免疫干預(yù)實驗性自身免疫性重癥肌無力小鼠的B細胞活化機制

1、免疫干預(yù)實驗性自身免疫性重癥肌無力小鼠的B細胞活化機制         11-01-28 16:05:00     編輯：studa20                    作者：王蓉, 楊歡, 肖波, 張麗芳【摘要】  目的: 檢測脾臟和淋巴結(jié)中B細胞活化相關(guān)蛋白表達及蛋白磷

2、酸化表達水平的變化, 從B細胞活化的角度探討T146162iMDC干預(yù)實驗性自身免疫性重癥肌無力(EAMG 的作用機制。方法: 采用樹突狀細胞(DC)負載T146162 干預(yù)實驗性自身免疫性重癥肌無力小鼠（EAMG）的發(fā)病, 34只68周齡健康雄性C57BL/6J小鼠, 隨機分為模型組（A）、 干預(yù)組（B）和對照組（C）。體外培養(yǎng)DC, 然后負載T146162進行干預(yù)。從初次免疫起至第90天實驗終止前, 行EAMG嚴重性臨床評估及發(fā)病率的計算。Western blot檢測Syk、 Lyn、 Btk和PLC2蛋白及蛋白磷酸化表達。結(jié)果: 臨床評估: A組發(fā)病率高于B組（75% vs 25%, P

3、<0.05）。實驗終止時2組臨床評分分別為1.69±1.12 vs 0.35±0.67(P<0.01)。C組小鼠無發(fā)病。A組小鼠的脾臟和淋巴結(jié)Syk和PLC2蛋白表達和磷酸化水平較C組小鼠升高（P<0.01）, B組較A組下降（P<0.05）, 但高于C組（P<0.05）; A組小鼠的脾臟和淋巴結(jié)Lyn蛋白表達和磷酸化水平較C組小鼠降低（P<0.01）, B組較A組升高（P<0.05）, 但仍低于C組（P<0.05）; A組小鼠的脾臟和淋巴結(jié)Btk蛋白表達較C組小鼠升高（P<0.01）, B組較A組降低（P<0.0

4、5）, 仍高于C組（P<0.05）, 但磷酸化水平三組無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論: T146162iMDC干預(yù), 能顯著降低EAMG的發(fā)病率, 改善臨床癥狀, 其機制可能與抑制B細胞活化有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  實驗性自身免疫性重癥肌無力; T146162; 未成熟髓源性樹突狀細胞; B細胞Abstract  AIM:   To explore the therapic effect of T146162 iMDCs in C57BL/6 mice with experimental autoimmune myasthenia grave

5、s(EAMG),  and illustrate whether this therapic effect is related with the change of B cells activation. METHODS:   Adult male C57BL/6 mice were randomly divided into EAMG groups(A),  the prevention group(B) and control group(C);  Immature bone marrow dendritic cells were cul

6、tured and pulsed with T146162.  Mice of A group and B group were evaluated for clinical score till the day they were put to death. The expression and phosphorylation of Syk,  Lyn,  Btk and PLC2 protein were measured by Western blot. RESULTS:   75% mice of A group and 25% mic

7、e of B group were developed the accumulated incidence,  the difference was significant (P<0.05). The average clinical score of A group and B group were 1.69±1.12 vs 0.35±0.67(P<0.01) at the termination of experiment. The expression and phosphorylation of Syk and PLC2 protein in

8、spleen and lymphonode of the mice of A group were higher than those of C group (P<0.01) and B group (P<0.05). Compared with C group,  those of B group were higher (P<0.05);  The expression and phosphorylation of Lyn protein in spleen and lymphonode of the mice of A (P<0.01) and

9、 B (P<0.05) groups were lower than those of C group. Compared with A group,  those of B group were higher (P<0.05);  The expression of Btk protein in spleen and lymphonode of the mice of A (P<0.01) and B (P<0.05) groups were higher than those of C group. And those of B groups w

10、ere lower than those of A group (P<0.05). But there were no remarkable differences among the phosphorylation of Btk protein of three groups. CONCLUSION:   T146162iMDCs can prevent EAMG and probably ameliorate EAMG by the negative regulation on BCR signaling.Keywordsexperimental eutoimmu

11、ne myasthenia graves;  T146162;  immature bone marrow dendritic cells;  B cell實驗性自身免疫性重癥肌無力（experimental autoimmune myasthenia graves,  EAMG）是重癥肌無力（myasthenia graves,  MG）經(jīng)典的動物模型。B細胞活化在MG/EAMG發(fā)病中是必不可少的。B細胞抗原受體（B cell antigen receptor,  BCR）,  簡稱B細胞受體是B細胞表面標志性分子之一,&

12、#160; 參與了抗原的加工處理、 細胞凋亡、 細胞發(fā)育以及增生等過程,  對B細胞的產(chǎn)生、 選擇和活化具有關(guān)鍵作用1。已發(fā)現(xiàn)未成熟髓樹突狀細胞（immature bone marrow dendritic cells,  iMDCs）負載T146162 （T146162iMDC）能誘導(dǎo)TAchR預(yù)先致敏的T細胞抗原特異性耐受2,  但有關(guān)它對B細胞活化的影響研究甚少。    我們采用T146162iMDC干預(yù)EAMG的發(fā)病,  測定BCR介導(dǎo)的信號途徑中Lyn、 Btk、 PLc2、 Syk蛋白表達及蛋白磷酸化表達水平的變

13、化,  從B細胞活化的角度探討T146162iMDC干預(yù)EAMG的作用機制,  為臨床MG抗原特異性治療提供理論和實驗依據(jù)。1  材料和方法1.1  材料  從加利福尼亞電鰻的電器官中提取并純化的TAchR（美國德州大學(xué)醫(yī)學(xué)院ChrisTAdos教授惠贈）,  -80保存?zhèn)溆?。耐受肽段T146162（上海GL Biochem公司）,  LeuGlyIleTrpThrTyrAspGlyThrLysValSerIleSerProGluSer,  純度（HPLC）95%（52968,  GLS）, 

14、-80保存?zhèn)溆谩Ｍ每剐∈驜tk抗體、 兔抗小鼠Syk抗體、 兔抗小鼠Lyn抗體、 兔抗小鼠PLC2抗體和HRPpTyr小鼠單克隆抗體（mAb）購自加拿大SantaCruz公司。1.2  實驗動物處理與分組  34只近交系無特定病原體（SPF）級68周健康雄性C57BL/6J小鼠,  質(zhì)量2024 g; 15只SPF級46周健康雄性C57BL/6J小鼠,  質(zhì)量1822 g,  由中南大學(xué)實驗動物中心從上海斯萊克斯實驗動物有限公司購入。應(yīng)用SPSS13.0隨機數(shù)字表,  將34只68周C57BL/6J小鼠分為3組: 模型組（A組）: 實

15、驗0 d、 30 d、 60 d連續(xù)3次以TAChR抗原乳劑200 L（20 g TAChR、 100 L CFA、 100 L PBS）皮下注射小鼠的雙肩及后足墊,  每個部位50 L免疫動物,  誘導(dǎo)EAMG發(fā)作; 干預(yù)組（B組）: 實驗0 d、 30 d、 60 d連續(xù)3次以TAChR抗原乳劑免疫動物,  3 d、 33 d、 63 d分別以負載T146162（50 mg/L）的iMDCs干預(yù); 對照組（C組）: 實驗0 d、 30 d、 60 d連續(xù)3次予CFA+PBS皮下注射,  3 d、 33 d、 63 d予1 mL PBS皮下注射。按Be

16、rman等3評分標準做EAMG嚴重性的臨床評估,  評分1分以上者進行發(fā)病率的計算。15只46周C57BL/6J小鼠用途為取DCs,  不參與分組。1.3  DC的培養(yǎng)  參照胡玨等2方法提取骨髓并誘導(dǎo)DC分化。DC表型分析: 收集培養(yǎng)的DC,  用PBS重新將細胞制成懸浮液并調(diào)整細胞密度為1×109/L,  臺盼藍染色細胞活力>95%,  加入試管,  分別加入熒光抗體標記抗體CD11C、 CD40、 CD86和MHCII,  4孵育30 min,  PBS洗滌2次, 

17、; 以熒光標記的同型Ig作對照,  流式細胞儀（FACS caliber,  BD公司）檢測,  CellQuest軟件分析。1.4  Western blot檢測Lyn、 Btk、 PLc2、 Syk蛋白表達及蛋白磷酸化表達  小鼠在第90天以斷頸法處死,  夾取小鼠腹股溝、 腘窩、 腋下淋巴結(jié)及脾臟。胞質(zhì)裂解液提取蛋白。BCA方法測定蛋白濃度后-70保存。50 g蛋白變性后選用100 g/L SDSPAGE膠分離電泳,  150 mA恒濕法電轉(zhuǎn)移1.52 h至硝酸纖維素膜（NC膜）。取出NC膜麗春紅染色至看到清楚的條帶,

18、  雙蒸水洗去麗春紅。30 g/L BSA50 g/L脫脂奶粉37搖床封閉1 h。兔抗小鼠Btk抗體、 兔抗小鼠Syk抗體、 兔抗小鼠Lyn抗體、 兔抗小鼠Btk抗體、 兔抗小鼠PLC2抗體和HRPpTyr小鼠mAb,  30 g/L BSA50 g/L脫脂奶粉封閉液稀釋（1500）,  4搖床過夜。TBS室溫下漂洗3次,  每次10 min。加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔的二抗（12 000）,  室溫下作用11.5 h。TBS室溫下漂洗3次,  每次10 min。把ECL液均勻加在膜上顯色5 min,  吸干ECL液,

19、  暗室中曝光顯影、 定影。已加入HRPpTyr小鼠 mAb的NC膜不需再加二抗,  可直接顯色。GIS凝膠圖像處理系統(tǒng) V3.74進行膠片分析,  用actin（12 000）作為內(nèi)參照蛋白,  實驗方法和操作步驟均與目的蛋白相同。目的蛋白光密度與actin光密度比值即為目的蛋白的相對值。1.5  統(tǒng)計學(xué)分析  結(jié)果用x±s表示,  SPSS13.0 軟件包分析。成組設(shè)計的多樣本間均數(shù)的比較用方差分析,  兩樣本均數(shù)的比較用t檢驗,  多樣本均數(shù)間每兩個樣本的比較用q檢驗。半定量評分兩樣本間比

20、較用MannWhitney U檢驗。2  結(jié)果2.1  DC形態(tài)學(xué)特征及表型  培養(yǎng)24 h后,  倒置相差顯微鏡下可見貼壁的單核細胞聚集成團并均勻分布,  細胞呈小圓形。隨后細胞數(shù)目逐漸增多。培養(yǎng)第3天可見較多細胞疏松的黏附于板壁呈簇狀生長,  細胞形態(tài)小而圓,  此后細胞體積逐漸增大。第6天于相差顯微鏡下可見細胞呈不規(guī)則圓形貼壁生長,  表面有少量的毛刺形成。流式細胞儀表型分析示CD11C+、 CD40low、 CD86low和MHCIIlow,  證實所培養(yǎng)的細胞是iMDC。2.2  實驗

21、小鼠的行為及形態(tài)學(xué)  EAMG小鼠發(fā)病后出現(xiàn)不同程度的肌無力,  表現(xiàn)為活動減少、 攝食減少、 撕咬無力、 消瘦、 弓背低頭垂尾姿勢、 甚至全身衰竭等。其肌無力癥狀經(jīng)新斯的明實驗可暫時性改善。2.3  實驗小鼠的發(fā)病率及臨床評分  模型組和干預(yù)組小鼠在第1次免疫后30 d均未發(fā)病。第39天,  模型組有2/12 (16.7%)的小鼠發(fā)病,  干預(yù)組至第57天才有1/12(8.3%)小鼠發(fā)病,  較模型組發(fā)病延遲。實驗終止時,  模型組累計有9/12 (75%)的小鼠發(fā)病,  干預(yù)組累計3/12 (25%)

22、的小鼠發(fā)病,  兩組發(fā)病率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在人為處死之前,  模型組小鼠因疾病嚴重而自然死亡1只,  干預(yù)組未出現(xiàn)自然死亡。從第66天起兩組平均臨床評分有統(tǒng)計學(xué)意義,  分別為（0.75±0.87） vs （0.17±0.39）（P<0.05）,  實驗終止時兩組分別為（1.67±1.15） vs （0.33±0.65）（P<0.01）。2.4  各組小鼠脾臟和淋巴結(jié)Syk蛋白及磷酸化表達  模型組小鼠脾臟和淋巴結(jié)Syk蛋白表達水平較對照組小鼠明顯

23、升高（0.808±0.100 vs 0.374±0.189,  0.746±0.101 vs 0.340±0.092,  P<0.01）; 干預(yù)組小鼠脾臟和淋巴結(jié)的Syk蛋白表達水平較模型組下降（0.627±0.142 vs 0.808±0.100,  0.571±0.086 vs 0.746±0.101,  P<0.05）,  高于對照組。模型組和干預(yù)組小鼠脾臟（0. 536±0.067 vs 0.181±0.067, 

24、0.415±0.113 vs 0.181±0.067,  P<0.01）和淋巴結(jié)Syk蛋白磷酸化水平（0.476±0.081 vs 0.165±0.049,  0.349±0.096 vs 0.165±0.049,  P<0.01）均高于對照組; 干預(yù)組小鼠脾臟和淋巴結(jié)的Syk蛋白磷酸化表達水平較模型組下降（P<0.05,  圖1）。圖1  各組小鼠脾臟和淋巴結(jié)Syk蛋白和磷酸化表達（略）Fig 1  The expression and phosphorylation of Syk protein in spleen and