毒在原代巨噬細(xì)胞上呈現(xiàn)出缺陷生長，體外對和 區(qū)堿基替換后，病毒的毒力完全減弱，這表明 C蛋白與核內(nèi)蛋白質(zhì)IQGAP1的相互作用對病毒的毒力相當(dāng)重要因此，對結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變或許是弱毒疫苗研究的一個新方向Npro 蛋白是豬瘟病毒ORF編碼的第一個蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量為23ku，具有酶活性，能夠在C端自身剪切產(chǎn)生病毒核

25、衣殼蛋白C的N端。在黃病毒科成員中，Npro 蛋白是瘟病毒屬成員中的獨(dú)特蛋白質(zhì)，但其對于病毒的復(fù)制并不是必不可少的將Npro 基因切除或者用小鼠泛素基因替換后，這些豬瘟病毒的突變體在 SK-6 細(xì)胞上的生長特性并沒有發(fā)生太大的改變，但是卻失去了對豬的感染毒力，這似乎表明在病毒進(jìn)化過程，Npro 與病毒的致病性存在密切 聯(lián) 系 Ruggli N等通過研究發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒的Npro蛋白不僅能夠抵抗雙股RNA介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，還能干擾IFN-/的誘導(dǎo)，重要的是，Npro還能夠抑制人細(xì)胞中IFN-和IFN-啟動子的表達(dá)，以及封鎖由新城疫病毒介導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-/，這都為病毒感染機(jī)體提供了幫助NS2蛋白自身具有

26、蛋白酶活性，并且與細(xì)胞內(nèi)的分子伴侶Jiv聯(lián)系密切，能夠裂解NS2-3蛋白對于豬瘟病毒來說，NS2-3的加工過程發(fā)生在病毒感染的各個階段，而且NS2-3以及其裂解產(chǎn)物的比例是動態(tài)變化的，不過通常是NS2-3的比例高于NS2和NS3NS2-3對于豬瘟病毒粒子的形成至關(guān)重要，但是一旦NS2從NS2-3前體蛋白中裂解下來，其本身在病毒生活周期中并沒有其他重要的作用NS3蛋白則含有3種病毒復(fù)制必需的酶活性：位于N末端的絲氨酸酶活性，以及位于C末端的NTP酶活性和解旋酶活性另外，NS3還是一種IRES結(jié)合蛋白，它與IRES結(jié)合后能夠增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄功能，但NS5A和NS5B能夠降低此種促進(jìn)作用。NS4A參與病毒感染粒子的形成過程，它與NS2-3共同發(fā)揮作用，是不可缺少的成分，而且將NS4A單獨(dú)分離出來后其活性不會損失，在病毒RNA復(fù)制過程中發(fā)揮著重要作用NS4B能夠通過調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)發(fā)揮毒力隨后，Gladue DP等在NS4B蛋白中發(fā)現(xiàn)，其堿基序列的209-216和335-342位具有水解ATP和GTP的功能，而且這種NTP酶水解活性對病毒至關(guān)重要，如果將相應(yīng)的堿基部位進(jìn)行突變后，病毒就會失去感染能力或復(fù)制能力受到損傷，不能進(jìn)行病毒復(fù)制，因而可以利用這一特性研究新型抗病毒策略以抵抗豬瘟病毒