初始污染菌方法驗證

1、1. 目的 驗證產(chǎn)品初始污染菌數(shù)的試驗方法。2. 范圍 適用于質(zhì)量部門對產(chǎn)品初始污染菌數(shù)驗證試驗的檢測。3. 職責(zé) 質(zhì)量檢驗人員負(fù)責(zé)執(zhí)行此規(guī)程。4. 依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文件2010版中華人民共和國藥典第二部附錄幻J微生物限度檢查法GB/T19973.1-2005 醫(yī)療器械的滅菌 -微生物學(xué)方法 -第一部分 產(chǎn)品中微生 物數(shù)量的估計GB15980-2009 一次性使用醫(yī)療用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)5. 試驗產(chǎn)品6. 注意事項6.1 本操作應(yīng)在環(huán)境潔凈度 10000 級下的局部潔凈度 100 級的無菌操作臺內(nèi) 進(jìn)行。操作過程應(yīng)盡量避免任何可能使結(jié)果發(fā)生偏差的污染。6.2 15min 后方可 進(jìn)行實驗操作。6.3 膜

2、在過濾前后的完整性。7. 器材與試劑7.1 器材35 C恒溫培養(yǎng)箱、23 C恒溫培養(yǎng)箱、滅菌器、潔凈工作臺、無菌過濾裝置、鑷子、剪子、電子天平、移液器、 接種環(huán)7.2 稀釋液、沖洗液及其制備方法 稀釋液、沖洗液配制后按說明書要求進(jìn)行滅菌。pH 7.0 無菌氯化鈉溶液蛋白胨緩沖液0.9% 無菌氯化鈉溶液。7.3 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：按說明書方法保存配制。 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基：按說明書方法保存配制。 改良馬丁液體培養(yǎng)基：按說明書方法保存配制。 改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基：按說明書方法保存配制。 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：按說明書方法保存配制。8. 計數(shù)方法的驗證試驗 當(dāng)建立產(chǎn)品初始污染菌數(shù)檢查法時，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌、

3、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證： 以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品細(xì)菌、霉菌及酵母菌的測定。若產(chǎn)品的組分或 原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時，計數(shù)方法應(yīng)重新驗證。 驗證時，按供試液的制備和細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)所規(guī)定的方法及下列要求進(jìn) 行。對各試驗菌的回收率應(yīng)逐一進(jìn)行驗證。8.1 菌種 培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過 5 代，從菌種保藏中心獲得的 冷凍干燥菌種為 0 代，并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗菌株的生物學(xué) 特性。金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus CMCC B 26 003 大腸埃希菌 Escherichia coli CMCC B 11 102

4、 枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis CMCC B 63 501 白色念珠菌 Candida albicans CMCC F 98 001 黑曲霉 Aspergillus niger CMCC F 98 003 8.2 菌液制備 接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng) 基中或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，30-35 C培養(yǎng)18-24小時，接種白色念珠菌的新 鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上23-28 C培養(yǎng)24-48小時。上述培養(yǎng)物用 0.9% 無菌氯化鈉溶液制成每 1ml 含菌數(shù)為 50-100cfu 的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬

5、丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上23-28 C培養(yǎng) 5-7 天，加入 3-5ml 含 0.05% （mol/ml ）聚山梨酯 80 的 0.9% 無菌氯 化鈉溶液 ,0.05% （ mol/ml ）聚山梨酯 80 的 0.9% 無菌氯化鈉溶液制成每 1ml 含菌數(shù)為 50-100cfu 的孢子懸液。注：菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時內(nèi)使用，若保存在 2-8 C,可在24 小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在 2-88.3 供試液的制備在潔凈工作臺內(nèi)，將樣品分別放入配制好的 pH7.0 無菌氯化鈉溶液蛋白胨緩 沖液中，充分震蕩，作為試驗液。8.4 培養(yǎng)條件細(xì)菌30-35 C培養(yǎng)3天；霉菌及酵母菌23-28

6、 C培養(yǎng)5天；8.5 驗證方法8.5.1 驗證試驗至少應(yīng)進(jìn)行 3 次獨立的平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗 的回收率試驗組菌回收率 =（A-C ）/B稀釋劑對照組菌回收率 =D/B8.5.2 薄膜過濾法依據(jù) ISO11737-1 所述，膜過濾法尤其適用于微生物濃度較低的懸液。因此 本驗證首選薄膜過濾法。A. 試驗組 100ml樣品供試液 100ml稀釋的菌懸液，包括：1ml含50-100cfu 的菌懸液和99mlPH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液；B. 菌液組100ml稀釋的菌懸液，包括:1ml含50-100cfu 的菌懸液和99mlPH7.0 無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液 ;C. 供試品對照組 100ml樣品供試液 沖洗液 :100ml 無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液 PH7.0D. 稀釋劑對照組 100ml無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液PH7.0 100ml稀釋的菌懸液，包括:1ml含50-100cfu 的菌懸液和99mlPH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液 ;8.5.3 結(jié)果判定在 3 次獨立的平行試驗中 ,稀釋劑對照組的菌數(shù)回收率應(yīng)均不低于70% 。若試驗組的菌數(shù)回收率均不低于 70% ，照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的 70% ，應(yīng)采 用其它適宜方法，并重新進(jìn)行驗證。8.5.4 結(jié)果見附表 19