大學(xué)生基本培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌

1、 1、培養(yǎng)基、培養(yǎng)基(culture medium)：培養(yǎng)基是按照微生物生長繁殖所需要的各種營養(yǎng)物質(zhì)，用人工的方法配制而成的一種基質(zhì)。u 培養(yǎng)基的種類：根據(jù)培養(yǎng)基的成分可分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基；按物理性狀不同，可分為固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基；根據(jù)培養(yǎng)基的特殊用途可分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。 天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基：主要成分是天然有機(jī)物質(zhì)，如馬鈴薯、玉米粉、豆餅粉、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨、血清等，其成分未完全了解，且各批次不均一。適用于生產(chǎn)上大規(guī)模培養(yǎng)微生物。 合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基：成分明確的化學(xué)藥品配制而成的培養(yǎng)基。如：高氏一號培養(yǎng)基、

2、查氏培養(yǎng)基等。一般適用于在實驗室范圍內(nèi)研究微生物的形態(tài)、營養(yǎng)代謝、分類鑒定、生物測定、菌種選育和遺傳分析等工作。 半合成培養(yǎng)基：半合成培養(yǎng)基：在天然有機(jī)物的基礎(chǔ)上，適當(dāng)補(bǔ)充一些成分已知的化學(xué)藥品所配制的培養(yǎng)基。具有廣泛的應(yīng)用，如馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，適合很多霉菌的生長。 液體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基：配好后成為液體狀態(tài)的培養(yǎng)基。如糖發(fā)酵液體培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基等。廣泛用于理論研究和大規(guī)模的工業(yè)發(fā)酵。 固體培養(yǎng)基：固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑形成的固態(tài)培養(yǎng)基。常用凝固劑有瓊脂、明膠、硅膠。硅膠用于配制自養(yǎng)微生物的固體培養(yǎng)基；對于其他多數(shù)微生物來講，瓊脂最為合適，一般加入1.5-2.5%，如牛肉

3、膏蛋白胨培養(yǎng)基等。此培養(yǎng)基可供微生物的分離、鑒定、菌種保藏等。 半固體培養(yǎng)基：半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入少量凝固劑即配成為半固體培養(yǎng)基，如，加入0.2-0.7%瓊脂作為凝固劑。用來觀察細(xì)菌運(yùn)動特征、鑒定菌種、菌種保藏和噬菌體的效價滴定等。 根據(jù)培養(yǎng)基的特殊用途分類根據(jù)培養(yǎng)基的特殊用途分類： 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基：含有一般細(xì)菌生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質(zhì)，常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，也是作為某些特殊培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分。 加富培養(yǎng)基：加富培養(yǎng)基：是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入血、血清、動物組織提取液或植物組織提取液，主要用于培養(yǎng)某些對營養(yǎng)要求較為苛刻的微生物。 選擇培養(yǎng)基：選擇培養(yǎng)基：根據(jù)某一

4、種或某一類微生物的特殊營養(yǎng)要求或?qū)σ恍┪锢?、化學(xué)條件的抗性而設(shè)計的培養(yǎng)基。 根據(jù)某些微生物對碳、氮源的特殊要求來設(shè)計選擇性培養(yǎng)基，可以分離到能分解某些物質(zhì)的微生物。 在培養(yǎng)基中加入某些化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長繁殖。如在分離放線菌時，在培養(yǎng)基中添加10%的酚數(shù)滴可抑制細(xì)菌和霉菌的生長。 鑒別培養(yǎng)基：鑒別培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某種化合物或化學(xué)試劑，使培養(yǎng)的微生物產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物與該化合物或化學(xué)試劑發(fā)生明顯的特征性反應(yīng)，根據(jù)這一特征性反應(yīng)可以將此種微生物與其他種微生物區(qū)別開來，如伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基 。 2、滅菌：、滅菌： 消毒與滅菌是兩個不同的概念。 消毒：一般是指消滅病原菌和有害微生物

5、的營養(yǎng)體而言，而不能殺死全部芽孢，因此，消毒對微生物的殺滅是不徹底的，而且往往只能作用到物體表面，只能作為一般的衛(wèi)生措施。如使用酒精、84消毒液浸泡或煮沸法對器械的表面消毒處理，用紫外燈對房間進(jìn)行照射等。 滅菌：殺滅一切微生物的營養(yǎng)體、芽孢和孢子，因此，滅菌后的物品不再帶有活體微生物。滅菌的方法很多，如加熱(干熱或濕熱)、過濾等。 干熱法滅菌：干熱法滅菌： a) 火焰燒灼：火焰燒灼：適用于接種環(huán)、接種針、鑷子等金屬用具，無菌操作時的試管口和瓶口也在火焰上短暫燒灼滅菌。 b) 熱空氣滅菌：熱空氣滅菌：使用電熱干燥箱，借助熱空氣在160-1700C下保溫2小時進(jìn)行滅菌，此法適用于玻璃器皿（如吸管和

6、培養(yǎng)皿）等的滅菌，對帶膠皮的器物或培養(yǎng)基不適用。 濕熱滅菌：濕熱滅菌： a) 高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌 高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.30C保持1530分鐘進(jìn)行滅菌。這種滅菌適用于培養(yǎng)基等的滅菌。 b) 間歇滅菌法間歇滅菌法 少數(shù)培養(yǎng)基，例如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基、含糖培養(yǎng)基等，高溫高壓滅菌易被破壞，適用間歇滅菌法。此法是用阿諾氏流動蒸汽滅菌器進(jìn)行滅菌，將滅菌培養(yǎng)基放入滅菌器內(nèi)，每天加熱1000C，30分鐘，連續(xù)3天，第一天加熱后，其中的營養(yǎng)體被殺死，將培養(yǎng)物去出放室溫下18-24小時，使其中的芽孢發(fā)育成營養(yǎng)體，第二天再加熱1000C，30分鐘，發(fā)育的營養(yǎng)體又

7、被殺死，但可能仍有芽孢，故再重復(fù)一次，使徹底滅菌。 三、材料：三、材料： 1、藥品、藥品：NaCl 蛋白胨 牛肉膏 可溶性淀粉 K2HPO4 HCl NaOH 瓊脂 葡萄糖 蔗糖 Na2SO4 黃豆芽 馬鈴薯 伊紅 美藍(lán)等。 2、器材：、器材：臺秤 三角瓶 試管 漏斗 電爐 搪瓷杯（鋁鍋） 試管架 玻棒 滴管 稱量紙 pH試紙 棉花 紗布 牛皮紙 棉線 滅菌鍋 干燥箱等。 四、方法及步驟：四、方法及步驟： 1、培養(yǎng)基的配制一般可分為稱量、溶化、培養(yǎng)基的配制一般可分為稱量、溶化、pH調(diào)節(jié)、過濾和分裝等步驟調(diào)節(jié)、過濾和分裝等步驟 稱量：稱量：按照培養(yǎng)基配方，稱取各種成分； 溶化：溶化：在容器中先加

8、入所需蒸餾水水量的一部分，依次將各成分加入，使全部溶解，最后補(bǔ)足水量。若用蛋白胨、牛肉膏等物質(zhì)配制培養(yǎng)基時，需加熱溶解，并補(bǔ)足水分。配制固體培養(yǎng)基時，先將上述配好的液體培養(yǎng)基加熱到快沸時，再將稱好的瓊脂加入，繼續(xù)加熱到瓊脂完全熔化，在加熱過程中要不斷攪拌，以免瓊脂糊底，并控制火力，防止沸騰外溢。 矯正矯正pH值：值：初配制好的培養(yǎng)基，往往不能符合所需求的pH值，故必須矯正，用精密pH試紙，以1N HCl或1N NaOH調(diào)節(jié)至所需要的pH值。 過濾：過濾：用濾紙、棉花或雙層紗布過濾。 分裝：分裝：將制成的培養(yǎng)基分裝于三角瓶或試管內(nèi)。馬鈴薯糖瓊脂培養(yǎng)基馬鈴薯糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA) 成分：成分：馬鈴

9、薯馬鈴薯 200g 蔗糖蔗糖 20g 瓊脂瓊脂 25g 水水 補(bǔ)足補(bǔ)足1000ml 方法：方法：將馬鈴薯洗凈去皮切塊，放入搪瓷杯中，摻適量將馬鈴薯洗凈去皮切塊，放入搪瓷杯中，摻適量水加熱煮沸水加熱煮沸30分鐘（注意不時用玻棒攪拌，避免糊底），用分鐘（注意不時用玻棒攪拌，避免糊底），用雙層紗布濾去薯塊，在薯汁中加入瓊脂，加熱熔化，再加入雙層紗布濾去薯塊，在薯汁中加入瓊脂，加熱熔化，再加入葡萄糖，完全溶化后，用水補(bǔ)足體積，趁熱分裝到三角瓶中，葡萄糖，完全溶化后，用水補(bǔ)足體積，趁熱分裝到三角瓶中，121滅菌滅菌20 min。 注：無須調(diào)注：無須調(diào)pH值，保持自然的酸性。值，保持自然的酸性。伊紅美藍(lán)瓊

10、脂培養(yǎng)基伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(EMB) 成分成分1：蛋白胨蛋白胨 10 g NaCl 5 g 乳糖乳糖 4 g 瓊脂瓊脂 25 g 蒸餾水蒸餾水 1000 ml pH 7.6 成分成分2： 2%伊紅水溶液伊紅水溶液2 ml，0.5%美藍(lán)水溶液美藍(lán)水溶液 1 ml 方法：方法：先配成分先配成分1，調(diào)好，調(diào)好pH值后才可加入成分值后才可加入成分2，混勻，趁熱分裝到三角瓶中，混勻，趁熱分裝到三角瓶中，115滅菌滅菌 20 min。3倍濃縮乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基倍濃縮乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基 成分成分1：蛋白胨蛋白胨 30 g 牛肉膏牛肉膏 9 g 乳糖乳糖 15 g NaCl 15 g 蒸餾水蒸餾水 補(bǔ)足補(bǔ)

11、足1000 ml pH 7.2 成分成分2： 1.6%溴鉀酚紫乙醇溶液溴鉀酚紫乙醇溶液3 ml 方法：方法：先配成分先配成分1，調(diào)好，調(diào)好pH值后才可加入成分值后才可加入成分2，混勻，分裝到三角瓶及大試管中，并加入倒置的事混勻，分裝到三角瓶及大試管中，并加入倒置的事先充滿該培養(yǎng)液的杜氏管（勿留氣泡），封口后先充滿該培養(yǎng)液的杜氏管（勿留氣泡），封口后115滅菌滅菌 20 min。 2、滅菌：、滅菌： 干熱滅菌步驟干熱滅菌步驟： 將要滅菌的器皿（培養(yǎng)皿、吸管等）包扎好，放入恒溫干燥箱內(nèi)。 接通電源，打開開關(guān)；旋動恒溫調(diào)節(jié)器至1400C，當(dāng)達(dá)到此溫度時，借助恒溫調(diào)節(jié)器的自動控制，保持恒溫兩小時。 兩

12、小時后，關(guān)掉電源，當(dāng)溫度降至600C以下后，才可打開箱門，取出滅菌物品。（2）高壓蒸汽滅菌）高壓蒸汽滅菌 原理：在密閉容器中加熱形成的蒸汽不斷堆積，使蒸汽壓力升高，溫度也相應(yīng)升高，超過水的沸點(diǎn)。利用過熱的蒸汽來使細(xì)菌及其耐熱芽孢蛋白質(zhì)凝固變性，以致失去生命力，從而達(dá)到徹底滅菌的效果。高壓蒸汽滅菌是最有效的滅菌方法。 一般在1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.30C保持1530分鐘進(jìn)行滅菌，就可殺死一切微生物細(xì)胞及其芽孢或孢子。滅菌對象是培養(yǎng)基、玻璃器皿和各種不因高溫處理而變質(zhì)的物品材料。但對不耐高溫、高壓的溶液或培養(yǎng)基不宜用此種方法。 手提式蒸汽滅菌鍋立式蒸汽滅菌鍋（電加熱、自動或半自動）臥式蒸汽滅菌鍋高壓蒸汽滅菌鍋的使用：高壓蒸汽滅菌鍋的使用： 鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三腳擱架相平為宜。 把要滅菌的材料裝入鍋內(nèi)，注意不要放得太擠，防礙蒸汽流通，影響滅菌效果。 蓋好滅菌鍋鍋蓋，按對角線形式均勻擰緊鍋蓋上的螺栓，螺栓松緊一致，以免漏氣。 打開電源，開啟排汽閥，以排除鍋內(nèi)的冷空氣。 待冷空氣完全排盡后，關(guān)閉排汽開關(guān)。讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升，當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時?？刂茻嵩矗S持壓力至所需時間。本實驗根據(jù)培養(yǎng)基不同，分別采用：1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.30