細(xì)胞培養(yǎng)兼轉(zhuǎn)染步驟

1、細(xì)胞復(fù)蘇1 準(zhǔn)備好超凈臺(tái)、吸管、離心管、40C的水2. 從液氮中取出要復(fù)蘇的細(xì)胞，置于準(zhǔn)備好的37° C中速溶（劇烈搖晃）3. 5ml的離心管中加入4ml的完全培養(yǎng)液（DMEM+抗+血清）即平時(shí)用于傳代的10%FBS勺培養(yǎng)液，再加入溶解的細(xì)胞液4. lOOOrpm, 5min,離心，平時(shí)常用 900rpm 5min.5棄上清，加入4ml的完全培養(yǎng)液，吹散細(xì)胞6. 分裝兩瓶中，然后每瓶補(bǔ)充培養(yǎng)液至衛(wèi)nl/瓶7. 37 C二氧化碳培養(yǎng)箱松蓋培養(yǎng)，48h|n做傳代二.細(xì)胞傳代1. 培養(yǎng)48h內(nèi)的細(xì)胞，若瓶壁上已長(zhǎng)滿細(xì)胞則應(yīng)進(jìn)行傳代2. 吸去瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液3. 加入lml的EDTA讓EDTA可

2、以鋪過所有細(xì)胞，約作用10s4. 吸去EDTA加入lml的0. 25 %的胰酶，讓胰酶沒過所有細(xì)胞（可輕輕晃動(dòng)）,作用 約2mino在顯微鏡下觀察細(xì)胞，若已由成片的細(xì)胞變成單個(gè)細(xì)胞，則消 化完成5. 吸去胰酶，加入4ml的培養(yǎng)液。用lml的吸管吹打瓶壁，讓細(xì)胞脫落，吹打成 單 個(gè)細(xì)胞懸液6. 將細(xì)胞懸液分成兩瓶，并將每瓶培養(yǎng)液補(bǔ)充至5ml7. 37 C二氧化碳培養(yǎng)箱松蓋培養(yǎng)，48h后做傳代細(xì)胞凍存?zhèn)鞔翑?shù)瓶的細(xì)胞且長(zhǎng)滿瓶壁即可傳代和凍存1 把細(xì)胞消化（與細(xì)胞傳代步驟相同），計(jì)數(shù)。把細(xì)胞懸液合并到5ml離心管中， 混勻、lOOOrpm,離心 5min2. 棄上清，依細(xì)胞數(shù)加入培養(yǎng)液（凍存管每管細(xì)

3、胞數(shù)要達(dá)到4X ICT個(gè)）3. 分裝到凍存管內(nèi)（凍存管要預(yù)先冷卻）4. 細(xì)胞凍存液的成分為：DMSO 100ul培養(yǎng)液600 ul （細(xì)胞懸液），血清300ul5. 將分好的凍存管細(xì)胞標(biāo)上名稱、日期等放到凍存盒內(nèi)擰好6. 先置于凍存盒內(nèi)-80 C冰箱中過夜，再轉(zhuǎn)到液氮中凍存四分細(xì)胞傳代培養(yǎng)至一定數(shù)目且生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞即可分到12孔板內(nèi)培養(yǎng)，為下一步轉(zhuǎn)染做準(zhǔn)備1. 把細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液計(jì)算細(xì)胞數(shù)2. 把細(xì)胞分到12孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)至少要達(dá)到3X 10$個(gè)/ ml,并補(bǔ)充培養(yǎng)液至lml/孔3. 37 T二氧化碳培養(yǎng)箱松蓋培養(yǎng)，24h內(nèi)做轉(zhuǎn)染（看細(xì)胞狀況）五.酶切酶切體系:酶切條件:電泳鑒定出01

4、0X NEB BufferBspQlSealPiasmid37 C50 r35卩10卩3卩2卩50卩10小時(shí)過夜六轉(zhuǎn)染（瞬時(shí)轉(zhuǎn)染）12孔板中培養(yǎng)24h內(nèi)的細(xì)胞用于做轉(zhuǎn)染1. 吸去完全培養(yǎng)基，加入無血清無雙抗的950ul DMEM加入時(shí)應(yīng)輕輕從側(cè)壁加入2. 加入50ul的轉(zhuǎn)染液（不可晃動(dòng)）3培養(yǎng)至4-8個(gè)小時(shí)后換成完全培養(yǎng)液，換液時(shí)應(yīng)輕柔，不可晃動(dòng)4. 37 T二氧化碳培養(yǎng)箱松蓋培養(yǎng)，72h后細(xì)胞裂解注:（1）計(jì)算質(zhì)粒的量,每孔達(dá)到lug（2）轉(zhuǎn)染液：新印管中l(wèi)OOul無血清培養(yǎng)基，2ug的質(zhì)粒，4ul Fugene七.細(xì)胞裂解轉(zhuǎn)染72h后應(yīng)取細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞裂解液檢測(cè)轉(zhuǎn)染是否成功1. 吸出細(xì)胞

5、培養(yǎng)液到一新的印管中，-20 C保存，待做ELISA2. 用1ml/孔的IX PBS洗孔，從側(cè)壁加入，輕輕晃動(dòng)， 除去PBS3. 加入（PBS+O. 3% NP40 500ul每孔，晃動(dòng)，細(xì)胞裂解，此即為細(xì)胞裂解液4. 把細(xì)胞裂解液吸到一新的印管中，4500rpm 5min離心，除去細(xì)胞碎片和雜質(zhì)5. 離心后吸上清（450ul）到一新管中，-20 C保存，待做QT-PCR注：做QT-PCF前準(zhǔn)備（釋放HBV DNAPCRt 中：buffer 60ul,細(xì)胞裂解液 40ulPCR 儀中：65° C 35min, 94 C 17min.八鑒定HBsAg和HBeAg的檢測(cè)采用ELISA方法

6、檢測(cè)HBsAg和HBeAg的表達(dá)熒光定量PCR檢測(cè)HBV DNA （避光操作）用蛋白酶K法提取病毒核心顆粒PCR反應(yīng)體系：Mix12. 5 卩引物10. 5 卩 1 0.5 卩 1 0.5 卩引物2模板門TaqPCR反應(yīng)程序：94 C3 min94 C15S60 C15 S 30循環(huán)72 C15S每個(gè)循環(huán)采集熒光，程序運(yùn)行結(jié)束后電泳鑒定傳代至一定數(shù)目且生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞即可分到6孔板進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（穩(wěn)定轉(zhuǎn)染）1、消化（此時(shí)用的培養(yǎng)液成分為：DMEM + FBS）2、計(jì)數(shù)3、把細(xì)胞分到6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)要達(dá)到至少3X 105,并補(bǔ)充培養(yǎng)液至2 ml/孑L, 37C, CQ孵箱，培養(yǎng)。24 h內(nèi)做轉(zhuǎn)染

7、計(jì)算公式：（每孔要加入的消化液體積數(shù)X計(jì)數(shù)的濃度）/2m匸每孔要求的細(xì)胞數(shù)例 如:計(jì)數(shù)的濃度為5X 105個(gè)/ ml,每孔要求的細(xì)胞數(shù)為2. 5X105個(gè)，每孔要求的總體 積為2 ml,則每孔需加如lml的消化液.轉(zhuǎn)染（穩(wěn)定轉(zhuǎn)染）1、轉(zhuǎn)染液成分配制（每孔）:Opt iMEM100 卩 1Fugene5卩1質(zhì)粒1卩gPss-neo 質(zhì)粒1卩g配好后輕輕混勻（Ps2-neo質(zhì)粒是用于共轉(zhuǎn)染的，有G418抗性），F(xiàn)ugene的體積量與質(zhì)粒的微克數(shù)有一定的比例（一般Fugene:質(zhì)粒=3ul:2ug）2、直接把配好的轉(zhuǎn)染液加入培養(yǎng)板，加的時(shí)候應(yīng)該一滴滴加入，并均勻加到各 各位置，空白對(duì)照空什么都不加，

8、無需換培養(yǎng)液3、培養(yǎng)到第三天培養(yǎng)液換成成分為：DMEM + FBS +雙抗+G418的培養(yǎng)液 4、G418使用濃度（終濃度）為:600卩g/ml維持1、以后每隔三天換一次液，換新培養(yǎng)液時(shí)先用PBS洗一次細(xì)胞。小心污染2、一般24天后有細(xì)胞群落出現(xiàn)（HepG2 ）3、當(dāng)細(xì)胞克隆群落長(zhǎng)好以后（細(xì)胞有重疊）就可以對(duì)其進(jìn)行分離克隆群落分離1、在顯微鏡下找出要分離的克隆群落，用標(biāo)記筆在板下畫個(gè)做標(biāo)記2、吸去培養(yǎng)液，用小槍（20 Q1吸10卩胰酶滴加到做好標(biāo)記的克隆群落上，作用5秒鐘3、用小槍（20卩）1吸10 "培養(yǎng)液在克隆群落上面輕輕吹出再吸上來，但不要 全 部吹出完10 11,重復(fù)45次輕輕吹出吸上即可把克隆群落吸上來注:分離的過程要快，否則其他克隆群落會(huì)因?yàn)楦稍锒劳?。使用胰酶和培養(yǎng)液 可以分5001到EP管中，這樣可以預(yù)防污染，方便使用省時(shí)。4、把吸到的克隆群落加到預(yù)先加有200 1培養(yǎng)液的48孔板上吹散培養(yǎng)，此時(shí)培 養(yǎng)液G4 1 8濃度為4001 g/ml ,有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)（我的長(zhǎng)出的克隆很多，所以每種克隆分離了 12個(gè)克隆群落。）5、當(dāng)48孔板長(zhǎng)滿長(zhǎng)密后，再傳到24孔板，此時(shí)培養(yǎng)液G4 1 8濃度改為6001g/ml6、24孔板長(zhǎng)滿長(zhǎng)密后，取培養(yǎng)上清做ELISA7、取ELISA吉果好的（值較高的）孔傳到6孔板（不傳到12空