非諾貝特對(duì)糖尿病大鼠腎組織MCP1、 FN表達(dá)的影響

1、非諾貝特對(duì)糖尿病大鼠腎組織MCP1、 FN表達(dá)的影響    The sea refuses no river.     Knowledge will not be aquired without pain and application.                       作者：

2、袁江永, 謝小娟李英, 王麗梅 One cannot get blood from a stone.  【摘要】  目的: 探討非諾貝特對(duì)糖尿病大鼠腎組織MCP1、 FN表達(dá)的影響。方法: 選擇健康雄性SD大鼠36只, 隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)、 糖尿病模型組(DN組)和非諾貝特治療組(DF組), 每組12只, 模型組及治療組以鏈脲佐菌素誘發(fā)糖尿病, 治療組給予非諾貝特灌胃。分別于第4、 8周觀察各組大鼠脂代謝、 血肌酐及24

3、60;h尿蛋白定量。腎組織標(biāo)本行免疫組化檢測(cè)腎組織MCP1、 FN的表達(dá)水平()。結(jié)果: 模型組膽固醇、 甘油三酯、 肌酐及24 h尿蛋白定量水平的表達(dá)水平較同期正常組(P<0.01)和治療組(P<0.05)有明顯的增加。模型組大鼠腎組織MCP1、 FN表達(dá)較同期正常組(P<0.001)和治療組(P<0.01)有明顯的增加。結(jié)論: 非諾貝特可以下調(diào)糖尿病大鼠腎組織MCP1、 FN表達(dá)對(duì)試驗(yàn)性糖尿病大鼠具有部分腎保護(hù)作用。 【關(guān)鍵詞】  非諾貝特; 糖尿

4、病腎病; 單核巨噬細(xì)胞趨化蛋白1; 纖維連接蛋白  糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一, 是 DM致死、 致殘的主要原因。近來(lái)的研究表明單核巨噬細(xì)胞趨化蛋白1(monocyt chemoattractant protein1, MCP1)在糖尿病腎病腎組織表達(dá)增加, 以炎癥形式促進(jìn)DN進(jìn)展。非諾貝特廣泛用于動(dòng)脈粥樣硬化、 糖尿病等疾病的降脂治療, 近來(lái)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)非諾貝特可以抑制糖尿病大鼠的TGF1

5、而對(duì)糖尿病大鼠有部分腎保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)我們以SD大鼠建立糖尿病大鼠模型, 用非諾貝特治療, 免疫組化測(cè)定MCP1及FN的表達(dá), 研究非諾貝特腎保護(hù)的機(jī)制及其與MCP1和FN的關(guān)系(醫(yī)藥學(xué)/臨床醫(yī)學(xué)論文 )。1 材料和方法1.1 材料 體質(zhì)量180200 g的雄性SD大鼠36只(購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心合格證編號(hào): DK04020098)。鏈脲佐菌素(STZ)(sigma公司, 批號(hào)040103); MCP1、 FN抗體、 第二抗體生物素標(biāo)記的兔抗大鼠抗體(武漢博士德公司)

6、。非諾貝特膠囊(法國(guó)利博福尼公司, 批號(hào)H20040004)。1.2 方法1.2.1 動(dòng)物模型建立、 分組 動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)、 糖尿病組(DN組)、 非諾貝特治療組(DF組), 每組12只。DN組及DF組大鼠腹腔注射STZ60 mg/kg, 72 h后測(cè)尾靜脈血糖16.7 mmol/L, 尿糖34, 確定為糖尿病大鼠。1.2.2 給藥取材 次日, DF組給予非諾貝特40 mg/(kg·d)灌

7、胃, DN組、 NC組只給等量自來(lái)水灌胃, 試驗(yàn)期間, 所有大鼠自由進(jìn)食水, 不給胰島素及其它降糖藥物治療。于灌胃4周和8周末, 各組隨機(jī)選取大鼠6只, 宰殺前1 d置代謝籠, 收集24 h尿, 測(cè)尿量并離心, 待測(cè)尿蛋白; 先稱重, 然后斷頭取血, 分離血清, 待測(cè)血生化; 取腎組織用100 mL/L甲醛溶液固定, 待測(cè)免疫組化檢查。A faithful friend is hard to find.&#

8、160; 1.2.3 生化指標(biāo)測(cè)定 采用Beckmen全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血糖、 血甘油三酯、 膽固醇、 血肌酐、 尿蛋白, 并計(jì)算24 h尿蛋白定量, 結(jié)果用體質(zhì)量矯正。1.2.4 免疫組化染色 組織標(biāo)本經(jīng)甲醛固定, 石蠟切片脫蠟至水, 孵育后胰蛋白酶封閉, 加入第一抗體(MCP1、 FN抗體)第二抗體, 再加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記卵白素復(fù)合物, 孵育顯色, 樹(shù)脂封片, 最后用高清晰彩色病理圖像免疫測(cè)量系統(tǒng)(

9、HPLAS1000)進(jìn)行分析。MCP1測(cè)定: 每張切片隨機(jī)選取 5個(gè)腎小球, 計(jì)算每個(gè)腎小球內(nèi)抗體染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù), 以均值表示每例腎小球橫切面(glomerulum crosssection, GCS)中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù), 計(jì)算每張切片皮質(zhì)區(qū) 50個(gè)高倍視野下陽(yáng)性小管數(shù)與總腎小管數(shù)的百分?jǐn)?shù), 以均值表示每例腎小管中的陽(yáng)性率。FN的測(cè)定: 每個(gè)標(biāo)本按次序選5個(gè)視野, 做灰度掃描, 測(cè)定每個(gè)視野細(xì)胞外基質(zhì)著色面積, 取其平均值。None but a wise man can

10、employ leisure well.  1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)以x±s表示, 所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理, 組間比較用方差分析和q檢驗(yàn)。2 結(jié)果2.1 一般狀況 DN組及DF組在注射STZ后第45日即出現(xiàn)多飲、 多尿、 多食, , 逐漸消瘦, 墊料潮濕甚至成稀泥狀, 須每日更換墊料, 而NC組大鼠飲食正常, 體質(zhì)量增加, 毛色有光澤。2.2 生化測(cè)定的比較 DN組及DF組的血

11、膽固醇、 甘油三酯血肌酐及24 h尿蛋白定量均高于NC組(P<0.01), DF組低于DN組(P<0.05, 表1)。2.3 免疫組化腎組織MCP1、 FN的比較 DN組大鼠在第4周及第8周MCP1FN的表達(dá)均較NC組高(P<0.01), 治療后的DF組大鼠MCP1、 FN的表達(dá)較DN組有明顯的下降(P<0.05), 但較NC組仍高(表2)。表1 鼠血TC、 TG、 Scr及24 h尿蛋白定量表2 大鼠腎組織MCP1與FN

12、的表 論文教育信息網(wǎng)  3 討論MCP1作為一個(gè)重要的趨化因子, 是趨化性細(xì)胞因子CC亞家族的一個(gè)成員, 是一條由76個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白單鏈。正常腎組織中多種細(xì)胞如腎系膜細(xì)胞、 小管上皮細(xì)胞、 腎小球內(nèi)皮細(xì)胞等都可分泌微量的MCP1。與本研究結(jié)果一致, 說(shuō)明微量的表達(dá)是正常腎臟生理功能所必須。MCP1的主要功能是趨化和激活單核細(xì)胞至炎癥部位。它與單核細(xì)胞上MCP1受體CCR2高親和力特異性結(jié)合, 通過(guò)鈣離子依賴的PKC介導(dǎo)的信號(hào)途徑發(fā)揮生物學(xué)作用。近來(lái)研究證明在糖尿腎病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有炎癥的因素1參

13、與。MCP1可以促使炎性細(xì)胞如單核巨噬細(xì)胞在糖尿病腎病腎組織的聚集, 浸潤(rùn), 促使細(xì)胞外基質(zhì)堆積、 基底膜增厚和腎小球硬化。本研究顯示糖尿病大鼠腎組織MCP1的表達(dá)較正常組有明顯的上調(diào)。Sassy Prigent等2發(fā)現(xiàn)糖尿病鼠腎小球血管細(xì)胞MCP1mRNA表達(dá)的升高。Wada等3在糖尿病伴腎病綜合征患者毛細(xì)腎小管, 腎毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞以及間質(zhì)浸潤(rùn)的單核細(xì)胞中檢測(cè)到MCP1陽(yáng)性細(xì)胞。結(jié)合本文研究認(rèn)為在糖尿病患者體內(nèi), 多元醇代謝通路的激活, 嚴(yán)重的糖激化, 氧化應(yīng)激產(chǎn)物的形成, NFB、 蛋白激

14、酶C的活化, 以及血管活性激素如Ang、 Ang都可刺激腎臟固有細(xì)胞表達(dá)MCP1, 使間質(zhì)浸潤(rùn)細(xì)胞產(chǎn)生MCP1。而MCP1趨化單核巨噬細(xì)胞, 激活黏附分子, 誘導(dǎo)溶酶體的釋放, 活化TGF1, 促進(jìn)超氧陰離子和膠原的產(chǎn)生, 其中FN的表達(dá)增加, 導(dǎo)致DN的進(jìn)展。經(jīng)非諾貝特治療后, 腎組織MCP1及FN表達(dá)下調(diào), 糖尿病大鼠尿蛋白定量、 血肌酐有明顯的下降。已有研究證實(shí)非諾貝特5可以降低糖尿病大鼠腎組織TGF1, TGF1能促進(jìn)基底細(xì)胞分泌和表達(dá)MCP14。TGF1的下調(diào)有可能使MCP1及FN表達(dá)下調(diào)。高膽固醇水平刺激腎小球MCP1的表達(dá), 促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞在腎小球的浸潤(rùn)6。本研究中糖尿病腎病大鼠膽固醇升高, 腎組織MCP1的表達(dá)增加, 與文獻(xiàn)一致。曾有研究認(rèn)為7非諾貝特可以解除炎癥因子抑制的腎小球系膜細(xì)胞的膽固醇的排出?？?/p>