水中細菌總數(shù)和大腸菌群地檢測

1、實用標準文檔水中細菌總數(shù)和大腸菌群的檢測(-)實驗?zāi)康?1) 了解和學習水中細菌總數(shù)和大腸菌群的測定原理和測定意義。(2) 學習和掌握用稀釋平板計數(shù)法測定水中細菌總數(shù)的方法。(3) 學習和掌握水中大腸菌群的檢測方法。(二)實驗原理水是微生物廣泛分布的天然環(huán)境。各種天然水中常含有一定數(shù)量的微生物。水中 微生物的主要來源有：水中的水生性微生物(如光合藻類)、來自土壤徑流、降雨的外來菌群和 來自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中的病原菌主要來源于人和動物的傳染性排泄物。水的微生物學的檢驗，特別是腸道細菌的檢驗，在保證飲水安全和控制傳染病上有著重 要意義，同時也是評價水質(zhì)狀況的重要指標。國家飲用水標

2、準規(guī)定，飲用水中大腸菌群數(shù)每升中 不超過3個，細菌總數(shù)每mL不超過100個。所謂細菌總數(shù)是指1mL或1g檢樣中所含細菌菌落的總數(shù)，所用的方法是稀釋平板計數(shù) 法，由于計算的是平板上形成的菌落(colony-forming unit，cfu)數(shù)，故其單位應(yīng)是 cfu/g(mL)。它反映的是檢樣中活菌的數(shù)量。所謂大腸菌群，是指在37C 24h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽 胞桿菌的總稱，主要由腸桿菌科中四個屬內(nèi)的細菌組成，即埃希氏桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、克 雷伯氏菌屬和腸桿菌屬。水的大腸菌群數(shù)是指100mL水檢樣內(nèi)含有的大腸菌群實際數(shù)值，以大腸菌群 最近似數(shù) (MPN表示。在正常情況

3、下，腸道中主要有大腸菌群、糞鏈球菌和厭氧芽胞桿菌等多種細菌。 這些細菌都可隨人畜排泄物進入水源，由于大腸菌群在腸道內(nèi)數(shù)量最多，所以，水源中大腸菌 群的數(shù)量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一項重要指標。目前，國際上已公認大腸菌群 的存在是糞便污染的指標。因而對飲用水必須進行大腸菌群的檢查。水中大腸菌群的檢驗方法，常用多管發(fā)酵法和濾膜法。多管發(fā)酵法可運用于各種水樣的 檢驗，但操作繁瑣，需要時間長。濾膜法僅適用于自來水和深井水，操作簡單、快速，但不適用 于雜質(zhì)較多、易于阻塞濾孔的水樣。(三)實驗器材(1)菌落總數(shù)的測定：文案大全實用標準文檔1）培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白陳瓊脂培養(yǎng)基，無菌生理鹽水。2）器材

4、：滅菌三角瓶，滅菌的具塞三角瓶，滅菌平皿，滅菌吸管，滅菌試管（2）大腸菌群的測定；1）培養(yǎng)基：乳糖膽鹽蛋白陳培養(yǎng)基：蛋白陳20g,豬膽鹽（或牛、羊膽鹽）5g，乳糖10g, 0.04%溟甲酚紫水溶液25mL水1000mL, pH7.4。制法：將蛋白陳、膽鹽從乳糖溶于水中，校正pH,加入指示劑，分裝，每瓶50mL或每管5mL，并倒置放入一個杜氏小管，1159滅菌15min。雙倍或三倍乳糖膽鹽蛋白陳培養(yǎng)基：除水以外，其余成分加倍或取三倍用量。伊紅美藍 瓊脂培養(yǎng)基：蛋白陳10g，乳糖10g，K2HPQ2g，2%伊紅水溶液201/11, 0.65 %美藍水溶液IOmL， 瓊脂 17g，水 1000mL

5、pH7.1。制法：將蛋白麻、磷酸鹽和瓊脂溶于水中，校正pH后分裝.121C滅菌15min備用。臨用 時加入乳糖并熔化瓊脂，冷至50-55 C，加入伊紅和美藍溶液，搖勻，傾注平板。乳糖發(fā)酵管：除不加膽鹽外-其余同乳糖膽鹽蛋白陳培養(yǎng)基。2）器材：滅菌三角瓶，滅菌的具塞三角瓶，滅菌平皿，滅菌吸管，滅菌試管等。（四）實驗方法（1）水樣的采集：1）自來水：先將自來水龍頭用酒精燈火焰灼燒滅菌，再開放水龍頭使水流5min，以滅菌三 角瓶接取水樣以備分析。2）池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸邊5m處，取距水面15cm的深層水樣，先將滅菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過來，除去玻璃塞，水即流入 瓶

6、中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再從水中取出。如果不能在2h內(nèi)檢測的，需放入冰箱中保存。（2）細菌總數(shù)的測定：1）水樣稀釋及培養(yǎng)：文案大全實用標準文檔 按無菌操作法，將水樣作10倍系列稀釋： 根據(jù)對水樣污染情況的估計，選擇2-3個適宜稀釋度（飲用水如自來水、深井水等，一 般選擇1、1 ：10兩種濃度；水源水如河水等，比較清潔的可選擇1:10、1 ：100、1：1000 H 種稀釋度；污染水一被選擇1:100、1:1000、1:10000三種稀釋度），吸取1mL稀釋液于 滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度作3個重復(fù)。 將熔化后保溫度45C的牛肉膏蛋白陳瓊脂培養(yǎng)基倒平皿，每皿約15mL并趁熱轉(zhuǎn)動平皿混合均勻。 待瓊脂

7、凝固后，將平皿倒置于37七培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24士 1h后取出，計算平皿內(nèi)菌落 數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得1mL水樣中所含的細菌菌落總數(shù)。2）計算方法：作平板計數(shù)時，可用肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各 平板的菌落數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)。3）計數(shù)的報告：平板菌落數(shù)的選擇：選取菌落數(shù)在30-300之間的平板作為菌落總數(shù)測定標準。一個稀釋度使用兩個重復(fù)時， 應(yīng)選取兩個平板的平均數(shù)。如果一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀 菌落生長的平板計數(shù)作為該稀釋度的菌數(shù)。若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分 布又很均勻，可計算半個平板后乘2以代表整個平板的菌落數(shù)

8、。稀釋度的選擇：a.應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的稀釋度，乘以該稀釋倍數(shù)報告之（表1例1）。b 若有兩個稀釋度，其生長的菌落數(shù)均在30-300之間，則視二者之比如何來決定。若 其比值小于2，應(yīng)報告其平均數(shù)；若比值大于2，則報告其中較小的數(shù)字（I例2、例3）。c 若所有稀釋度的平均菌落均大于300，則應(yīng)按稀釋倍數(shù)最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍 數(shù)報告之（I例4）。d 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30、則應(yīng)按稀釋倍數(shù)最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍 數(shù)報告之（1例5）。e.若所有稀釋度均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告之（表1 例 6）。f.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30-300之間，

9、則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以該稀釋倍數(shù)報告之（表I例7）。細菌總數(shù)的報告：細菌的菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按其實有效報告；大于100時，用二位有效數(shù)字，在二位有 效數(shù)字后面的數(shù)字，以四舍五人方法修約。為了縮短數(shù)字后面的0的個數(shù)，可用10的指數(shù)來表 示，如表1 “報告方式” 一欄所示。（3）大腸菌群的測定（多管發(fā)酵法）：表1稀釋度的選擇及細菌數(shù)報告方式稀釋度及菌落數(shù)兩稀釋菌落總數(shù)/（cfu/g報告方式（菌落總數(shù)）IO1IO210-3度之比或 cfu/mL )/ (cfu/mL 或 cfu/g )1多不可計16420一1640016000 或 1.6 x IO2多不可計295461.6377

10、5038000 或 3.8 x 1043多不可計271602.22710027000 或 2.7 X 1054多不可計多不可計313*313000310000 或 3.1 X 10527115一270270或6000一V 10V 107多不可計30512一3050031000 或 3.1 x 1041）生活飲用水或食品生產(chǎn)用水的檢驗：初步發(fā)酵試驗：在2個各裝有50mL的3倍濃縮乳糖膽鹽蛋白陳培養(yǎng)液（可稱為三倍乳糖膽鹽）的三角 瓶中（內(nèi)有倒置杜氏小管），以無菌操作各加水樣100mL在10支裝有5mL的三倍乳糖膽鹽 的發(fā)酵試管中（內(nèi)有倒置小管），以無菌操作各加入水樣10mL如果飲用水的大腸菌群數(shù)變

11、異 不大，也可以接種3份100m冰樣。搖勻后，37 培養(yǎng)24h。平板分離：經(jīng)24h培養(yǎng)后，將產(chǎn)酸產(chǎn)氣及只產(chǎn)酸的發(fā)酵管（瓶），分別劃線接種于伊紅美藍瓊脂平板 （EMB培養(yǎng)基）上，37c培養(yǎng)18 24h。大腸菌群在EMB平板上，菌落呈紫黑色，具有或略帶有或不帶有金屬光澤，或者呈淡紫紅色，僅中心顏色較深；挑取符合上述特征的 菌落進行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。復(fù)發(fā)酵試驗：將革蘭氏陰性無芽胞桿菌的菌落的剩余部分接于單倍乳糖發(fā)酵管中，為防止遺漏，每管可接種來自 同一初發(fā)酵管的平板上同類型菌落1 3個，37c培養(yǎng)24h,如果產(chǎn)酸又產(chǎn)氣者，即證實有大腸菌群 存在。報告：根據(jù)證實有大腸菌群存在的復(fù)發(fā)酵管的陽性管數(shù)

12、，查表107-2 （或表107-3），報告每升水樣中 的大腸菌群數(shù)（MPN）。2）水源水的檢驗：用于檢驗的水樣量，應(yīng)根據(jù)預(yù)計水源水的污染程度選用下列各量。 嚴重污染水：1，0. 1，0.01. 0. OOImL各1份。中度污染水：10. 1，0. 1，0. 01mL各1份。輕度污染水：100，10，1，0. 1mL各I份。大腸菌群變異不大的水源水：10mLI0份。表2大腸菌群檢索表（飲用水）012備注每升水樣中大腸菌群數(shù)0V3411138182713273111838接種水樣總量4142452300mL( 1005183070mL2 份，106223692mL10 份)727431208315

13、1161文案大全實用標準文檔104069> 230表3大腸困群數(shù)變異不大的飲用水陽性管數(shù)0123接種水樣總量每升水樣中大腸菌群數(shù)V3411> 18300mL(3 份 100 mL)表4大腸菌群檢索表（嚴重污染水）接種水樣量/mL每升水樣中備注10.10.010.001大腸菌群數(shù)一V900一+900+900+一950+1800+一+1900接種水樣總+2200量為1.111+一2300(1, 0.1 ,+28000.01 ,+一+92000.001mL 各+9400一份）+18000+一23000+96000+238000+>238000表5大腸菌群檢索表（中度污染水）接種水樣

14、量/mL每升水樣中備注1010.10.01大腸菌群數(shù)文案大全實用標準文檔一一一V90一一+90一+90一+一95一+180+190接種水樣總+220量為11.11+-230(10, 1,+2800.1 , 0.01+,-+920mL各一份）+940+1800+一2300+一+9600+23800+>23800表6大腸菌群檢索表（輕度污染水）接種水樣量/mL每升水樣中備注10010 10.1大腸菌群數(shù) V9一+9+一9接種水樣總+»一9.5量為111.1+18(100, 10,+»+191, 0.1mL 各+一22一份）+一23+28+92+一94+180+一230+9

15、60+一2380+> 2380表7大腸菌群變異不大的水源水陽性管數(shù)012345678910每升水樣中 V 10112236516992120160230 > 230大腸菌群數(shù)備注接種水樣總量100mL （10mL1 （份）操作步驟同生活用水或食品生產(chǎn)用水的檢驗。同時應(yīng)注意，接種量1 mL及1 mL以內(nèi)用單倍乳糖膽鹽發(fā)酵管；接種量在1 mL以上者，應(yīng)保證接種后發(fā)醉管（瓶）中的總 液體量為單倍培養(yǎng)液量。然后根據(jù)證實有大腸菌群存在的陽性管（瓶）數(shù)，查表1074、表107-5、表107-6或表1077，報告每升水樣中的大腸菌群數(shù)（MPN）,附：濾膜法濾膜法所使用的濾膜是一種微孔濾膜。將水樣

16、注入已滅菌的放有濾膜的濾器中，經(jīng)過抽 濾，細菌即被均勻地截留在膜上，然后將濾膜貼于大腸菌群選擇性培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。再鑒定 濾膜上生長的大腸菌群的菌落，計算出每升水樣中含有的大腸菌群數(shù)（MPN>（1）準備工作：1） 濾膜滅菌：將3號濾膜放入燒杯中，加入蒸儲水，置于沸水浴中蒸煮滅菌3次，每次15min。前兩次煮沸后需換無菌水洗滌2-3次，以除去殘留溶劑。2）濾器滅菌：準備容量為500mL的濾器，用點燃的酒精棉球火焰滅菌,也可用121c高壓滅菌20min。Q、 拉蕓 。) 上口開Q 拉蕓。)工口六將品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基放入37C培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)溫30-60min。(2)過濾水樣：1) 用無菌鐐子夾取滅菌濾膜邊緣部分，將祖糙面向上貼放于已滅菌的濾床上，輕輕地固定好濾器漏斗。水樣搖勻后，取333mL注入濾器中，加蓋，打開濾器閥門，在-50kPa壓力下進行抽濾。2) 水樣濾完后再抽氣約5s，關(guān)上濾器閥門，取下濾器，用無菌鏡子夾取濾膜