魚類生理學(xué)具體實驗內(nèi)容

1、魚類生理學(xué)實驗實驗一 反射中樞活動的某些基本特征及反射弧的分析 實驗項目學(xué)時：3* 實驗要求： 必修 選修 一、實驗?zāi)康募耙螅和ㄟ^對某些脊髓反射（如脊蛙的屈肌反射）的分析，了解反射弧完整性與反射活動的關(guān)系。掌握反射時的測定方法，通過用不同濃度的硫酸溶液刺激蛙趾引起屈肌反射。以脊蛙的屈肌反射為指標(biāo)，觀察反射中樞活動的某些基本特征，并分析它們產(chǎn)生的機制。二、實驗基本原理：在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的參與下，機體對刺激所產(chǎn)生的具有適應(yīng)意義的規(guī)性律性反應(yīng)過程稱為反射。將動物的高位中樞切除僅保留脊髓的動物成為脊髓動物（如脊蛙），它們產(chǎn)生的反射活動為單純的脊髓反射，由于失去高位中樞的控制反射活動較為簡單，便與觀察與

2、分析反射過程的某些特征。反射活動的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是反射弧。典型的反射弧由感受器、傳入神經(jīng)、神經(jīng)中樞、傳出神經(jīng)和效應(yīng)器五個部分組成。反射弧必須保持完整性，才能引起反射，其中任何一個環(huán)節(jié)受到破壞，反射活動就無法實現(xiàn)。 在反射活動中，由于神經(jīng)元特別是中間神經(jīng)元聯(lián)系方式的不同，使反射活動表現(xiàn)出種種特征。如：反射時（從刺激作用于感受器至效應(yīng)器出現(xiàn)反應(yīng)所經(jīng)歷的時間）的長短、反射活動空間范圍的大小、反射活動持續(xù)時間的久暫以及引起反射活動的刺激條件等等。三、主要儀器設(shè)備及實驗耗材：蟾蜍、硫酸溶液（0.1%,0.3%,0.5%,1%）、紗布。蛙類手術(shù)器械、鐵架臺、血管鉗一把、秒表、玻璃平皿、肌夾、搪瓷杯、小濾紙（約1

3、cm×1cm）、燒杯。四、實驗內(nèi)容或步驟：1、實驗準(zhǔn)備取蟾蜍一只，用粗剪刀由兩側(cè)口裂剪去上方頭顱，制成脊蟾蜍。將動物俯臥位固定在蛙板上，于右側(cè)大腿背側(cè)縱行剪開皮膚，在股二頭肌和半膜肌之間的溝內(nèi)找到坐骨神經(jīng)干，在神經(jīng)干下穿一條細(xì)線備用。手術(shù)完后，用肌夾夾住動物下頜，懸掛在鐵架臺上。 2、實驗項目 （l）反射中樞活動的某些基本特征反射時的測定：在平皿內(nèi)盛適量0.1%硫酸溶液，將蟾蜍一側(cè)后肢的一個腳趾尖浸入硫酸溶液中，同時按動秒表記錄從浸入時起至后肢發(fā)生屈曲所需要的時間，并立即將該足趾浸入搪瓷杯水中浸洗數(shù)次，然后用紗布拭干。用上述方法重復(fù)三次，注意每次浸入趾尖的深度要一致。三次所測時間的平

4、均值，即為此反射的反射時（兩次實驗間隔至少23min）。然后平皿中分別換以0.3%、0.5%、1%的硫酸溶液再重復(fù)上述測定，比較四種濃度硫酸所測之反射時是否相同。 （2）反射弧的分析 用浸有1%硫酸溶液的小濾紙片貼在下腹部。觀察雙后肢有何反應(yīng)？待反應(yīng)出現(xiàn)后，將動物浸于搪瓷杯的清水內(nèi)洗掉濾紙片和硫酸，用紗布擦干皮膚。提起穿在右側(cè)坐骨神經(jīng)下的細(xì)線，剪斷坐骨神經(jīng)，再重復(fù)上述實驗，比較兩次結(jié)果有何不同？ 分別將左右后肢趾尖浸入盛有1%硫酸的小平皿內(nèi)（兩側(cè)浸沒的范圍相等且僅限于趾尖），雙側(cè)后肢是否都發(fā)生反應(yīng)？ 沿左后肢趾關(guān)節(jié)上做一環(huán)形皮膚切口，將切口以下的皮膚全部剝脫（趾尖皮膚一定要剝干凈），再用1%硫

5、酸溶液浸泡該趾尖（切不可將其他趾尖浸入），觀察該側(cè)后肢的反應(yīng)。將一1%硫酸紙片貼于左后肢皮膚，觀察引起的反應(yīng)，用搪瓷杯中清水洗掉紙片及硫酸，擦干皮膚后，將探針插入脊髓腔內(nèi)反復(fù)搗毀脊髓，再重復(fù)剛才的實驗。結(jié)果如何？方法評估操作簡單、易于掌握，為常規(guī)實驗方法。應(yīng)用意義為了解中樞神經(jīng)系統(tǒng)某些特征及活動規(guī)律的驗證性實驗，主要用于觀察分析中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)反射中樞的活動規(guī)律及反射弧的完整與反射活動的關(guān)系。注意事項 1、離斷顱腦部位要適當(dāng)，太高可能保留部分腦組織而出現(xiàn)自主活動，太低也會影響反射的引出。 2、每次用硫酸溶液或紙片處理后，應(yīng)迅速用搪瓷杯中的清水洗去皮膚上殘存的硫酸，并用紗布擦干，以保護皮膚并防止沖

6、淡硫酸溶液。測定反射時的硫酸濃度應(yīng)由低到高。 3、浸入硫酸溶液的趾尖應(yīng)僅限于一個，而且每次浸泡的范圍也應(yīng)恒定，切勿浸入太多。五、思考題1、何謂反射時，反射時與刺激強度之間有何關(guān)系？2、反射弧包括哪幾部分？剝?nèi)ブ宏P(guān)節(jié)以下的皮膚后不再出現(xiàn)原有的反射活動，為什么？實驗二 魚類血液紅細(xì)胞和白細(xì)胞的計數(shù)實驗項目學(xué)時：3* 實驗要求： 必修 選修 附件一 魚類紅細(xì)胞與白細(xì)胞的計數(shù)（必修）目的與原理掌握魚類采血技術(shù)和魚類紅、白細(xì)胞計數(shù)的原理和方法，并測定不同魚類的紅、白細(xì)胞含量及其差異。采用稀釋法計數(shù)魚類單位容積血液內(nèi)的紅細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)。由于血液中紅、白血細(xì)胞數(shù)很多無法直接計數(shù)，故需用適當(dāng)?shù)娜芤簩⒀合♂尅?/p>

7、然后將稀釋血滴入血細(xì)胞計數(shù)板上，在顯微鏡下計數(shù)一定容積的紅、白細(xì)胞數(shù)。再將所得的結(jié)果換算為每立方mm血液中紅、白細(xì)胞個數(shù)。實驗對象鯉、鯽或草魚。試劑與器材顯微鏡，血細(xì)胞計數(shù)板，計數(shù)器，魚用注射器（1ml或5ml），吸血管，凹瓷盤，消毒棉球，紗布，擦鏡紙，小試管及試管架，移液管（1ml及2ml），紅、白細(xì)胞稀釋液（或0.850.9%的NaCl溶液），75%的酒精，蒸餾水，抗凝劑（1%肝素鈉溶液或10%草酸鉀溶液）。實驗步驟1、熟悉血細(xì)胞計數(shù)板的構(gòu)造：血細(xì)胞計數(shù)板為一長方形厚玻璃板。其中計數(shù)室方格大小的劃分，各種產(chǎn)品略有不同，但基本原理相同。其中央橫溝的兩邊各有一計數(shù)室，兩計數(shù)室的劃分完全相同（圖

8、1-5-1）。在顯微鏡低倍下觀察，可見每個計數(shù)室用雙線劃分成9個大方格（圖1-5-2）。大方格每邊長1.0mm。四角的大方格每個又分為16個中方格，這是用以計數(shù)白細(xì)胞的。中央的一個大方格用雙線分成25個中方格，每個中方格又等分成16個小方格（用單線），中方格每邊長為0.2mm，計數(shù)紅細(xì)胞時，數(shù)中央大方格的5個中方格（即四角和中央的中方格）內(nèi)的紅細(xì)胞數(shù)目（圖1-5-2）。計數(shù)室較兩邊的蓋玻片支柱低0.1mm，因此，放上蓋玻片后，計數(shù)板與蓋玻片之間的距離為0.1mm，此為計數(shù)室的高度。2、采血及稀釋：以2ml移液管在干凈的小試管內(nèi)準(zhǔn)確加入紅細(xì)胞稀釋液或0.850.9%的NaCl溶液2ml，另用1m

9、l移液管在另一干凈的小試管內(nèi)加入白細(xì)胞稀釋液0.38ml，備用。魚類血液可從心臟或尾動脈中采取。方法是將魚腹部向上固定在魚解剖臺上，或用紗布包好握在手里，用浸潤過抗凝劑的注射器沿魚體中線與兩腹鰭根部之間相交部位刺入，依據(jù)解剖部位確認(rèn)已刺入心臟，可稍后拔針管，如有血液吸入即可，否則重新拔出再刺。 圖 1-5-1 血細(xì)胞計數(shù)室結(jié)構(gòu) 圖 1-5-2 血細(xì)胞計數(shù)區(qū)尾動脈取血方法 是用注射器從魚體臀鰭后部插入至椎體腹側(cè)，尾靜脈血液順勢流入針管，每尾魚可用此方法數(shù)次采血，但每次針頭插入部位應(yīng)在前次插入之前。將抽出的血液放入經(jīng)抗凝劑處理的凹瓷盤內(nèi)，用微量（血紅蛋白）吸血管吸取10l血液至紅細(xì)胞稀釋液試管內(nèi)，

10、再吸取20l血液至白細(xì)胞稀釋液試管內(nèi)，輕輕擠出血液并反復(fù)吸洗23次。然后將血液與稀釋液混和均勻，但不可用力振蕩，以免細(xì)胞破碎。3、充液：將蓋玻片先蓋在計數(shù)板上，用潔凈的吸血管吸取搖勻的稀釋血液，然后將吸管口輕輕斜置蓋玻片的邊緣，滴出少量稀釋血液，使溶液借毛細(xì)管現(xiàn)象而流入計數(shù)室內(nèi)。但必須注意，如滴入過多時，流出室外凹溝中，易造成蓋玻片浮起，體積不準(zhǔn)；過少時，經(jīng)多次充液，易造成氣泡，所以都應(yīng)洗去重新充液。4、計數(shù)：稀釋血液滴入計數(shù)室后，須靜置23分鐘，然后低倍鏡下計數(shù)（顯微鏡焦距準(zhǔn)確，縮小光圈并降低聚光器。使視野較暗）。計數(shù)白細(xì)胞時，數(shù)四角四個大方格內(nèi)的白細(xì)胞總數(shù)。計數(shù)紅細(xì)胞時數(shù)中央大方格四角的四

11、個中方格和中央的一個中方格（共5個中方格）內(nèi)的紅細(xì)胞總數(shù)，計數(shù)時應(yīng)循一定的路徑以免遺漏或重復(fù)。對于分布在劃線上的血細(xì)胞，依照“數(shù)上不數(shù)下， 數(shù)左不數(shù)右”的原則進行計數(shù)（圖1-5-3）。 計數(shù)白細(xì)胞時，如發(fā)現(xiàn)每個大方格白細(xì)胞數(shù)相差10個以上；計數(shù)紅細(xì)胞時，如發(fā)現(xiàn)各個中格之間的紅細(xì)胞數(shù)相差超過15個，表示血細(xì)胞分布不均勻。應(yīng)將計數(shù)板洗凈，重新?lián)u勻稀釋血液，再充液計數(shù)。5計算 紅細(xì)胞數(shù)目：將5個中方格內(nèi)數(shù)得的紅細(xì)胞總數(shù)乘以10，000即得每立方mm血液中紅細(xì)胞總數(shù)。圖1-5-3 血細(xì)胞計數(shù)方式（實心圈表示計數(shù)的紅細(xì)胞，空心圈表示不應(yīng)計數(shù)的紅細(xì)胞）計算公式為：紅細(xì)胞數(shù)/mm3 = 5個中格紅細(xì)胞數(shù)&#

12、215;稀釋倍數(shù)/計數(shù)的5個中格容積（1） 稀釋倍數(shù)等于稀釋液2ml除以加入血10L（0.01ml），為200倍。（2） 計數(shù)室5 個中格容積為0.2×0.2×0.1×5 = 0.02 mm3。白細(xì)胞數(shù)目：將4個大方格內(nèi)數(shù)得白細(xì)胞總數(shù)乘以50，即每立方mm血液的白細(xì)胞總數(shù)。計算公式為：白細(xì)胞數(shù)/ mm3 = 4個大方格白細(xì)胞數(shù)×稀釋倍數(shù)/ 計數(shù)的4 個大格容積（1） 稀釋倍數(shù)等于稀釋液0.38ml+血20L（0.02ml）/0.02ml，為20倍。（2） 計數(shù)室4個大方格容積為1×1×0.1×4= 0.4 mm3。方法評估采

13、用顯微鏡目視計數(shù)法為血液紅、白細(xì)胞數(shù)量測定的最常用的基本方法，目前雖有各種自動化分析方法，但該方法由于經(jīng)典、方便、實用，仍較廣泛用于血液檢驗和科研實踐中。 應(yīng)用意義紅細(xì)胞是血液中數(shù)量最多的有形成分，在正常情況下幾乎占血容量的12，故使血液呈紅色粘稠混懸液。紅細(xì)胞數(shù)量正常情況下保持相對穩(wěn)定的。多數(shù)魚100300萬個/mm ，高者可達(dá)400萬個/mm3 低者數(shù)十萬/ mm3。 魚類紅細(xì)胞數(shù)也因性別不同而有差異，一般雄魚的紅細(xì)胞數(shù)比雌魚多。此外魚類紅細(xì)胞數(shù)量常因魚種、年齡、外界環(huán)境變化、機體不同生理狀況（運動狀況、患病、營養(yǎng)狀況等）而出現(xiàn)一定的差異。環(huán)境變化如長期缺氧紅細(xì)胞代償性增多。魚類白細(xì)胞數(shù)量

14、隨種類、年齡、生理狀況（產(chǎn)卵）、疾病以及一些外界環(huán)境因素影響而變化，此外，魚類白細(xì)胞還與飼養(yǎng)條件、營養(yǎng)狀況有關(guān)：飽食消化力旺盛時多，長期饑餓白細(xì)胞（特別是嗜酸性白細(xì)胞）顯著減少。注意事項1、各種用具要事前清洗。清洗吸管時按照蒸餾水（兩次） 95%酒精（兩次） 乙醚（兩次）的方法清洗。計數(shù)室用蒸餾水洗后，再用軟紗布或擦鏡紙吸干。2、采血要求迅速、準(zhǔn)確，不能凝血，也不能有氣泡，否則棄去重采。3、血吸管用完后必須立即清洗干凈，以防血液凝固堵塞管口。思考題1、綜合實驗所得結(jié)果，與紅、白細(xì)胞的正常值相對照，有何變異？為什么？2、為什么機體正常血細(xì)胞數(shù)可維持在相對穩(wěn)定的數(shù)量水平？3、試討論魚類紅細(xì)胞的正常

15、值及其應(yīng)用意義？4、白細(xì)胞數(shù)量的變化有何生理意義？5、血細(xì)胞計數(shù)室中央的大方各中每一種方格的容積是多少？附 血細(xì)胞稀釋液1、白細(xì)胞稀釋液冰醋酸（破壞紅細(xì)胞） 1.5毫升1%龍膽紫（染白細(xì)胞核便于計數(shù)） 1毫升蒸餾水 加至100毫升2、紅細(xì)胞稀釋液NaCl (維持滲透壓) 0.5克 Na2SO4 (使溶液比重增加，紅細(xì)胞分布不易下沉) 2.5克 HgCl （固定紅細(xì)胞形狀） 0.25克 蒸餾水 加至100毫升 附件二 魚類血涂片的制作和白細(xì)胞分類計數(shù)（必修）目的與原理 了解各種類型白細(xì)胞的形態(tài)特征，掌握血涂片制作方法和白細(xì)胞分類計數(shù)方法，進行不同魚類白細(xì)胞分類計數(shù)和血細(xì)胞形態(tài)特征、變形率等的觀察

16、。白細(xì)胞依據(jù)其形狀、染色顆粒、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的形狀大小可以進行分類。通常的分類方法是根據(jù)細(xì)胞漿中有無特殊的嗜色顆粒，將其分成顆粒細(xì)胞和無顆粒細(xì)胞。顆粒細(xì)胞又依據(jù)所含顆粒對染色劑反應(yīng)特性，被區(qū)分為中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞；無顆粒細(xì)胞則分成單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。中性粒細(xì)胞有較強的吞噬能力，能將侵入機體的微生物消滅掉，并可參與免疫復(fù)合物和壞死組織的清除工作。嗜酸性粒細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)含有過氧化物酶和酸性磷酸酶，吞噬能力與中性粒細(xì)胞相當(dāng)或稍弱，能吞噬抗原-抗體復(fù)合物，此外，嗜酸性粒細(xì)胞具有抗炎作用。嗜堿性粒細(xì)胞含有多種化學(xué)物質(zhì)，如組織胺、肝素和5-羥色胺等，當(dāng)抗原-抗體發(fā)生反應(yīng)時，或機體在寒冷環(huán)

17、境中時，都能引起嗜堿性粒細(xì)胞釋放組織胺和肝素。血液中的單核細(xì)胞穿出血管壁進入組織，變成巨噬細(xì)胞，可對抗組織內(nèi)的致病物，各種細(xì)菌和病毒。淋巴細(xì)胞有免疫功能，對異己構(gòu)型的物質(zhì)具有殺滅和消除作用。各種白細(xì)胞必須經(jīng)過染色，才易于區(qū)分其類別。常用者為瑞氏（Wrights）染色法和姬姆薩(Giemsa)染色法。實驗對象 魚（淡水魚和海水魚均可）。試劑與器材 試劑：染色液的配制：1、姬姆薩（Giemsa）染液的配制（1）原液配制：Giemsa 粉劑（0.8 g）；甘油（醫(yī)用）50 ml；甲醇50 ml。將Giemsa粉劑溶于甲醇中，在乳缽中充分研磨，溶解后再加甘油，混合均勻，置于3740溫箱內(nèi)812h，過濾

18、，裝入棕色試劑瓶內(nèi)，密封保存?zhèn)溆谩＃?）稀釋液臨用時取Giemsa原液5ml，加磷酸鹽緩沖液（pH6.46.8）50 ml，即為Giemsa稀釋液。（3）pH6.46.8磷酸鹽緩沖液：取磷酸二氫鉀（無水）0.3g，磷酸氫二鈉（無水）0.2g，加少量蒸餾水溶解，調(diào)整pH至6.46.8，加水至1000ml。2、 瑞氏（Wrights）染液的配制（1）原液配制：瑞氏染料粉劑0.1g；純甲醇60 ml。(2) 配制步驟： 將瑞氏染料粉放人乳缽內(nèi)，加少量甲醇研磨。 將已溶解的染料倒入潔凈的玻璃瓶內(nèi)，剩下未溶解的染料再加入少量甲醇進行研磨，如此反復(fù)操作，直至全部染料溶解為止。 裝入玻璃瓶內(nèi)密封，在室溫下保

19、存一周即可使用。 新鮮配制的染料偏堿性，放置后呈酸性，染液儲存時間越久，染色愈好。器材：顯微鏡，香柏油，載玻片，蓋玻片，玻片水平支架，采血針或注射器，計數(shù)器，小滴管，蠟筆，消毒棉球，瑞氏染液，pH6.46.8磷酸鹽緩沖液，姬姆薩染液，蒸餾水。實驗步驟1、血涂片的制作：取一滴血（采血方法見實驗49），滴于潔凈無油脂的玻片一端。左手持玻片，右手再取邊緣光滑的另一玻片作為推片。將推片邊緣置于血滴前方，然后向后拉，當(dāng)與血滴接觸后，血即均勻附在二玻片之間。此后以二玻片約呈3045度的角度平穩(wěn)地向前推至玻片另一端（圖1-5-4）。推時角度要一致，用力應(yīng)均勻，即推出均勻的血膜（血膜不可過厚、過?。?。將制好的

20、血涂片晾干，不可加熱。2、血涂片的染色步驟：（1）用蠟筆在血膜兩端各劃一道線，以免染料外溢，置涂片于水平的支架上。（2）用小滴管將瑞氏染液滴于涂片上，并蓋滿劃出的涂片部分固定約半分鐘。（3）用小滴管再加1.5倍緩沖液或姬姆薩（Glemsa）染液，輕輕搖動，并輕吹液體使染色液與緩沖液混合均勻，靜置510分鐘。（4）用蒸餾水沖洗（如自來水的pH值穩(wěn)定于7.2左右時亦可代用）。沖洗血膜時應(yīng)將玻璃片持平，沖洗后斜置血涂片于空氣中干燥?；蛳扔脼V紙吸取水分迅速干燥，即可鏡檢。3、白細(xì)胞分類計數(shù)：先用低倍鏡檢查涂片及染色是否均勻。然后加一滴香柏油于血膜厚薄均勻處（一般在體尾交界處），在油鏡下由此處開始按其形

21、態(tài)特征進行分類計數(shù)，計數(shù)移動時避免重復(fù)。根據(jù)所見到的100個白細(xì)胞，記錄各種白細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)。例如：嗜中性白細(xì)胞分?jǐn)?shù)（%）=計數(shù)嗜中性白細(xì)胞個數(shù)/計數(shù)總白細(xì)胞個數(shù)×100%。圖1-5-4 血涂片制備示意圖紅細(xì)胞呈桔紅色；中性粒細(xì)胞核為藍(lán)紫色，顆粒呈藍(lán)紫至紫紅色；嗜酸性粒細(xì)胞顆粒呈鮮紅至桔紅色；嗜堿性粒細(xì)胞顆粒呈深藍(lán)紫色；淋巴細(xì)胞核呈深藍(lán)紫色，胞質(zhì)呈天藍(lán)色；單核細(xì)胞核呈淺紫色，胞質(zhì)呈灰藍(lán)色。方法評估顯微鏡法白細(xì)胞分類是經(jīng)典、傳統(tǒng)的血細(xì)胞分類法，目前還無任何儀器可以完全取代。它能夠準(zhǔn)確地根據(jù)細(xì)胞形態(tài)特征進行分類計數(shù)，并可及時發(fā)現(xiàn)異常細(xì)胞。血液分析儀進行細(xì)胞分類主要是從細(xì)胞的體積大小、細(xì)

22、胞核形、細(xì)胞化學(xué)染色等方面進行檢測，檢測速度快，分析細(xì)胞多，適宜于大批量標(biāo)本的分析。對其檢測出來的異常標(biāo)本，要準(zhǔn)確識別細(xì)胞類別及確認(rèn)病理改變還必須以顯微鏡檢查為準(zhǔn)。應(yīng)用意義在不同的生理狀態(tài)下，不同種類白細(xì)胞數(shù)目波動較大。如運動、寒冷、消化期、繁殖期等，此外，在機體失血、劇痛、急性炎癥、慢性炎癥等病理狀態(tài)下，白細(xì)胞也增多。例如，急性感染、急性中毒、嚴(yán)重組織損傷、惡性腫瘤等中性粒細(xì)胞增多；某些病毒、細(xì)菌感染、某些慢性感染時，淋巴細(xì)胞數(shù)量增多。注意事項1、所用玻片必須干凈，無油污。2、如染色太淺，可按照原來步驟重染；染色太深或有沉淀物則可用甲醇脫色后重染。3、如白細(xì)胞核為天藍(lán)色則染色時間過短。如紅細(xì)

23、胞呈紫紅色，表示染色時間過長。4、染色時切勿使染液干涸，否則發(fā)生不易去掉的沉淀。5、沖洗時不可先傾倒染色，應(yīng)先輕輕搖動玻片，緩慢加水使沉渣泛起，然后再用水沖洗。6、水沖洗時間不宜過長，否則會脫色。思考題1、試述瑞氏（Wrights）染色法區(qū)分各種白細(xì)胞的依據(jù)？2、怎樣才能制備一個形態(tài)清晰的血涂片？3、實驗所得結(jié)果與正常值相對照，有何變異？為什么？實驗三 溫度對魚類呼吸代謝的影響實驗項目學(xué)時：4* 實驗要求： 必修 選修 一、實驗?zāi)康募耙螅赫莆諟y定魚類等水產(chǎn)動物耗氧率的方法，并用此法測定水產(chǎn)動物的耗氧率，分析和計算被測動物的代謝率（或代謝強度）。掌握影響魚類呼吸代謝的主要影響因素。二、實驗基本

24、原理：耗氧率經(jīng)常被直接用來表示機體的代謝強度，因為機體的代謝率與它們的耗氧率呈正相關(guān)性，這是一種簡便的測算方法，對于養(yǎng)殖工作者來說是非常適用的。除此以外，耗氧率也是間接測定能量代謝的重要指標(biāo)之一。溫度和pH是影響耗氧率的重要因素。本實驗通過測定溫度和pH對魚類耗氧量的影響，從而可以了解溫度和pH對魚體代謝活動的影響。測定水生生物耗氧率的儀器裝置及測定方法有多種。常用的有兩類：一是靜水式，二是流水式。本實驗采用的是靜水密閉測定法。三、主要儀器設(shè)備及實驗耗材：試劑：1、硫酸錳：稱取52gMnSO4·5H2O（或37gMnSO4·H2O），用90毫升蒸餾水溶解，然后稀釋到100m

25、l。靜置數(shù)日，取清液使用。2、堿性碘化鉀：50gNaOH(或70克KOH)及15g固體KI，分別溶于50及35ml純水中。然后將兩液混合，冷卻后稀釋到100ml。放入到聚乙烯瓶中蓋嚴(yán)保存，不可用磨口試劑瓶保存。3、濃H2SO4：市售比重1.84的試劑。4、HCl（1：1）5、0.05N Na2S2O3：稱取2.5gNa2S2O3·5H2O ,用煮沸后冷卻的蒸餾水配制成500ml，加入NaOH 0.2g使溶液呈堿性，減慢Na2S2O3分解，貯存于棕色瓶中，濃度要標(biāo)定。6、0.5淀粉：稱取1g可溶性淀粉于300ml燒杯中，用少量純水調(diào)成懸濁液。沖入剛煮沸的200ml純水，并再煮沸即可。材

26、料：鯽、羅非魚或其它水生動物。器材：水產(chǎn)動物呼吸實驗裝置；酸式滴定管；恒溫水浴鍋；采樣瓶（或磨口試劑瓶）30ml若干；三角錐瓶100ml若干；微量滴定管；乳膠管；滴定架；蝴蝶夾；羅紋水止；移液管；吸耳球等。四、實驗內(nèi)容或步驟：1、實驗設(shè)置不同的試驗溫度，如金魚（鯽魚），可設(shè)置10、20和30三個試驗溫度。每個試驗溫度需要有一個水浴，將溫度預(yù)先調(diào)節(jié)好，如需要的溫度低于室溫，需要加冰降溫，高于室溫則需要加熱，并使水溫保持相對穩(wěn)定。2、實驗設(shè)置不同的pH值，然后測定不同pH下的耗氧量并作分析對比。3、安裝呼吸室（見圖1或2）：呼吸室為一個巨塞大口玻璃瓶，容積根據(jù)動物個體大小而定。要求是水生動物在呼吸

27、室內(nèi)活動自如，在實驗時間內(nèi)動物保持充足的氧供應(yīng)。呼吸室入口裝二只玻璃管，分別為入水管和出水管，另外呼吸室上面有溫度計可測量呼吸室內(nèi)的水溫。安裝時，首先將呼吸室充滿水，放入實驗動物（實驗動物放入前需稱量），使測試動物穩(wěn)定半小時方可開始實驗。4、測定實驗開始時水中溶解氧（初溶氧），及實驗結(jié)束時水中溶解氧（末溶氧）。5、溶氧測定方法：用30ml細(xì)口瓶（具塞磨口瓶）作為水樣瓶，用虹吸法取樣一滿瓶水樣后，立即加硫酸錳3滴，堿性碘化鉀3滴，蓋上瓶蓋（瓶中不可有氣泡），上下?lián)u動約1分鐘。靜置，待沉淀下降到中部后，加濃硫酸5滴，蓋上蓋再搖勻。取酸化后水樣15ml于錐形瓶中，用0.050N硫代硫酸鈉滴定到溶液為

28、淡黃色時，加0.5淀粉56滴，再繼續(xù)滴定到藍(lán)色剛剛消失。記錄滴定消耗體積V（毫升）。圖 1 靜水密閉法裝置 圖2流水密閉法裝置6、耗氧率計算： NV 溶解氧（mg/l）= _ ×1000 V樣 (初溶氧末溶氧)耗氧率（O2g/kg/h）= _×呼吸室體積 （動物體重×實驗時間）五、思考題1、采用靜水式和流水式方法進行耗氧率測定各有何優(yōu)缺點？2、為何用靜水式測定耗氧率要在一晝夜采取3-4個時間段測定，并取其平均值，為什么？3、溫度和pH如何影響魚類呼吸代謝？實驗四 亞硝酸鹽對魚類血紅蛋白的影響實驗項目學(xué)時：3* 實驗要求： 必修 選修 附件一 魚類血紅蛋白含量的測定

29、（必修）方法一、酸化血紅蛋白稀釋測定法（改良沙利氏法）目的與原理 掌握測定魚類血紅蛋白含量的原理和方法，應(yīng)用改良沙利氏法測定不同魚類血紅蛋白含量。本實驗是應(yīng)用比色法測定魚的血紅蛋白量。血紅蛋白本身的色澤，常隨所結(jié)合的氧量多少而改變，不便比色。但是加入稀鹽酸于血液中可使血紅蛋白變成不易變色的高鐵血紅蛋白，這就可以與標(biāo)準(zhǔn)色相比，從而測出其含量。通常以每100ml血液中含血紅蛋白克數(shù)來表示，正常魚血紅蛋白含量為7-8g。實驗對象鯉、鯽或草魚。實驗設(shè)置四個組，即空白對照組和三個低中高濃度的亞硝酸鹽實驗組。試劑與器材 血紅蛋白比色計，血吸管，注射器，凹瓷盤，小試管，試管架，蒸餾水，75%酒精，棉球，0.

30、1mol/L鹽酸，蒸餾水，滴管，紗布，抗凝劑（1%肝素鈉溶液或10%草酸鉀溶液）。實驗步驟1、了解血紅蛋白比色計的構(gòu)成 血紅蛋白計主要包括吸血管、比色計和比色管等部件。吸血管為一厚壁毛細(xì)玻璃管，其上有10l、20l的刻度，尾端連有橡皮頭，供吸血用。比色計的兩側(cè)，裝有標(biāo)準(zhǔn)濃度的高鐵血紅蛋白溶液，也有用比色玻璃柱（或片）來代替的。比色管可插在比色計中，與兩側(cè)的標(biāo)準(zhǔn)比色柱進行比色。比色管的兩側(cè)通?？逃袃尚锌潭?。一行為血紅蛋白的絕對值，以g計數(shù)（每100毫升血液中所含血紅蛋白的克數(shù)）來表示，刻度范圍為222。另一行為血紅蛋白相對值，以%（即相當(dāng)于正常平均值的百分?jǐn)?shù)）來表示，刻度范圍為10%160%。目

31、前測定常用絕對值來表示。 2、用蒸餾水將比色管洗凈，吸血管則依次用蒸餾水，95%酒精和乙醚洗凈干燥備用。3、用滴管加0.1mol/L鹽酸46滴到刻度比色管內(nèi)，約加到管下端刻度“2”或“10%”處為止。4、采血：采血方法見前面的實驗，用吸血管吸血至20l刻度（要準(zhǔn)確）。用綿球仔細(xì)將管尖端外面的血拭去。5、將吸血管中血液輕輕地滴到比色管中鹽酸底部，并用上層較清的鹽酸溶液反復(fù)清洗吸血管3次。使吸血管內(nèi)的血液完全洗凈。切勿帶入空氣，以至形成氣泡影響比色。吸血管尖端殘留的液體，應(yīng)在比色管內(nèi)壁上瀝凈。取出吸血管后，輕輕搖動比色管使血液與鹽酸充分混合，靜置15分鐘使管內(nèi)的鹽酸和血紅蛋白作用完全，形成棕色的高

32、鐵血紅蛋白。6、把比色管插入標(biāo)準(zhǔn)比色架兩色柱中央的空格中，使無刻度的兩側(cè)面位于空格的前后方，便于透光和比色。7、用吸管將蒸餾水逐滴地加入比色管內(nèi)，每加一滴都應(yīng)充分混勻并觀察比色管內(nèi)的顏色，直到比色管內(nèi)溶液的色度和血紅蛋白計上標(biāo)準(zhǔn)色度相同時為準(zhǔn)，讀出管內(nèi)液面所在的刻度數(shù)，（讀數(shù)應(yīng)以溶液凹面最低點相一致的刻度為佳）。即為每100ml血液中所含血紅蛋白的克數(shù)（用g/100ml表示）。8、實驗完畢應(yīng)將吸血管和比色管洗凈，放回盒內(nèi)。方法評估 采用目視比色法測定血紅蛋白含量是比較常用及簡便的方法，但此法誤差較大，而且同儀器的準(zhǔn)確度有關(guān)。應(yīng)用意義血紅蛋白含量與年齡、性別、性周期、營養(yǎng)狀況、活動情況、季節(jié)變化

33、等有關(guān)，營養(yǎng)不良或長期饑餓可引起血紅蛋白量顯著降低。注意事項1、用吸血管吸血過程應(yīng)仔細(xì)、認(rèn)真，準(zhǔn)確把握住吸入的血液量是初學(xué)者的一個難點，也是實驗結(jié)果準(zhǔn)確與否的一個關(guān)鍵。2、血紅蛋白吸管很容易被損壞，應(yīng)妥善愛護。管內(nèi)有凝血塊時不可用金屬絲疏通，可浸泡入氨水或45%尿素溶液中，待血塊去除后再用水洗凈，并按蒸餾水 95%酒精 乙醚的順序清洗，最后吹干吸管。3、鹽酸濃度不可過稀。血液與鹽酸作用時間不可過短，必須在10分鐘以上方可稀釋比色，否則血紅蛋白不能充分轉(zhuǎn)變成高鐵血紅蛋白。最好在30分鐘內(nèi)比色完畢。4、滴加蒸餾水時，宜少量多次，逐滴加入后混勻比色，以免稀釋過度，得不到準(zhǔn)確結(jié)果。5、比色應(yīng)在自然光線

34、下進行，避免在陰暗處或有色燈光下比色，并將比色管刻度轉(zhuǎn)向兩側(cè)，以免影響比色效果。實驗五 設(shè)計性實驗 水體污染對魚類血液和腦組織膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的影響 實驗項目學(xué)時：8* 實驗要求： 必修 選修 （一）實驗?zāi)康募耙螅赫莆漳憠A酯酶活力測定的原理和方法，并用羥胺三氯化鐵顯色法測定魚類血液和腦組織中膽堿酯酶活力。多種神經(jīng)毒物，如有機磷農(nóng)藥、氨基甲酸酯農(nóng)藥、毒扁豆堿及煙堿等對膽堿酯酶都具有強烈的抑制作用，從而破壞神經(jīng)沖動的正常傳遞。因此，可以通過測定魚類血液和腦組織中膽堿酯酶活力的抑制程度，了解水體受有機磷農(nóng)藥及其它污染的程度，同時掌握水體污染對魚類的影響。（二）主要儀器設(shè)備分光光度計，恒溫水浴，勻漿器

35、，冰盤，解剖器械。 附件 魚腦組織（或血液）膽堿酯酶活力的測定目的與原理掌握膽堿酯酶活力測定的原理和方法，并用羥胺三氯化鐵顯色法測定魚腦膽堿酯酶活力。在神經(jīng)沖動的傳遞過程中，乙酰膽堿是重要的化學(xué)因素。在神經(jīng)系統(tǒng)中，存在著催化合成乙酰膽堿的膽堿乙酰化酶和催化乙酰膽堿水解的膽堿酯酶。 在一定溫度、pH條件下，酶的反應(yīng)速率與酶的量、反應(yīng)速率，以及作用時間成近似的線性關(guān)系。通過測定所加入乙酰膽堿在膽堿酯酶作用下減少的量，就可得知膽堿酯酶活力的水平。未經(jīng)膽堿酯酶水解的乙酰膽堿與羥氨作用生成乙酰羥氨，乙酰羥氨酸性條件下與三氯化鐵(FeCl3)作用生成深褐色的絡(luò)合物，其顏色與乙酰膽堿的濃度成正比，因而可以進

36、行比色測定。試劑：1、磷酸鹽緩沖液（pH7.2）（1）稱取23.752克磷酸氫二鈉（Na2HPO4·2H2O） 溶于蒸餾水并稀釋至1000ml。（2）稱取18.156g磷酸二氫鉀(KH2PO4) 溶于蒸餾水稀釋至1000ml。?。?）液72ml和(2)液28ml，混合即成。2、乙酰膽堿底物 稱取乙酰膽堿0.0905g，加0.001M醋酸緩沖液（pH為4.5）至10ml，即成0.04mol貯備液，置冰箱內(nèi)保存（不超過2星期）。臨用時取0.04M貯備液1份，加9份磷酸鹽緩沖液配制成0.004mol使用液。3、1M鹽酸羥氨溶液 稱取13.9克鹽酸羥氨，溶于蒸餾水后稀釋200ml。室溫高于3

37、00C時，應(yīng)置于冰箱內(nèi)。4、14NaOH 稱取14gNaOH，加蒸餾水溶解至100ml。5、10三氯乙酸溶液 稱取10g三氯乙酸，溶于10N鹽酸溶液，再稀釋到100ml。6、10三氯化鐵溶液 稱取三氯化鐵10.0g，加0.83ml濃鹽酸和10ml蒸餾水，待全部溶解后加蒸餾水到100ml。7、0.001mol醋酸緩沖液（pH4.5） 稱取醋酸鈉（NaAC·3H2O）13.6g，加蒸餾水溶解后再稀釋至100ml即成0.1mol。量取冰醋酸0.58ml加水至100ml即配成0.1mol。取前液57ml、后液43ml混合后再以蒸餾水稀釋100倍即成。8、堿性羥胺溶液 臨用前20分鐘配制，將1

38、mol鹽酸羥氨與14NaOH液等體積混合即成。材料：魚腦組織（或魚血液）器材：分光光度計，恒溫水浴，勻漿器，冰盤，解剖器械。實驗步驟1、取新鮮或20冷凍魚，從魚頭背面剖骨，仔細(xì)取出完整的魚腦，用濾紙輕輕吸去表面體液，剪碎、稱重，在冰浴下加1毫升磷酸緩沖液勻漿，再用磷酸緩沖液稀釋成每ml含2mg腦組織液。2、按下表加入試劑試劑試 管樣品管對照管空白管標(biāo)準(zhǔn)管乙酰膽堿（ml）磷酸緩沖液（ml）魚腦組織液（ml）1.01.01.02.01.01.03、準(zhǔn)確保溫（如20、25、或30）20分鐘，取出試管，立即每管加堿性羥胺溶液4.0ml。充分搖勻，并在對照管加1ml魚腦組織液。4、加10三氯乙酸溶液2.

39、0ml，充分搖勻，然后每管再加10三氯化鐵溶液2.0毫升，充分搖勻。5、各管試液用濾紙過濾，以除蛋白質(zhì)。6、顯色后將所得濾液置2cm比色管，在525nm波長下以空白管為0測量其余各管的光密度。（對照管光密度樣品管光密度）標(biāo)準(zhǔn)管光密度7、計算腦膽堿酯酶活力 ×4÷2×60/20（對照管光密度樣品管光密度）標(biāo)準(zhǔn)管光密度= ×6膽堿酯酶活力以每mg腦組織每小時催化水解乙酰膽堿的g分子數(shù)表示（g/mg/min）。方法評估本實驗是采用測定酶作用后剩余基質(zhì)的方法即羥胺三氯化鐵法。由于乙酰膽堿酯酶的活力受基質(zhì)濃度的影響，本法的消耗基質(zhì)，應(yīng)過量加入3070，在此范圍外易

40、產(chǎn)生誤差。此方法在國內(nèi)應(yīng)用較普遍。應(yīng)用意義多種神經(jīng)毒物，如有機磷農(nóng)藥、氨基甲酸酯農(nóng)藥、毒扁豆堿及煙堿等對膽堿酯酶都具有強烈的抑制作用，從而破壞神經(jīng)沖動的正常傳遞。因此，可以通過測定魚腦膽堿酯酶活力的抑制程度，了解水體受有機磷農(nóng)藥及其它污染的程度，同時掌握水體污染對魚類等水生動物的影響。注意事項1、測定膽堿酯酶活力時溫度、反應(yīng)時間應(yīng)嚴(yán)格控制。2、由于魚腦膽堿酯酶的活力除受有機污染物影響外，水體中多種因素也對該酶有一定影響，正常魚腦膽堿酯酶活力有30%的波動。因此測定時一定要有足夠的樣品數(shù)量，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。思考題1、試述膽堿酯酶的作用原理？2、取腦的酶組織液時為什么要用冰??？3、當(dāng)水體受

41、有機磷污染時，魚腦膽堿酯酶活力有何變化？為什么？實驗六 幾種激素對魚類血糖調(diào)節(jié)的分析實驗項目學(xué)時：5* 實驗要求： 必修 選修 一、實驗?zāi)康募耙螅赫莆锗徏妆桨贩y定血糖的原理和操作技術(shù)，并用此法測定魚類等水產(chǎn)動物的血糖含量。掌握魚類血糖調(diào)節(jié)的生理機制。二、實驗基本原理：魚類的血糖受激素的調(diào)節(jié)而處于動態(tài)平衡之中。參與調(diào)節(jié)或影響血糖的激素很多，如胰島素、胰高血糖素、腎上腺素以及甲狀腺、垂體、腎上腺皮質(zhì)分泌的激素。測定血糖的方法很多，最精確的方法是葡萄糖氧化酶法。但是限于條件，本實驗采用鄰苯甲胺直接測定法。其原理是：血清中的葡萄糖在熱的醋酸溶液中與鄰甲苯胺縮合成藍(lán)色（或藍(lán)綠色）西夫氏堿。通過比色并與同樣處理的標(biāo)準(zhǔn)液進行比較，便可計算出糖的含量。其反應(yīng)如下：三、主要儀器設(shè)備及實驗耗材：試劑：1、鄰甲苯胺試劑：稱取硫脲（A.R.）2.5g，溶于冰醋酸（A.R.）750ml中。將此溶液轉(zhuǎn)入1L容量瓶內(nèi)，加鄰甲苯胺150ml，2.4硼酸溶液100ml,再加冰醋酸至1L刻度，置棕色瓶中，至少可應(yīng)用2個月。2、葡萄糖貯存標(biāo)準(zhǔn)液（10mg/ml）：將少量無水葡萄糖（A.R.或C.P.）置于硫酸干燥器內(nèi)一夜。精確稱取此葡萄糖1.000g，以飽和苯甲酸溶液溶解并轉(zhuǎn)移入100ml容量瓶內(nèi)，再以飽和苯甲酸溶液稀釋至100ml刻度。置冰箱中可長期保存。3、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（1.