RNA體外干擾肝癌Hep3B細(xì)胞VEGF基因的表達(dá)

1、RNA體外干擾肝癌Hep 3B細(xì)胞VEGF基因的表達(dá) 作者：蔣冬貴夏昆劉劫羅紅潘乾龍志高夏家輝 【摘要】 目的： 通過(guò)自主構(gòu)建的RNAi載體和體外合成siRNA的方法，尋找能有效干擾VEGF基因表達(dá)的載體和siRNA片段治療腫瘤. 方法：將自主構(gòu)建的pcDUVEGF1和pcDUVEGF2，以及體外合成的TWvegf1和TWvegf2 siRNA片段轉(zhuǎn)染肝癌Hep3B細(xì)胞，通過(guò)RTPCR,Western Blot和ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后VEGF的mRNA及蛋白表達(dá)水平,以了解RNA干擾效果. 結(jié)果：兩種RNA干擾的方法均能抑制VEGF基因的表達(dá)且差異具有顯著性（mRNA,0.28，0.47，0.

2、76，0.58 vs 1.2, P<0.01;蛋白質(zhì),138, 121, 249, 227 vs 389 g/L, P<0.01）. 結(jié)論：兩個(gè)質(zhì)粒及siRNA片段均能有效的抑制VEGF基因的表達(dá). 【關(guān)鍵詞】 RNAi； siRNA； 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子； 肝癌細(xì)胞 【Abstract】 AIM: To construct RNAi plasmids and synthesize siRNA in vitro, transport them into Hep3B cells, so as to find some effective VEGF RNAi plasmi

3、ds and siRNA segments. METHODS: The RNAi plasmids pcDUVEGF1, pcDUVEGF2 and siRNA segments TWvegf1, TWvegf2 were transported into Hep3B cells, and the expressions of VEGF mRNA and protein in the transfected Hep2 / 133B cells were checked using RTPCR, Western Blot and ELISA. The results were compared

4、between the transfected and the normal Hep3B cells. RESULTS: There were prominent differences between the two groups in depressing the expression of mRNA (0.28, 0.47, 0.76, 0.58 vs 1.2, P<0.01) and protein (138, 121, 249, 227 vs 389 g/L, P<0.01) of VEGF gene. CONCLUSION: The two RNAi p

5、lasmids and siRNA segments inhibit the expression of VEGF gene effectively. 【Keywords】 RNAi; siRNA; VEGF; hepatocarcinoma 0引言 VEGF/VEGFR系統(tǒng)在惡性腫瘤中的協(xié)同表達(dá)，旁/自分泌作用機(jī)制的確立為腫瘤的臨床治療提供了新的靶點(diǎn). 在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞種發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA被剪切成siRNA，在體內(nèi)組裝成蛋白復(fù)合體，在siRNA的引導(dǎo)下Dicer酶切割靶RNA，或者以靶RNA為模板合成新的雙鏈RNA，進(jìn)一步被Dicer識(shí)別和剪切,21nt siRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可以誘導(dǎo)

6、強(qiáng)有力的特異性RNAi作用1-4. 我們使用自主構(gòu)建的RNAi真核基因表達(dá)載體pcDU6選擇特異的VEGF基因片段構(gòu)建VEGF基因的RNAi質(zhì)粒，選擇特異的VEGF基因片段體外合成21nt siRNA，并將它們脂轉(zhuǎn)入肝癌Hep3B細(xì)胞后，通過(guò)RTPCR,Western Blot和ELISA的方法檢測(cè)它們對(duì)VEGF mRNA和蛋白表達(dá)的抑制作用，以期找到可靠的抑制VEGF基因表達(dá)的質(zhì)粒和siRNA片段，為肝癌的基因治療提供一種新的方法. 1材料和方法 1.1材料 設(shè)計(jì)合成兩段人U6 promoter315至+1的PCR寡核苷酸引物從人的gDNA中擴(kuò)增出U6 promoter（5端增加Bgl II

7、，3增加Apa I的酶切位點(diǎn)）.將PCR產(chǎn)物用Bgl II和Apa I雙酶切后, 再將pcDNA3.1(-)質(zhì)粒用Bgl II和Apa I雙酶切，構(gòu)建成RNAi質(zhì)粒pcDU6，構(gòu)建pcDU6的引物序列為 正向： 5 gcagatctacgcgcaggcaaaacgcacc, 反向:5 ttgggcccggtgtttcgtcctttccac. 根據(jù)高效RNAi基因片段的設(shè)計(jì)原則2，我們?cè)O(shè)計(jì)并從上海博亞生物制品有限公司申請(qǐng)合成了構(gòu)建VEGF基因RNAi載體的寡核苷酸片段以及體外合成針對(duì)VEGF基因的siRNA的寡核苷酸片段，肝癌Hep3B細(xì)胞株購(gòu)自CCTCC，非必需氨基酸（NAA）、丙酮酸鈉、胎牛

8、血清、胰酶、EDTA, G418均購(gòu)自Gibcol公司，RPMI 1640干粉培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司，脂質(zhì)體2000 Invitrogen公司. T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNA Production System（Promega公司）；Klenow Fragment（Takara公司）；DEPC（Sigma公司）. Trizol Reagent(Gibcol BRL);174 Hinc digest DNA Marker，Taq酶寶生物工程有限公司；AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司）；蛋白質(zhì)Marker（上海生化試劑公司）；Xfilm（上海

9、愛克發(fā)感光器材有限公司）VEGF ELISA檢測(cè)試劑盒（Diognostics Systems公司）；兔抗人VEGF多抗（NEOMARKERS公司）；山羊抗兔二抗（PKD公司）. 1.2方法 實(shí)驗(yàn)組為pcDUVEGF1，pcDUVEGF2陽(yáng)性克隆和轉(zhuǎn)染Tvegf1，Tvegf2 siRNA的Hep3B細(xì)胞，對(duì)照組為常規(guī)培養(yǎng)的Hep3B細(xì)胞. 用Apa I 和BamH I雙酶切pcDU6質(zhì)粒，分別取RVEGF1，RVEGF2的Reverse,Forward，將酶切產(chǎn)物與雙鏈的RVEGF1做連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109，挑取陽(yáng)性克隆并測(cè)序證實(shí)后擴(kuò)增質(zhì)粒. 將連接上RVEGF1的質(zhì)粒取1 L用Bam

10、H I和Hind III雙酶切，將RVEGF2連接到帶有RVEGF1的質(zhì)粒上并測(cè)序證實(shí)，命名為pcDUVEGF1. 將RVEGF3和RVEGF4連接pcDU6質(zhì)粒上并測(cè)序證實(shí)，命名為pcDUVEGF2. 將T7 promoter分別與TWvegf1，TWvegf2，TWvegf3，TWvegf4（均為1g/L）退火，用Klenow Fragment補(bǔ)平. 用T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNA Production System試劑盒體外合成雙鏈的RDNA，按TWvegf1與TWvegf2混合，TWvegf3與TWvegf4混合，分別往上述RDNA混合液中加

11、入RnaseFreeDNase 1 L于37溫浴15 min后立即于95滅活酶活性5 min，常溫下冷卻，Qiagen小寡核苷酸純化柱純化. 所得產(chǎn)物分別命名為Tvegf1，Tvegf2，電泳跑2.0膠檢測(cè)證實(shí)，-20保存待用. 按質(zhì)粒、寡核苷酸（dNTP與siRNA的混合物）與脂質(zhì)體的比例為1 g2 L混勻5 min，溶于不含血清的RPMI 1640液中,室溫30 min后轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞. siRNA轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞24 h后換無(wú)血清培養(yǎng)24 h，取上清行Western Blot，ELISA檢測(cè)，抽總RNA行RTPCR檢測(cè). 1.2.1VEGF mRNA表達(dá)的檢測(cè)Hep3B細(xì)胞用有血清

12、的RMPI1640培養(yǎng)基重懸. 當(dāng)T25培養(yǎng)瓶細(xì)胞匯合率達(dá)到90%95%時(shí)換液，PBS洗滌，各取20 L脂質(zhì)體和20 g pEGFPN1（用以了解脂轉(zhuǎn)效率）,pcDUVEGF1 和pcDUVEGF2質(zhì)粒混勻5 min后加無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基800 L混勻后加入到上述T25瓶培養(yǎng)的Hep3B細(xì)胞上，50 mL/L CO2，37溫箱培養(yǎng)24 h后加G418（800 mg/L）篩選. 將陽(yáng)性克隆加有血清RMPI 1640培養(yǎng)基重懸并轉(zhuǎn)移到6孔板中培養(yǎng). 用Trizol抽實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞的總RNA，同時(shí)用一對(duì)actin引物做對(duì)照，做半定量RTPCR. 經(jīng)電泳圖像分析掃描得到VEGF與act

13、in條帶峰面積積分值比值作為計(jì)算VEGF PCR產(chǎn)物相對(duì)定量,比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組VEGF mRNA的表達(dá)豐度. 1.2.2VEGF蛋白的檢測(cè)將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的變性上清跑100 g/L的PAGE膠，用Marker及陰陽(yáng)性對(duì)照，行Western Blot檢測(cè). 另將實(shí)驗(yàn)組每種質(zhì)粒、siRNA和對(duì)照組均設(shè)4孔50 mL/L CO2, 37培養(yǎng)24 h后,換無(wú)血清RMPI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,取上清凍存于-20. 用VEGF ELISA檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的Hep3B細(xì)胞分泌的VEGF的量. 1.2.3Hep3B細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定將篩選出的RNAi陽(yáng)性克隆細(xì)胞（包括空載體pcDU6）

14、和轉(zhuǎn)染siRNA（轉(zhuǎn)染24 h后）接種于96孔培養(yǎng)板中，設(shè)空白對(duì)照（不含細(xì)胞的PBS）進(jìn)行MTT法測(cè)細(xì)胞的活力. 測(cè)定570 nm處的吸光度A值，A值的大小反映Hep3B細(xì)胞成活數(shù)量及活性. 以時(shí)間為橫坐標(biāo)（d ），減去空白對(duì)照的吸光度A值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線圖. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:SPSS10.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和F檢驗(yàn). 2結(jié)果 21RNAi質(zhì)粒和siRNA對(duì)VEGF mRNA表達(dá)的影響構(gòu)建好的pcDUVEGF1和pcDUVEGF2質(zhì)粒，體外合成的Tvegf1和Tvegf2 siRNA. actin為內(nèi)參照,按100 ng/mL培養(yǎng)基的Tvegf1,Tvegf2作用于Hep3B細(xì)胞后RTPCR擴(kuò)增

15、掃描Tvegf1組、VEGF2組與無(wú)血清對(duì)照組比較VEGF mRNA表達(dá)水平明顯降低， pcDUVEGF1組、pcDUVEGF2組與無(wú)血清對(duì)照組比較VEGF mRNA表達(dá)水平明顯降低. 而pcDUVEGF1組、pcDUVEGF2組、pcDU6組與無(wú)血清對(duì)照組比較VEGF mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差別，有血清對(duì)照組與無(wú)血清對(duì)照組比較VEGF mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差別（圖1）. 2.2VEGF蛋白質(zhì)檢測(cè)將實(shí)驗(yàn)組中pcDUVEGF1組、pcDUVEGF2組、Tvegf1組和Tvegf2組與對(duì)照組即無(wú)血清培養(yǎng)組及PRMPI 1640培養(yǎng)基行Western Blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的VEGF相對(duì)蛋白濃度

16、（VEGF/actin）高于對(duì)照組（0.28，0.47，0.76，0.58 vs 1.2, P<0.01）. 將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的Hep3B的上清進(jìn)行ElISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組各組的VEGF蛋白質(zhì)濃度均明顯低于對(duì)照組（138, 121, 249, 227 vs 389 g/L, P<0.01）, Tvegf1組與Tvegf2組比較無(wú)明顯差異(P>0.05), pcDUVEGF2組明顯低于pcDUVEGF1組（P<0.01）. 2.3Hep3B細(xì)胞生長(zhǎng)曲線TWvegf1和pcDUvegf2二組細(xì)胞生長(zhǎng)均明顯受到抑制（P<0.01

17、），TWvegf2和pcDUvegf1二組細(xì)胞生長(zhǎng)均明顯受到抑制(P<0.05，圖2). 3討論 原發(fā)性肝癌(HCC)是典型的富血供惡性腫瘤. 腫瘤血管生成是HCC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的先決條件. 預(yù)先存在的血管發(fā)芽形成新血管包括釋放血管新生因子、激活基質(zhì)金屬蛋白酶、降解細(xì)胞外基質(zhì)及爾后的重塑細(xì)胞外基質(zhì)等步驟5. 對(duì)HCC腫瘤血管生成分子機(jī)制的研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)是目前已知在HCC 腫瘤血管生成中作用最強(qiáng)的血管生成誘導(dǎo)因子. 因此我們選擇了VEGF基因作為RNAi肝癌基因治療和肝癌與VEGF關(guān)系的研究的出發(fā)點(diǎn). 按照選擇高效的RNAi基因治療的片段的原則，分別選擇了2段針對(duì)VEGF基因的DNA片段用于構(gòu)建VEGF基因的RNAi載體，2段針對(duì)VEGF基因的DNA片段用于體外合成siRNA片段，并分別將它們用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞，通過(guò)半定量RTPCR，Western Blot和ElISA檢測(cè)VEGF基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，這4個(gè)片段均能有效但（不完全）抑制VEGF基因的表達(dá)，且不同位置的RNA干擾效果存在明顯的差別. 細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)也得到了