熒光PCR檢測(cè)原理

1、熒光pcK測(cè)原理 實(shí)時(shí)熒光定量PCF技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團(tuán)，利用 熒光信號(hào)來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板濃度進(jìn)行定 量分析。其特點(diǎn)有：(1) 用產(chǎn)生熒光信號(hào)的指示劑顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的量，進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)連續(xù)的熒光監(jiān) 測(cè)，避免終點(diǎn)定量的不準(zhǔn)確性，并且消除了標(biāo)本和產(chǎn)物的污染，且無(wú)復(fù)雜的產(chǎn) 物后續(xù)處理過(guò)程。(2) 熒光信號(hào)通過(guò)熒光染料嵌入雙鏈 DNA或熒光探針特異結(jié)合木得檢測(cè)物等方法獲得，打打提高了檢測(cè)的靈敏度、特異性和精確性。Real-time O-PCF可以應(yīng)用于mRNA表達(dá)的研究、DNA拷貝數(shù)的檢測(cè)、單核苷酸多態(tài)性的測(cè)定、細(xì)胞因子 的表達(dá)分析、腫瘤耐藥基

2、因表達(dá)的研究以及病毒感染的定量監(jiān)測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCF技術(shù)的基本原理在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團(tuán)，這些熒光物質(zhì)有其 特定的波長(zhǎng)。儀器可以自動(dòng)檢出，利用熒光信號(hào)積累，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,在PCR循環(huán)中，測(cè)量的信號(hào)將作為熒光閾值的坐標(biāo)。并且引入一個(gè)一一Ct值(Threshold cycle )概念，Ct值是指產(chǎn)生可被檢測(cè)到得熒光信號(hào)所需的最小循 環(huán)數(shù)，是在PCR循環(huán)過(guò)程中熒光信號(hào)由本底開(kāi)始進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì) 應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。熒光閾值相當(dāng)于基線熒光信號(hào)的平均信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10倍。一般認(rèn)為在熒光閾 值以上所測(cè)出的熒光信號(hào)是一個(gè)可信的信號(hào)，可以用于定義一個(gè)樣本的Ct值。通常用不同

3、濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品的 Ct值來(lái)產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算相對(duì)方程式。方程式的斜度可以用來(lái)檢查 PCR的效率，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸分析需要存 在一個(gè)高相關(guān)系數(shù)(R2> 0.99 )，這樣才能認(rèn)為實(shí)驗(yàn)的過(guò)程和數(shù)據(jù)是可信的， 使用這個(gè)方程式計(jì)算出未知樣本的初始模板量。實(shí)時(shí)熒光定量PCRK都有軟件，可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線中自動(dòng)地計(jì)算出未知樣本的初始模板量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用1. 基因工程研究領(lǐng)域 基因表達(dá)研究：對(duì)B地中海貧血癥患者B與丫珠蛋白mRNAK平進(jìn)行檢 測(cè)，其結(jié)果特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確，為了解 B地中海貧血的分子病理機(jī)制及其臨 床診斷提供了可靠的檢測(cè)數(shù)據(jù)。 轉(zhuǎn)基因研究：利用兩種發(fā)光探針及適當(dāng)?shù)难?/p>

4、環(huán)閾值，擴(kuò)增一個(gè)轉(zhuǎn)移后的基因和一個(gè)對(duì)照基因，以分析轉(zhuǎn)基因老鼠接合性。該方法為45個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的同型結(jié)合及異質(zhì)結(jié)合提供了明確的鑒定結(jié)果。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCRi測(cè)，同型結(jié)合 的異質(zhì)接合動(dòng)物交配后其子代中轉(zhuǎn)基因的傳遞情況符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。這項(xiàng) 技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物繁育及基因劑量功能效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中將有很大的用途。 單核苷酸多態(tài)性（SNP及突變分析：實(shí)時(shí)熒光定量 PCF一個(gè)誘人的應(yīng)用前 景是用于檢測(cè)基于兩條探針和基因組的不穩(wěn)定性。基因突變基于兩條探針，一 條探針橫跨突變點(diǎn)，另一條為錨定探針，與無(wú)突變位點(diǎn)的靶序列雜交。兩條探 針用兩種不同的發(fā)光基團(tuán)標(biāo)記。如靶序列中無(wú)突變，探針雜交便完全配對(duì)，如 有突變，則探針與靶

5、序列不完全配對(duì)，會(huì)降低雜交體得穩(wěn)定性，從而降低其熔 解溫度（Tn）。這樣便可對(duì)突變和多態(tài)性進(jìn)行分析。2. 醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域 病原體檢測(cè)：由于實(shí)時(shí)熒光定量 PCF方法可靠性和重復(fù)性好，并且操作簡(jiǎn) 便、快速、結(jié)果判斷客觀，目前，人們用此方法對(duì)人類(lèi)免疫缺陷病毒、肝炎病 毒、結(jié)核桿菌、巨細(xì)胞病毒、EB病毒、流感病毒A、流感病毒B等病原體的檢 測(cè)。熒光定量PCR可世后的幾年中，積累了大量有關(guān)病原體核酸量與感染性疾 病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后之間關(guān)系的資料，這些研究資料不斷豐富，將形成感染性 疾病的臨床分子診斷標(biāo)準(zhǔn)。 藥物療效考核：利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCF技術(shù)檢測(cè)臨床樣品中與抗藥性相關(guān) 的基因的表達(dá)。結(jié)果證明，實(shí)時(shí)熒

6、光定量 PCF系統(tǒng)是定量檢測(cè)抗藥基因表達(dá)的 可靠方法，應(yīng)用這種技術(shù)可以預(yù)測(cè)化療將引起的反應(yīng)。 腫瘤基因檢測(cè)：腫瘤的本質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)基因發(fā)生了變化，是一種多基因異常 的疾病，這些異常變化用實(shí)時(shí)熒光定量 PCF方法都可以檢測(cè)出來(lái)。目前用此方法進(jìn)行過(guò)端粒酶hTERT基因、慢性粒細(xì)胞性白血病 bcr/abl融合基因、腫瘤 MDR基因、白血病 WTI基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSMS因、腫瘤相關(guān)的病 毒基因等多種基因的表達(dá)檢測(cè)。隨著與腫瘤相關(guān)的新基因的不斷發(fā)現(xiàn)。熒光定 量PCF技術(shù)將會(huì)在腫瘤的研究中發(fā)揮更大的作用。3. 其他領(lǐng)域用實(shí)時(shí)熒光定量PCF方法對(duì)免疫組分進(jìn)行分析是其應(yīng)用的重要方面。 所謂實(shí)時(shí)熒光定

7、量PCF技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光 信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析 的方法。 檢測(cè)方法I.SYBRGreenl 法：在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYB啖光染料，SYB啖光染料特異性地?fù)饺?DNA 雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBF染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)， 從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR定量 PCFT增熒光曲線圖PCR產(chǎn)物熔解曲線圖（單一峰圖表明 PCRT增產(chǎn)物的單一性）2. TaqMan探針?lè)ǎ禾结樛暾麜r(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCFT增時(shí)，Taq酶的5' -3

8、'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從 而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNAS，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與 PCF產(chǎn)物的形成完全同步。服務(wù)流程1. 客戶認(rèn)真寫(xiě)好訂單，提供待檢基因相關(guān)信息；2. 簽訂技術(shù)服務(wù)合同，支付預(yù)付款（30-50%）;3. 設(shè)計(jì)合成定量PCR引物（或客戶提供文獻(xiàn)引物委托本公司合成）；4. DNA/RNA的抽提、定量、RNA反轉(zhuǎn)錄；5. PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)，主要檢測(cè)引物的特異性和擴(kuò)增效率；6. 正式定量實(shí)驗(yàn)：對(duì)所有樣品上機(jī)檢測(cè)；7. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)分析，形成報(bào)告。收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)惠包干價(jià)：120元/樣/基因（SYBRgr

9、eenl法，相對(duì)定量）（含RNA提取，反轉(zhuǎn)錄，引物合成費(fèi)用，上機(jī)測(cè)試費(fèi)用（3個(gè)重復(fù)）；一個(gè)內(nèi)參 免費(fèi)（內(nèi)參3個(gè)重復(fù)）Ct值（Cycle threshold ，循環(huán)閾值）的含義為：每個(gè) 反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（如圖1所示）。1. 熒光閾值（threshold ）的設(shè)定PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)， 熒光閾值的缺省（默認(rèn)） 設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle3-152. Ct值與起始模板的關(guān)系每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，公式如下Ct=-1/lg（1+Ex）*lg

10、X0+lgN/lg（1+Ex）n為擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，X0為初始模板量，Ex為擴(kuò)增效率，N為熒光擴(kuò)增信 號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量。起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡(jiǎn)述如下：1. TaqMan熒光探針：PCRT增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光 探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光 基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光

11、信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCFT增時(shí)，Taq酶的5' - 3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離， 從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與 PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqMa n-MGB 探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP，有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的首選技術(shù)平臺(tái)2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBF熒光染料，SYB啖光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與

12、PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過(guò)溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。3. 分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán) 緊緊靠近，不會(huì)產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過(guò)程中，分子信標(biāo)中間部分與 特定DNA序列配對(duì)，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光。1 傳統(tǒng)定量PCF方法簡(jiǎn)介1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工 程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi) 標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCF產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二

13、者的擴(kuò)增產(chǎn)物 可用電泳或高效液相分離開(kāi)來(lái)，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢 測(cè)模板。2）競(jìng)爭(zhēng)法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在 同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為 熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化 PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè) 片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開(kāi)，分別測(cè) 定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。3）PCR- ELISA法：利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異 的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗地高辛或生物素酶標(biāo)抗體-辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物， 最終酶使底物顯色。常

14、規(guī)的PCR- ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo) 準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的 2 內(nèi)標(biāo)在傳統(tǒng)定量中的作用 由于傳統(tǒng)定量方法都是終點(diǎn)檢測(cè)，即 PCR到達(dá)平臺(tái)期后進(jìn)行檢測(cè)，而 PCR經(jīng)過(guò) 對(duì)數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺(tái)期時(shí)，檢測(cè)重現(xiàn)性極差。同一個(gè)模板在96孔PCF儀上做96 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果有很大差異，因此無(wú)法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物量推算出起始模 板量。加入內(nèi)標(biāo)后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性。但即使如此， 傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。3內(nèi)標(biāo)對(duì)定量PCF的影響若在待測(cè)樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)，則 PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR雙重 PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競(jìng)爭(zhēng)

15、，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差 比較大時(shí)，這種競(jìng)爭(zhēng)會(huì)表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無(wú)法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)。也正是這個(gè)原因，傳統(tǒng)定量 方法雖然加入內(nèi)標(biāo)，但仍然只是一種半定量的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCF技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光 信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上 的：1) Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期(對(duì)數(shù)期)，此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。2) Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于 Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可 利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)