第五課 沉淀法生物工程下游技術(shù)

1、 第五章第五章 沉淀法沉淀法生物分離過程的一般流程生物分離過程的一般流程原料液原料液細(xì)胞分離細(xì)胞分離( (離心，過濾離心，過濾) )細(xì)胞胞內(nèi)產(chǎn)物細(xì)胞胞內(nèi)產(chǎn)物路線一路線一路線二路線二細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎碎片分離碎片分離路線一路線一A A路線一路線一B B清液胞外產(chǎn)物清液胞外產(chǎn)物粗分離粗分離( (沉淀沉淀/ /吸附吸附/ /萃取萃取) )純化純化( (層析層析) )脫鹽脫鹽( (凝膠過濾凝膠過濾) )濃縮濃縮( (超濾超濾) )精制精制( (結(jié)晶、干燥結(jié)晶、干燥) )包含體包含體溶解溶解( (加鹽酸胍、脲加鹽酸胍、脲) )復(fù)性復(fù)性沉淀法的目的：沉淀法的目的：(通過沉淀達(dá)到通過沉淀達(dá)到濃縮濃縮的目的的目

2、的, ,從而降低了后續(xù)從而降低了后續(xù)的生產(chǎn)費(fèi)用和簡化了后續(xù)的生產(chǎn)工藝；的生產(chǎn)費(fèi)用和簡化了后續(xù)的生產(chǎn)工藝；(沉淀方法可有選擇地沉淀所需成分或有選沉淀方法可有選擇地沉淀所需成分或有選擇地沉淀雜質(zhì)，起到擇地沉淀雜質(zhì)，起到初步分離初步分離的作用的作用 ；(將蛋白質(zhì)將蛋白質(zhì)由液態(tài)變成固態(tài)由液態(tài)變成固態(tài)，避免了蛋白質(zhì)，避免了蛋白質(zhì)的降解，提高了其穩(wěn)定性；的降解，提高了其穩(wěn)定性；u對于小分子生化物質(zhì)常采用等電點(diǎn)沉淀或形成復(fù)鹽沉淀。 如抗生素生產(chǎn)中，四環(huán)素可用等電點(diǎn)或尿素復(fù)鹽沉淀法，鏈霉素與苯甲胺縮合形成希夫堿沉淀，并在酸性條件下分解以制得成品。u對于大分子生化物質(zhì)常采用鹽析、有機(jī)溶劑、等電點(diǎn)及親和沉淀方法。

3、沉淀法的應(yīng)用沉淀法的分類沉淀法的分類根據(jù)所加入的沉淀劑的不同，沉淀法可以分為：根據(jù)所加入的沉淀劑的不同，沉淀法可以分為：（1 1）鹽析法；）鹽析法；（2 2）等電點(diǎn)沉淀法；）等電點(diǎn)沉淀法；（3 3）有機(jī)溶劑沉淀法；）有機(jī)溶劑沉淀法；（4 4）親和沉淀法；）親和沉淀法；（4 4）非離子型聚合物沉淀法；）非離子型聚合物沉淀法；（5 5）聚電解質(zhì)沉淀法；）聚電解質(zhì)沉淀法；（6 6）復(fù)合鹽沉淀法等；）復(fù)合鹽沉淀法等；（7 7）選擇性沉淀法。）選擇性沉淀法。蛋白質(zhì)的溶解特性蛋白質(zhì)的溶解特性n在水溶液中，多肽鏈中的在水溶液中，多肽鏈中的疏水性氨基酸殘基疏水性氨基酸殘基具有向內(nèi)具有向內(nèi)部折疊的趨勢，即便如此

4、，一般仍有部分疏水性氨基部折疊的趨勢，即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸殘基暴露在外表面，形成疏水區(qū)。酸殘基暴露在外表面，形成疏水區(qū)。n親水性氨基酸殘基親水性氨基酸殘基基本分布在蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的外表基本分布在蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的外表面。面。n蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，因此，蛋白質(zhì)表面由不均勻分蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，因此，蛋白質(zhì)表面由不均勻分布的荷電基團(tuán)形成布的荷電基團(tuán)形成荷電區(qū)荷電區(qū)、親水區(qū)親水區(qū)和和疏水區(qū)疏水區(qū)構(gòu)成。構(gòu)成。蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域和荷電區(qū)域蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域和荷電區(qū)域防止蛋白質(zhì)凝聚沉淀的屏障防止蛋白質(zhì)凝聚沉淀的屏障蛋白質(zhì)周圍的水化層（蛋白質(zhì)周圍的水化層（hydration shel

5、l)hydration shell)，蛋白質(zhì)分子間靜電排斥作用。蛋白質(zhì)分子間靜電排斥作用。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)水化層的厚度水化層的厚度和和電位電位與與溶液性質(zhì)溶液性質(zhì)密切相密切相關(guān)，如溫度、關(guān)，如溫度、pHpH值、介電常數(shù)和離子強(qiáng)度。值、介電常數(shù)和離子強(qiáng)度。鹽析法鹽析法鹽析法原理鹽析法原理（1 1）破壞水化膜，分子間易碰撞聚集）破壞水化膜，分子間易碰撞聚集（2 2）破壞水化膜，暴露出疏水區(qū)域）破壞水化膜，暴露出疏水區(qū)域（3 3）中和電荷，減少靜電斥力）中和電荷，減少靜電斥力 S=- S=-s sS S蛋白質(zhì)的溶解度，蛋白質(zhì)的溶解度，g/L; g/L; I I離子強(qiáng)度，離子強(qiáng)度， I=1/2mI=1/2

6、mi iz zi i2 2 m mi i離子離子 i i的摩爾濃度；的摩爾濃度；ZiZi所帶電荷所帶電荷常數(shù)，常數(shù)，圖中截距圖中截距KsKs鹽析常數(shù)，鹽析常數(shù)，圖中直線斜率圖中直線斜率CohnCohn經(jīng)驗(yàn)式經(jīng)驗(yàn)式蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度的關(guān)系蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度的關(guān)系鹽析操作1 1）加入固體鹽法）加入固體鹽法 用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況，工業(yè)上常采用這種方法。況，工業(yè)上常采用這種方法。2 2）加入飽和溶液法）加入飽和溶液法 用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大的情況。的情況。3 3）透析平衡法）透析平衡法 先將

7、鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸銨中進(jìn)行透析，袋內(nèi)飽和度逐漸提高，達(dá)到設(shè)定濃度后，硫酸銨中進(jìn)行透析，袋內(nèi)飽和度逐漸提高，達(dá)到設(shè)定濃度后，目的蛋白析出。該法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性并且緩目的蛋白析出。該法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性并且緩慢，鹽析效果好，故多用于結(jié)晶。慢，鹽析效果好，故多用于結(jié)晶。例如：例如：鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉 硫酸銨是最常用的蛋白質(zhì)鹽析沉淀劑。硫酸銨是最常用的蛋白質(zhì)鹽析沉淀劑。鹽析用鹽的選擇鹽析用鹽的選擇一般的規(guī)律為：半徑小的高價(jià)陰離子的鹽析作用較強(qiáng)

8、。一般的規(guī)律為：半徑小的高價(jià)陰離子的鹽析作用較強(qiáng)。例如：例如：陰離子鹽析效果陰離子鹽析效果 ：檸檬酸檸檬酸POPO4 43- 3- SOSO4 42-2- CHCH3 3COOCOO- - ClCl- - NONO3 3- -SCNSCN- -陽離子鹽析效果：陽離子鹽析效果：NHNH4 4+ + K K+ +NaNa+ + Mg2+ 陰離子對蛋白質(zhì)溶解度的影響大于陽離子。陰離子對蛋白質(zhì)溶解度的影響大于陽離子。1 1、鹽濃度鹽濃度）鹽濃度）鹽濃度u在進(jìn)行分離的時候，一般從低離子強(qiáng)度到高離子在進(jìn)行分離的時候，一般從低離子強(qiáng)度到高離子強(qiáng)度順次進(jìn)行。強(qiáng)度順次進(jìn)行。 每一組分被鹽析出來后，經(jīng)過過濾或冷凍

9、離心收每一組分被鹽析出來后，經(jīng)過過濾或冷凍離心收集，再在溶液中逐漸提高中性鹽的飽和度，使另集，再在溶液中逐漸提高中性鹽的飽和度，使另一種蛋白質(zhì)組分鹽析出來。一種蛋白質(zhì)組分鹽析出來。 影響鹽析效果的因素影響鹽析效果的因素鹽析用鹽量的確定鹽析用鹽量的確定- -飽和度：飽和度：u目標(biāo)蛋白質(zhì)在鹽析沉淀操作之前，所需的中性目標(biāo)蛋白質(zhì)在鹽析沉淀操作之前，所需的中性鹽的濃度可通過實(shí)驗(yàn)確定。鹽的濃度可通過實(shí)驗(yàn)確定。u對多數(shù)蛋白質(zhì)，當(dāng)達(dá)到對多數(shù)蛋白質(zhì)，當(dāng)達(dá)到85%85%飽和度時，溶解度飽和度時，溶解度都小于都小于 0.l mg0.l mgL L，通常為兼顧收率與純度，通常為兼顧收率與純度，飽和度的操作范圍在飽和

10、度的操作范圍在40%-60%40%-60%之間。之間。分段鹽析(fractional salting out)硫酸銨的硫酸銨的飽 和 度飽 和 度/%沉 淀 的沉 淀 的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)硫酸銨的硫酸銨的飽 和 度飽 和 度/%沉淀的蛋沉淀的蛋白質(zhì)白質(zhì)20纖 維 蛋纖 維 蛋白質(zhì)白質(zhì)50白蛋白白蛋白2833優(yōu) 球 蛋優(yōu) 球 蛋白白80肌紅蛋白肌紅蛋白3350擬 球 蛋擬 球 蛋白白l可在較低飽和度下先除去可在較低飽和度下先除去雜蛋白，然后在較高的飽雜蛋白，然后在較高的飽和度下，沉淀目標(biāo)蛋白質(zhì)，和度下，沉淀目標(biāo)蛋白質(zhì)，稱為稱為分段鹽析。分段鹽析。l分段鹽析時，可選擇分段鹽析時，可選擇稀一稀一些些的蛋白

11、質(zhì)溶液，使的蛋白質(zhì)溶液，使共沉共沉淀作用減至最低限度。淀作用減至最低限度。表表1 1 血漿蛋白的分段鹽析結(jié)果血漿蛋白的分段鹽析結(jié)果2 2、蛋白質(zhì)種類和濃度、蛋白質(zhì)種類和濃度n組成相近的蛋白質(zhì)，組成相近的蛋白質(zhì)，分子量越大分子量越大，沉淀所需鹽的量越少；蛋，沉淀所需鹽的量越少；蛋白質(zhì)分子白質(zhì)分子不對稱性越大不對稱性越大，也越易沉淀。，也越易沉淀。n不不同濃度的同種蛋白質(zhì)溶液要產(chǎn)生沉淀所要求的臨界鹽濃度同濃度的同種蛋白質(zhì)溶液要產(chǎn)生沉淀所要求的臨界鹽濃度不同。不同。蛋白質(zhì)濃度大時，用鹽少，沉蛋白質(zhì)濃度大時，用鹽少，沉淀淀作用強(qiáng)，蛋白質(zhì)溶解作用強(qiáng)，蛋白質(zhì)溶解損失小損失小。 一般常將蛋白質(zhì)的含量控制在一

12、般常將蛋白質(zhì)的含量控制在2 23%3%為宜。為宜。影響鹽析效果的因素影響鹽析效果的因素u對起始濃度為對起始濃度為 30g/L30g/L的碳氧肌紅蛋白溶液，目標(biāo)蛋白的碳氧肌紅蛋白溶液，目標(biāo)蛋白在硫酸銨飽和度為在硫酸銨飽和度為 58-6558-65之間沉淀出來；之間沉淀出來；u當(dāng)稀釋當(dāng)稀釋1010倍時，飽和度達(dá)到倍時，飽和度達(dá)到66%66%時才開始沉淀，而相應(yīng)時才開始沉淀，而相應(yīng)的沉淀范圍為的沉淀范圍為66-73%66-73%飽和度。飽和度。硫酸銨鹽析過程目標(biāo)蛋白的最適飽和度是多少？204060800100總蛋白總蛋白目標(biāo)蛋白質(zhì)目標(biāo)蛋白質(zhì)上清液蛋白濃度上清液蛋白濃度3 3、pHpH值值u為提高鹽析

13、效率，多將溶液為提高鹽析效率，多將溶液pHpH值調(diào)到目標(biāo)蛋白的等值調(diào)到目標(biāo)蛋白的等電點(diǎn)處。電點(diǎn)處。 u在水中或稀鹽液中的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)與高鹽濃度下所在水中或稀鹽液中的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)與高鹽濃度下所測的結(jié)果是不同的，需根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整溶液測的結(jié)果是不同的，需根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整溶液pHpH值，值，以達(dá)到最好的鹽析效果。以達(dá)到最好的鹽析效果。影響鹽析效果的因素影響鹽析效果的因素在進(jìn)行鹽折時，必在進(jìn)行鹽折時，必須控制須控制pHpH圖中直線都相互平圖中直線都相互平行行pH值鹽析影響因素：4、溫度的影響u在高鹽濃度下，大部分蛋白質(zhì)在高鹽濃度下，大部分蛋白質(zhì)的溶解度隨的溶解度隨溫度上升而下降溫度上升而下降。u在一般

14、情況下，鹽析可在室溫在一般情況下，鹽析可在室溫下進(jìn)行，只有某些對溫度比較下進(jìn)行，只有某些對溫度比較敏感的酶要求在敏感的酶要求在0-40-4進(jìn)行。進(jìn)行。鹽析法特點(diǎn)鹽析法特點(diǎn)n成本低，操作簡單、安全；成本低，操作簡單、安全；n在中性溫和的環(huán)境中，不會引起蛋白質(zhì)變性；在中性溫和的環(huán)境中，不會引起蛋白質(zhì)變性；n鹽析后要透析或超濾去鹽；鹽析后要透析或超濾去鹽；n只是作為初步的分離純化，還需要結(jié)合其它的只是作為初步的分離純化，還需要結(jié)合其它的純化方法。純化方法。等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀：等電點(diǎn)沉淀：在低離子在低離子強(qiáng)度下，調(diào)強(qiáng)度下，調(diào)pHpH至等電點(diǎn)，至等電點(diǎn)，使蛋白質(zhì)所帶凈電荷為使蛋白質(zhì)所帶凈

15、電荷為零，零，降低了靜電斥力，降低了靜電斥力，而疏水力能使分子間相而疏水力能使分子間相互吸引，互吸引，形成沉淀。形成沉淀。pH=pI等電點(diǎn)沉淀法注意事項(xiàng)等電點(diǎn)沉淀法注意事項(xiàng)F本法適用于本法適用于疏水性較強(qiáng)疏水性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)；的蛋白質(zhì)； 例如：酪蛋白在等電點(diǎn)時能形成粗大的凝聚物。但對一些親水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)。如明膠，則在低離子強(qiáng)度的溶液中，調(diào) pH在等電點(diǎn)并不產(chǎn)生沉淀。F蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)易受鹽離子等電點(diǎn)易受鹽離子的影響發(fā)生變的影響發(fā)生變化化； 自然界中，蛋白質(zhì)較易結(jié)合陰離子，使等電點(diǎn)向酸側(cè)移動。 低離子強(qiáng)度下，pH約等于等電點(diǎn)。 F在調(diào)節(jié)等電點(diǎn)時在調(diào)節(jié)等電點(diǎn)時，要注意防止酶的失活要注意防止酶的

16、失活或蛋白變性或蛋白變性。一般使用可用乙酸、碳酸。一般使用可用乙酸、碳酸等弱酸和碳酸鈉等弱堿。等弱酸和碳酸鈉等弱堿。F蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近鹽溶作用明顯蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近鹽溶作用明顯，必必須控制溶液須控制溶液較高的較高的離子強(qiáng)度。離子強(qiáng)度。F等電點(diǎn)沉淀法往往不能獲得高的回收率，等電點(diǎn)沉淀法往往不能獲得高的回收率，通常與其他沉淀方法結(jié)合使用；通常與其他沉淀方法結(jié)合使用；1 1）分辨能力比鹽析法高；）分辨能力比鹽析法高；2 2）沉淀不用脫鹽；）沉淀不用脫鹽；3 3）離心收集較為容易；）離心收集較為容易；4 4）溶劑沸點(diǎn)較低，除去回溶劑沸點(diǎn)較低，除去回收方便收方便。1 1）容易引起變性失活；）容易引起變

17、性失活；2 2）操作要求在低溫）操作要求在低溫下進(jìn)行；下進(jìn)行；3 3）有機(jī)溶劑易揮發(fā)，需有防護(hù)。）有機(jī)溶劑易揮發(fā)，需有防護(hù)。 有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法機(jī)理有機(jī)溶劑沉淀法機(jī)理有機(jī)溶劑沉淀法原理有機(jī)溶劑沉淀法原理 A 降低溶劑介電常數(shù)降低溶劑介電常數(shù)B 破壞水化膜破壞水化膜C 相反力相反力表表2 一些有機(jī)溶劑的介電常數(shù)一些有機(jī)溶劑的介電常數(shù)溶劑溶劑介電常數(shù)介電常數(shù)溶劑溶劑介電常數(shù)介電常數(shù)水水802.5M尿素尿素8420%乙醇乙醇705M尿素尿素9140%乙醇乙醇60丙酮丙酮2260%乙醇乙醇48甲醇甲醇33100%乙醇乙醇24丙醇丙醇232.5M 甘氨酸甘氨酸137(水溶性要好水

18、溶性要好(介電常數(shù)要小介電常數(shù)要小(致變性作用要小致變性作用要小(毒性要小、揮發(fā)性適中毒性要小、揮發(fā)性適中(容易獲取容易獲取常用的有機(jī)溶劑：乙醇、甲醇和丙酮常用的有機(jī)溶劑：乙醇、甲醇和丙酮 1 1、溫度、溫度使用有機(jī)溶劑沉淀時，操作必須在低溫下進(jìn)行，使用有機(jī)溶劑沉淀時，操作必須在低溫下進(jìn)行，u有機(jī)溶劑要有機(jī)溶劑要預(yù)冷預(yù)冷，并，并緩緩加入伴隨緩緩加入伴隨不斷攪拌不斷攪拌，一是防止溶液，一是防止溶液局部升溫，二是局部升溫，二是為了防止局部過濃引起變性作用和分辨率下為了防止局部過濃引起變性作用和分辨率下降降。u溫度還會影響有機(jī)溶劑對蛋白質(zhì)的沉淀能力。溫度還會影響有機(jī)溶劑對蛋白質(zhì)的沉淀能力。 大多數(shù)蛋

19、白質(zhì)大多數(shù)蛋白質(zhì)在乙醇在乙醇- -水體系中溶解度隨溫度降低而減少水體系中溶解度隨溫度降低而減少，低溫對提高收率也是有利的。低溫對提高收率也是有利的。有機(jī)溶劑沉淀法的影響因素有機(jī)溶劑沉淀法的影響因素 2 2、pHpH值：值： 許多蛋白質(zhì)在許多蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近等電點(diǎn)附近有較好的沉淀效果。有較好的沉淀效果。 3 3、樣品濃度：、樣品濃度：樣品較稀時，將增加有機(jī)溶劑投入量，樣品較稀時，將增加有機(jī)溶劑投入量，降低了降低了樣品的樣品的回收率回收率；樣品太濃，會增加共沉作用。；樣品太濃，會增加共沉作用。 一般認(rèn)為蛋白質(zhì)的初濃度以一般認(rèn)為蛋白質(zhì)的初濃度以0.50.52 2為好，粘多糖則以為好，粘多糖則以1

20、12 2較合適。較合適。4 4、中性鹽濃度：、中性鹽濃度：較低濃度的中性鹽較低濃度的中性鹽存在有利于沉淀作用，減存在有利于沉淀作用，減少蛋白質(zhì)變性。少蛋白質(zhì)變性。 一般中性鹽濃度以一般中性鹽濃度以0.010.010.05mol/L0.05mol/L為好，常用的中性鹽為氯為好，常用的中性鹽為氯化鈉等?；c等。 有機(jī)溶劑沉淀法的影響因素有機(jī)溶劑沉淀法的影響因素例：例： 調(diào)調(diào)pH4.2 上清液上清液胰島素粗品溶液胰島素粗品溶液 30 % 丙酮丙酮 沉淀（雜蛋白）沉淀（雜蛋白）上清液調(diào)上清液調(diào)pH6.0 上清液上清液 Zn2+ 胰島素鋅鹽胰島素鋅鹽 舉例：固體發(fā)酵生產(chǎn)舉例：固體發(fā)酵生產(chǎn)-淀粉酶的提取工

21、藝研究淀粉酶的提取工藝研究 -淀粉酶（米曲霉）菌體淀粉酶（米曲霉）菌體 + 水水 過濾過濾 水抽提清液水抽提清液 加乙醇（加乙醇（70%）攪拌）攪拌 -淀粉酶淀粉酶 * pH影響影響 收率收率 酶活酶活 6.5 pH * 適宜的適宜的pH 5.6 6.0 * 溫度影響溫度影響 酶活酶活 收率收率 10 20 T * 適宜的溫度適宜的溫度10 20 水溶性非離子型聚合物水溶性非離子型聚合物機(jī)理：機(jī)理：與有機(jī)溶劑相似，破壞蛋白質(zhì)的水化膜。與有機(jī)溶劑相似，破壞蛋白質(zhì)的水化膜。常用非離子性聚合物：常用非離子性聚合物： 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）：是一種水溶性的高分子聚合物，分子量：是一種水溶性

22、的高分子聚合物，分子量 4,000 4,000 以上的以上的 PEG PEG 可以用來沉淀蛋白質(zhì)。可以用來沉淀蛋白質(zhì)。 還有葡聚糖、右旋糖酐硫酸酯等。還有葡聚糖、右旋糖酐硫酸酯等。優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)缺點(diǎn)：1. 1. 可在室溫下進(jìn)行可在室溫下進(jìn)行2. 2. 沉淀顆粒大，易于收集沉淀顆粒大，易于收集 3. 3. 能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)4. PEG 4. PEG 難去除難去除用聚乙二醇等非離子性聚合物一般用來沉淀核酸（如質(zhì)粒）用聚乙二醇等非離子性聚合物一般用來沉淀核酸（如質(zhì)粒）和酶。和酶。多聚電解質(zhì)沉淀 機(jī)理：架橋與靜電，與絮凝劑類似。n離子型多糖聚合物，酸性多糖、羧甲基纖維素、海藻酸鈉。n合成的離子

23、聚合物：n聚丙烯酸n聚苯乙烯季胺鹽n聚甲基丙烯酸n聚乙烯亞胺此類沉析劑有以下三種：此類沉析劑有以下三種：（1）高價(jià)金屬鹽：高價(jià)金屬鹽：Cu2+，Ag2+，Zn2+，Ca2+與酸性基團(tuán)結(jié)合；與酸性基團(tuán)結(jié)合；（2）苦味酸鹽、單寧酸鹽、鞣質(zhì)等苦味酸鹽、單寧酸鹽、鞣質(zhì)等，與堿性基與堿性基 團(tuán)結(jié)合團(tuán)結(jié)合；（3）無機(jī)復(fù)合鹽：無機(jī)復(fù)合鹽：磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽等磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽等優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：以上鹽類復(fù)合物的溶解度很低，極容易沉淀析出。以上鹽類復(fù)合物的溶解度很低，極容易沉淀析出。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：容易導(dǎo)致活性蛋白的不可逆變性，容易導(dǎo)致活性蛋白的不可逆變性，需采用較溫和的條件。需采用較溫和的條件。） 金屬離子沉淀金屬離

24、子沉淀n金屬離子的沉淀作用是由于它們能與蛋白質(zhì)分子金屬離子的沉淀作用是由于它們能與蛋白質(zhì)分子中的特殊部位（如羧基、氨基、咪唑基和巰基）中的特殊部位（如羧基、氨基、咪唑基和巰基）起反應(yīng)造成的。起反應(yīng)造成的。 例如例如Zn2+Zn2+易與組氨酸殘基中咪唑基結(jié)合，從而降易與組氨酸殘基中咪唑基結(jié)合，從而降低蛋白質(zhì)的溶解度。低蛋白質(zhì)的溶解度。n能與羧基、胺基等含氮化合物以及含氮雜環(huán)化合物強(qiáng)烈能與羧基、胺基等含氮化合物以及含氮雜環(huán)化合物強(qiáng)烈結(jié)合的一些金屬離子，如：結(jié)合的一些金屬離子，如：MnMn2+2+、 FeFe2+ 2+ 、 o o2+2+、 NiNi2+ 2+ 、 u u2+2+、 ZnZn2+ 2

25、+ 、 CdCd2+ 2+ ; ;n能與羧酸結(jié)合而不與含氮化合物結(jié)合的一些金屬離子，能與羧酸結(jié)合而不與含氮化合物結(jié)合的一些金屬離子，如：如：CaCa2+2+ 、 BaBa2+2+、 MgMg2+2+ 、 PbPb2+ 2+ ; ;n能巰基化合物強(qiáng)烈結(jié)合的一些金屬離子，如：能巰基化合物強(qiáng)烈結(jié)合的一些金屬離子，如：g g2+ 2+ 、 AgAg2+ 2+ 、 PbPb2+ 2+ 。選擇性變性沉淀法選擇性變性沉淀法 選擇性變性沉淀法：選擇性變性沉淀法：選擇一定的條件使溶液中選擇一定的條件使溶液中存在的存在的某些雜質(zhì)變性沉淀某些雜質(zhì)變性沉淀下來，而與目的物分下來，而與目的物分開。開。例如：例如：n在核

26、酸提取液中加入氯仿在核酸提取液中加入氯仿- -戊醇或氯仿戊醇或氯仿- -辛醇，振蕩一辛醇，振蕩一段時間、使蛋白質(zhì)在氯仿段時間、使蛋白質(zhì)在氯仿- -水的界面上形成沉淀而被除水的界面上形成沉淀而被除去，核酸仍然留在水溶液中。去，核酸仍然留在水溶液中。n在對氨基水楊酸等陰離子化合物存在下，用苯酚在對氨基水楊酸等陰離子化合物存在下，用苯酚- -水溶水溶液提取核酸，而蛋白質(zhì)在苯酚層中形成沉淀而被除去。液提取核酸，而蛋白質(zhì)在苯酚層中形成沉淀而被除去。沉淀劑：沉淀劑：三氯乙酸三氯乙酸例如用例如用2.5%2.5%三氯乙酸處理胰蛋白酶、抑肽三氯乙酸處理胰蛋白酶、抑肽酶或細(xì)胞色素酶或細(xì)胞色素c c粗提取液，均可除

27、去大量雜粗提取液，均可除去大量雜蛋白，而對所提取的酶活力沒有影響。蛋白，而對所提取的酶活力沒有影響。但使用前，必須對酶的酸堿穩(wěn)定性有足夠但使用前，必須對酶的酸堿穩(wěn)定性有足夠了解，使用時一般應(yīng)注意環(huán)境條件溫了解，使用時一般應(yīng)注意環(huán)境條件溫和（如低溫段時間）和（如低溫段時間）分離蛋白質(zhì)分離蛋白質(zhì)各種沉淀方法應(yīng)用范圍各種沉淀方法應(yīng)用范圍n鹽析法：鹽析法：多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化。多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化。n有機(jī)溶劑沉淀法：有機(jī)溶劑沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸多用于生物小分子、多糖及核酸產(chǎn)品的分離純化，有時也用于蛋白質(zhì)沉淀。產(chǎn)品的分離純化，有時也用于蛋白質(zhì)沉淀。n等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)

28、沉淀法：用于氨基酸、蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)的用于氨基酸、蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)的沉淀。但單獨(dú)應(yīng)用較少，多與其它方法結(jié)合使用。沉淀。但單獨(dú)應(yīng)用較少，多與其它方法結(jié)合使用。n非離子聚合物沉淀法：非離子聚合物沉淀法：用于分離生物大分子。用于分離生物大分子。n生成鹽類復(fù)合物沉淀：生成鹽類復(fù)合物沉淀：多用于小分子物質(zhì)的沉淀。多用于小分子物質(zhì)的沉淀。n選擇性沉淀選擇性沉淀：多用于除去某些不耐熱的和在一定條：多用于除去某些不耐熱的和在一定條件下易變性的雜蛋白。件下易變性的雜蛋白。親和沉淀親和沉淀affinity precipitation 原理：原理：是一種將生物專一性識別與沉淀分離相結(jié)合的分離純化技術(shù)。 可逆性溶解聚

29、合物在溶液中和目標(biāo)分子專一性結(jié)合后，在一定條件下形成可逆性沉淀，從而使目標(biāo)分子形成沉淀從固相分離出來?？赡嫘钥赡嫘匀芙馊芙饩酆衔锞酆衔铮╯oluble and insoluble polymers，SIS）uSIS上的功能基團(tuán)上的功能基團(tuán)可以可以直接和蛋白質(zhì)結(jié)合直接和蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)生親和沉發(fā)生親和沉淀，有時也需要將淀，有時也需要將親和配基結(jié)合在親和配基結(jié)合在SIS上。上。u在物理?xiàng)l件（如在物理?xiàng)l件（如pH值、離子強(qiáng)度、溫度等）改變時值、離子強(qiáng)度、溫度等）改變時，待分離的待分離的生物分子和生物分子和SIS發(fā)生可逆性沉淀。發(fā)生可逆性沉淀。SIS的種類的種類upH值敏感型值敏感型SIS： 聚合物聚合物

30、的溶解性與自身所的溶解性與自身所帶電荷多少相關(guān)帶電荷多少相關(guān)，當(dāng)它的凈電荷減少時，自身，當(dāng)它的凈電荷減少時，自身溶解度降低而沉淀溶解度降低而沉淀。n天然可逆性聚合物：天然可逆性聚合物：脫乙酰殼聚糖（脫乙酰殼聚糖（pH6pH6時時可溶可溶）、藻酸鹽；）、藻酸鹽；n合成可逆性聚合物：合成可逆性聚合物：甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的聚合物（甲酯的聚合物（Eudragit S-100Eudragit S-100在在4.5pH5.54.5pH0.17M0.17M時，快速完全沉淀。時，快速完全沉淀。發(fā)生發(fā)生親和沉淀的配基親和沉淀的配基u生物專一性配基（如輔酶、蛋白質(zhì)生物專一性配基（如輔

31、酶、蛋白質(zhì)A、IgG）；）；u非專一性親和配基（如染料非專一性親和配基（如染料、金屬離金屬離子）子）?；瘜W(xué)名稱化學(xué)名稱簡稱或商業(yè)名稱簡稱或商業(yè)名稱溶解性溶解性可溶可溶不可溶不可溶天然聚合物及衍生物天然聚合物及衍生物羥丙基羥丙基- -甲基纖維素乙酰甲基纖維素乙酰琥珀酸琥珀酸AS-HAS-HpH5.5pH5.5pH4.8pH4.8AS-MAS-MpH5pH5pH4.5pH4.5AS-LAS-LpH4.5pH4.5pH4pH4纖維素乙酰纖維素乙酰- -酞酸酞酸CAPCAPpH5pH5羥丙基羥丙基- -甲基纖維素甲基纖維素- -酞酞酸酸HP-50HP-50pH4.5pH4.5pH3pH3HP-55HP-55pH4.7pH4.7pH3.8pH3.8褐藻酸褐藻酸pH4pH4pH3pH3 s1s1- -酪蛋白酪蛋白5mM CaCl5mM CaCl2 2脫乙酰幾丁質(zhì)脫乙酰幾丁質(zhì)pH8.5pH8.5蛋白類彈性聚合物蛋白類彈性聚合物263737度度合成聚合物合成聚合物甲基丙烯酸和甲基丙烯甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯酸甲酯Eudragit S100Eudragit S100pH5.5pH5.5pH4.5pH4.5異丁烯酸異丁烯酸- -異丁烯甲酸甲異丁烯甲酸甲酯共聚物酯共聚物Eudragit SEudragit SpH5.5pH5