免疫標(biāo)記技術(shù)ppt課件

1、第一節(jié)第一節(jié) 免疫標(biāo)志技術(shù)簡介免疫標(biāo)志技術(shù)簡介 將某種可微量或超微量測定的物質(zhì)如將某種可微量或超微量測定的物質(zhì)如放射性核素、熒光素、酶、化學(xué)發(fā)光劑等放射性核素、熒光素、酶、化學(xué)發(fā)光劑等標(biāo)志于抗原抗體上制成標(biāo)志物，參與到標(biāo)志于抗原抗體上制成標(biāo)志物，參與到抗原抗體的反響體系中與相應(yīng)的抗體抗原抗原抗體的反響體系中與相應(yīng)的抗體抗原反響，以檢測標(biāo)志物的有無及含量的多少，反響，以檢測標(biāo)志物的有無及含量的多少，間接反映被測物的存在。稱做免疫標(biāo)志技術(shù)間接反映被測物的存在。稱做免疫標(biāo)志技術(shù)immunolabelling techniqueimmunolabelling technique。 免疫標(biāo)志技術(shù)概念免疫

2、標(biāo)志技術(shù)概念優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): :特異、敏感、快速；能定性特異、敏感、快速；能定性和定量甚至定位，且易于察看。和定量甚至定位，且易于察看。 免疫標(biāo)志技術(shù)的分類免疫標(biāo)志技術(shù)的分類免疫熒光標(biāo)志技術(shù)免疫熒光標(biāo)志技術(shù)免疫酶標(biāo)志技術(shù)免疫酶標(biāo)志技術(shù)放射免疫測定法放射免疫測定法 金免疫技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)、免疫印跡技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù) 一、免疫熒光標(biāo)志技術(shù)一、免疫熒光標(biāo)志技術(shù) (immunofluorescence,IF) (immunofluorescence,IF) 用熒光素與抗體銜接成熒光抗用熒光素與抗體銜接成熒光抗體，再與待檢標(biāo)本中抗原反響，熒體，再與待檢標(biāo)本中抗原反響，熒光顯微鏡下察看，抗原光顯微鏡下察看，

3、抗原- -抗體復(fù)合物抗體復(fù)合物分發(fā)熒光，借此對(duì)抗原進(jìn)展定性或分發(fā)熒光，借此對(duì)抗原進(jìn)展定性或定位。定位。 免疫熒光法可用于檢測多種病免疫熒光法可用于檢測多種病原體的抗原、抗體，或鑒定免疫細(xì)原體的抗原、抗體，或鑒定免疫細(xì)胞膜抗原。胞膜抗原。 二、免疫酶標(biāo)志技術(shù)二、免疫酶標(biāo)志技術(shù) (enzyme immunoassay,EIA) (enzyme immunoassay,EIA) 將抗原將抗原- -抗體反響的特異性與酶催抗體反響的特異性與酶催化作用的高效性相結(jié)合，借助酶作用化作用的高效性相結(jié)合，借助酶作用于底物的顯色反響斷定結(jié)果。運(yùn)用酶于底物的顯色反響斷定結(jié)果。運(yùn)用酶標(biāo)測定儀測定光密度標(biāo)測定儀測定光密

4、度ODOD值可反映值可反映抗原含量，靈敏度達(dá)抗原含量，靈敏度達(dá)ng/mlng/ml甚至甚至pg/mlpg/ml程度。程度。 三、放射免疫測定法三、放射免疫測定法 (radioimmunoassay,RIA) (radioimmunoassay,RIA) 用放射性核素標(biāo)志抗原或抗體進(jìn)展免用放射性核素標(biāo)志抗原或抗體進(jìn)展免疫學(xué)檢測。該法兼有放射性核素的高靈疫學(xué)檢測。該法兼有放射性核素的高靈敏度和抗原敏度和抗原- -抗體反響的特異性，檢測靈抗體反響的特異性，檢測靈敏度達(dá)敏度達(dá)pgpg程度。程度。 常用于標(biāo)志的放射性核素為常用于標(biāo)志的放射性核素為125I125I和和131I131I，分為液相和固相兩種方

5、法。，分為液相和固相兩種方法。 常用于測定微量物質(zhì)，如胰島素、生常用于測定微量物質(zhì)，如胰島素、生長激素、甲狀腺素、孕酮等激素；嗎啡、長激素、甲狀腺素、孕酮等激素；嗎啡、地高辛、地高辛、IgEIgE等。等。一、熒光根底知識(shí)簡介一、熒光根底知識(shí)簡介一熒光的產(chǎn)生一熒光的產(chǎn)生 一些化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲(chǔ)存一些化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲(chǔ)存能量如光能、化學(xué)能等而進(jìn)入激能量如光能、化學(xué)能等而進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時(shí)，發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時(shí)，過剩的能量可以電磁輻射的方式放射過剩的能量可以電磁輻射的方式放射即發(fā)光。即發(fā)光。第二節(jié) 免疫熒光標(biāo)志技術(shù)熒光免疫技術(shù)普通運(yùn)用致熒光物質(zhì)進(jìn)熒光免疫技

6、術(shù)普通運(yùn)用致熒光物質(zhì)進(jìn)展標(biāo)志。展標(biāo)志。熒光種類熒光種類致熒光：光激發(fā)產(chǎn)生致熒光：光激發(fā)產(chǎn)生化學(xué)熒光化學(xué)熒光X X線熒光線熒光陰極射線熒光陰極射線熒光 可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停頓可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停頓供能，發(fā)光熒光景象也隨之在瞬間內(nèi)消逝。供能，發(fā)光熒光景象也隨之在瞬間內(nèi)消逝。熒光發(fā)射的特點(diǎn)是：熒光發(fā)射的特點(diǎn)是：二熒光效率二熒光效率 熒光效率是指熒光分子將吸收的光熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。光量子的數(shù)值成正比。 熒光效率發(fā)射熒光的光量子數(shù)熒光效率

7、發(fā)射熒光的光量子數(shù)/ / 吸收光的光量子數(shù)吸收光的光量子數(shù)三熒光的猝滅三熒光的猝滅 熒光分子的輻射才干在遭到激發(fā)光較長熒光分子的輻射才干在遭到激發(fā)光較長時(shí)間的照射后會(huì)減弱甚至猝滅，這是由于時(shí)間的照射后會(huì)減弱甚至猝滅，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài)，所吸激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài)，所吸收的能量無法以熒光的方式發(fā)射收的能量無法以熒光的方式發(fā)射 熒光物質(zhì)的保管應(yīng)留意防止光特?zé)晒馕镔|(zhì)的保管應(yīng)留意防止光特別是紫外光的直接照射和與其他化合別是紫外光的直接照射和與其他化合物的接觸。物的接觸。 四常用的免疫標(biāo)志熒光物質(zhì)四常用的免疫標(biāo)志熒光物質(zhì) 1 1、異硫氰酸熒光素、異硫氰酸熒光素fluoresc

8、einisothiocyanate,FITCfluoresceinisothiocyanate,FITC 黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。精等溶劑。 最大吸收光波長為最大吸收光波長為490nm490nm495nm495nm，最大，最大發(fā)射光波長發(fā)射光波長520nm520nm530nm530nm，呈現(xiàn)亮堂的黃，呈現(xiàn)亮堂的黃綠色熒光，在冷暗枯燥處可保管多年，是綠色熒光，在冷暗枯燥處可保管多年，是運(yùn)用最廣泛的熒光素。運(yùn)用最廣泛的熒光素。 其主要優(yōu)點(diǎn)是：其主要優(yōu)點(diǎn)是： 人眼對(duì)黃綠色較為敏感，人眼對(duì)黃綠色較為敏感， 通常切片標(biāo)本中的綠色熒光通常切片標(biāo)本中的綠

9、色熒光 少于紅色。少于紅色。2 2、四乙基羅丹明、四乙基羅丹明 rhodamine,RIB200rhodamine,RIB200 橘紅色粉末，易溶于酒精。性質(zhì)穩(wěn)橘紅色粉末，易溶于酒精。性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保管。定，可長期保管。 最大吸收光波長為最大吸收光波長為570nm570nm，最大發(fā)射，最大發(fā)射光波長為光波長為595nm595nm600nm600nm，呈橘紅色熒光。，呈橘紅色熒光。3 3、四甲基異硫氰酸羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明tetramethylrhodamineisothiocyanate,tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITCTRITC 紫紅

10、色結(jié)晶粉末，溶于水和酒精。最紫紅色結(jié)晶粉末，溶于水和酒精。最大吸引光波長為大吸引光波長為550nm550nm，最大發(fā)射光波長，最大發(fā)射光波長為為620nm620nm，呈橙紅色熒光。，呈橙紅色熒光。 與與FITCFITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明，可的翠綠色熒光對(duì)比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)志或?qū)Ρ热旧洚惲蚺浜嫌糜陔p重標(biāo)志或?qū)Ρ热旧?，其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。二、熒光免疫標(biāo)志技術(shù)原理和方二、熒光免疫標(biāo)志技術(shù)原理和方法法一原一原 理理 熒光免疫技術(shù)是用化學(xué)方法使熒光熒光免疫技術(shù)是用化學(xué)方法使熒光素標(biāo)志的抗體或抗原與組織或細(xì)素標(biāo)志的抗體或抗原與組織或細(xì)胞

11、中的相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合，進(jìn)胞中的相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合，進(jìn)展定性定位檢查抗原或抗體的方法。展定性定位檢查抗原或抗體的方法。二方二方 法法 1 1、直接熒光法、直接熒光法 把熒光抗體加到待檢的細(xì)胞懸液、細(xì)把熒光抗體加到待檢的細(xì)胞懸液、細(xì)胞涂片或組織切片上進(jìn)展染色，經(jīng)抗原胞涂片或組織切片上進(jìn)展染色，經(jīng)抗原抗體反響后，洗去未結(jié)合的熒光抗體?？贵w反響后，洗去未結(jié)合的熒光抗體。將待檢標(biāo)本在熒光顯微鏡下察看，有熒將待檢標(biāo)本在熒光顯微鏡下察看，有熒光的部位即有相應(yīng)抗原存在。光的部位即有相應(yīng)抗原存在。 可用于病毒感染細(xì)胞、帶某種特異可用于病毒感染細(xì)胞、帶某種特異抗原的細(xì)胞如抗原的細(xì)胞如T T細(xì)胞和細(xì)胞和B B細(xì)胞

12、或病原細(xì)胞或病原菌的檢查，也可用于組織中冷靜的免疫菌的檢查，也可用于組織中冷靜的免疫復(fù)合物的檢查。復(fù)合物的檢查?？乖乖瓨?biāo)志抗體標(biāo)志抗體光原光原熒光熒光直接法原理表示圖直接法原理表示圖缺陷：檢查每種抗原均需制備相應(yīng)標(biāo)志的抗體缺陷：檢查每種抗原均需制備相應(yīng)標(biāo)志的抗體炭疽桿菌炭疽桿菌24h24h培育物直接熒光抗體檢測培育物直接熒光抗體檢測間接法原理表示圖抗原抗原抗體抗體標(biāo)志標(biāo)志抗體抗體光原熒光( (一一) )間接法間接法 將抗體將抗體( (一抗一抗) )與標(biāo)本中的與標(biāo)本中的抗原結(jié)合抗原結(jié)合, ,再用再用FITCFITC標(biāo)志的二抗染色。標(biāo)志的二抗染色。 2 2、間接熒光法、間接熒光法 將組織或細(xì)胞上

13、的抗原直接與將組織或細(xì)胞上的抗原直接與相應(yīng)抗體不標(biāo)志熒光結(jié)合，此相應(yīng)抗體不標(biāo)志熒光結(jié)合，此為第一抗體，再把能與第一抗體特為第一抗體，再把能與第一抗體特異結(jié)合的熒光標(biāo)志的抗免疫球蛋白異結(jié)合的熒光標(biāo)志的抗免疫球蛋白抗體參與，此為熒光標(biāo)志的第二抗抗體參與，此為熒光標(biāo)志的第二抗體，在熒光顯微鏡下察看熒光。體，在熒光顯微鏡下察看熒光。 間接法原理表示圖間接法原理表示圖抗原抗原抗體抗體標(biāo)志標(biāo)志抗體抗體光原光原熒光熒光優(yōu)點(diǎn)：敏感，一種標(biāo)志抗體可以檢測多種抗原優(yōu)點(diǎn)：敏感，一種標(biāo)志抗體可以檢測多種抗原缺陷：操作繁瑣缺陷：操作繁瑣3 3、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)、免疫熒光細(xì)胞化學(xué) 先將知的抗原或抗體標(biāo)志上熒光素制先將知的

14、抗原或抗體標(biāo)志上熒光素制成熒光標(biāo)志物，再用這種熒光抗體或抗原成熒光標(biāo)志物，再用這種熒光抗體或抗原作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原或抗體。在細(xì)胞或組織中構(gòu)成的抗原抗或抗體。在細(xì)胞或組織中構(gòu)成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡察體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡察看標(biāo)本，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，看標(biāo)本，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。用定量技術(shù)測定含量。 三、熒光標(biāo)志抗原三、熒光標(biāo)志抗原/ /抗體時(shí)非特異性抗體時(shí)非特異性 染色的主要要素染色的主

15、要要素微生物的原發(fā)熒光微生物的原發(fā)熒光組織的原發(fā)熒光組織的原發(fā)熒光游離熒光素及其衍生物的存在游離熒光素及其衍生物的存在抗體不純抗體不純抗原不純抗原不純?nèi)旧划?dāng)染色不當(dāng)四、免疫熒光標(biāo)志技術(shù)的運(yùn)用四、免疫熒光標(biāo)志技術(shù)的運(yùn)用一定性分析一定性分析 熒光物質(zhì)特性的光譜包括激發(fā)光譜熒光物質(zhì)特性的光譜包括激發(fā)光譜和熒光光譜兩種。在分光光度法中，和熒光光譜兩種。在分光光度法中，被測物質(zhì)只需一種特征的吸收光譜，被測物質(zhì)只需一種特征的吸收光譜，而熒光分析法能測出兩種特征光譜，而熒光分析法能測出兩種特征光譜，因此，鑒定物質(zhì)的可靠性較強(qiáng)。因此，鑒定物質(zhì)的可靠性較強(qiáng)。二定量測定二定量測定 熒光分析法的定量測定方法較多，

16、熒光分析法的定量測定方法較多，可分為直接測定法和間接測定法兩類?？煞譃橹苯訙y定法和間接測定法兩類。1 1、直接測定法、直接測定法 利用熒光分析法對(duì)被利用熒光分析法對(duì)被分析物質(zhì)進(jìn)展?jié)舛葴y定。分析物質(zhì)進(jìn)展?jié)舛葴y定。2 2、間接測定法、間接測定法 有些物質(zhì)本身不能發(fā)有些物質(zhì)本身不能發(fā)光或熒光量子產(chǎn)率低，只能用間接測定光或熒光量子產(chǎn)率低，只能用間接測定法法化學(xué)轉(zhuǎn)化法、熒光猝滅法、敏化發(fā)光法化學(xué)轉(zhuǎn)化法、熒光猝滅法、敏化發(fā)光法五、五、 熒光免疫技術(shù)實(shí)驗(yàn)例如熒光免疫技術(shù)實(shí)驗(yàn)例如抗細(xì)胞核抗體抗細(xì)胞核抗體(Antinuclear antibody,ANA)(Antinuclear antibody,ANA) 檢

17、測對(duì)膠原性疾病檢測對(duì)膠原性疾病( (如全身性紅斑如全身性紅斑性狼瘡性狼瘡) )及其他本身免疫性疾病的診斷及其他本身免疫性疾病的診斷有一定意義。有一定意義?！驹?理】 全身性紅斑性狼瘡全身性紅斑性狼瘡 (SLE) (SLE)是一種是一種本身免疫性疾病，患者血清中出現(xiàn)本身免疫性疾病，患者血清中出現(xiàn)ANAANA。以大白鼠肝細(xì)胞核作為抗原基質(zhì)，加以大白鼠肝細(xì)胞核作為抗原基質(zhì)，加病人血清病人血清 ( (第一抗體第一抗體) )，再加熒光標(biāo)志，再加熒光標(biāo)志的抗人的抗人IgG(IgG(第二抗體第二抗體) )進(jìn)展間接免疫熒進(jìn)展間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，假設(shè)患者血清中有光實(shí)驗(yàn)，假設(shè)患者血清中有ANAANA，ANAANA便

18、與肝細(xì)胞核抗原結(jié)合，再與熒光標(biāo)便與肝細(xì)胞核抗原結(jié)合，再與熒光標(biāo)志的抗人志的抗人IgGIgG結(jié)合，在熒光鏡下可見細(xì)結(jié)合，在熒光鏡下可見細(xì)胞核顯示黃綠色特異熒光。胞核顯示黃綠色特異熒光?！静摹静?料】料】1 1、 大白鼠肝組織印片。大白鼠肝組織印片。2 2、 病人血清。病人血清。3 3、 熒光標(biāo)志抗人熒光標(biāo)志抗人IgGIgG。4 4、 丙酮、丙酮、PBSPBS、緩沖甘油、緩沖甘油 (PBS+ (PBS+等量甘等量甘油油) )。5 5、 陽性血清和陰性血清。陽性血清和陰性血清?！痉健痉?法】法】1 1、 將大白鼠肝冰凍印片浸于丙酮中固定將大白鼠肝冰凍印片浸于丙酮中固定5 5分分鐘，鐘，PBSPBS漂

19、洗三次，每次漂洗三次，每次3 3分鐘，取出晾干，分鐘，取出晾干，-20-20保管備用。保管備用。2 2 、用、用PBSPBS稀釋病人血清，使成稀釋病人血清，使成1:51:5、1:101:10、 1 1：201:1280201:1280稀釋度。稀釋度。3 3、 將不同稀釋度的病人血清將不同稀釋度的病人血清1010微升微升分別參與鼠肝印片上，放濕盒內(nèi)，分別參與鼠肝印片上，放濕盒內(nèi)，置置3737培育箱中培育箱中3030分鐘。分鐘。4 4、用、用PBSPBS洗去印片上未結(jié)合的血清，洗去印片上未結(jié)合的血清，然后再用然后再用PBSPBS漂洗三次，每次漂洗三次，每次3 3分鐘，分鐘，晾干。晾干。5 5、分別

20、滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)志、分別滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)志抗人的抗人的IgG(1:10),IgG(1:10),放濕盒內(nèi)，置放濕盒內(nèi)，置3737培育箱中培育箱中3030分鐘。分鐘。7 7、 在染好的玻片上滴加緩沖甘油，熒在染好的玻片上滴加緩沖甘油，熒光鏡檢。光鏡檢。6 6、用、用PBSPBS洗去未結(jié)合的熒光抗體，然后洗去未結(jié)合的熒光抗體，然后再用再用PBSPBS漂洗三次，每次漂洗三次，每次3 3分鐘，晾干。分鐘，晾干?！窘Y(jié)【結(jié) 果】果】 整個(gè)肝細(xì)胞核著色發(fā)出黃整個(gè)肝細(xì)胞核著色發(fā)出黃綠色熒光者為陽性綠色熒光者為陽性; ;不發(fā)熒光者為陰性。不發(fā)熒光者為陰性。 第三節(jié)第三節(jié) 酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)一、一、 酶免

21、疫技術(shù)中酶、顯色底物和標(biāo)志物的制備酶免疫技術(shù)中酶、顯色底物和標(biāo)志物的制備 在酶免疫技術(shù)中用于標(biāo)志的酶應(yīng)具有催化在酶免疫技術(shù)中用于標(biāo)志的酶應(yīng)具有催化活性高、催化專注性強(qiáng)與抗原抗體偶聯(lián)后不影響活性高、催化專注性強(qiáng)與抗原抗體偶聯(lián)后不影響抗原抗體的免疫反響性和酶活性；催化的底物易抗原抗體的免疫反響性和酶活性；催化的底物易于配制、保管且催化底物產(chǎn)生的信號(hào)產(chǎn)物易于察于配制、保管且催化底物產(chǎn)生的信號(hào)產(chǎn)物易于察看和檢測；對(duì)人無害且價(jià)廉、易得等特點(diǎn)?？春蜋z測；對(duì)人無害且價(jià)廉、易得等特點(diǎn)。表表1 1 常用酶及底物常用酶及底物常用酶常用酶底物底物加終止液加終止液前顏色前顏色加終止液后加終止液后顏色顏色辣根過氧辣根過

22、氧化物酶化物酶（HRPHRP）RZ3.1RZ3.1堿性磷酸堿性磷酸酶（酶（APAP）鄰苯二胺鄰苯二胺（OPDOPD）四甲基聯(lián)苯四甲基聯(lián)苯胺（胺（TMBTMB）對(duì)硝基苯磷對(duì)硝基苯磷酸酯（酸酯（p-p-NPPNPP）橙黃色橙黃色藍(lán)色藍(lán)色黃色黃色棕黃色棕黃色黃色黃色黃色黃色二二 標(biāo)志物的制備標(biāo)志物的制備標(biāo)志物制備的方法兩類：標(biāo)志物制備的方法兩類： 1 1、交聯(lián)法、交聯(lián)法 交聯(lián)法是以一可同時(shí)與酶和抗體交聯(lián)法是以一可同時(shí)與酶和抗體抗原結(jié)合的交聯(lián)劑作為抗原結(jié)合的交聯(lián)劑作為“橋，分橋，分別銜接酶與抗體抗原的方法，此別銜接酶與抗體抗原的方法，此類方法中目前最常用的是戊二醛交聯(lián)類方法中目前最常用的是戊二醛交聯(lián)法

23、，構(gòu)成的結(jié)合物為：酶法，構(gòu)成的結(jié)合物為：酶- -戊二醛戊二醛- -抗抗體抗原。體抗原。2 2、直接法、直接法 直接法是用一活化劑首先將酶直接法是用一活化劑首先將酶活化，被活化的酶分子上的基團(tuán)直活化，被活化的酶分子上的基團(tuán)直接可與抗體抗原結(jié)合構(gòu)成標(biāo)志接可與抗體抗原結(jié)合構(gòu)成標(biāo)志物，如過碘酸鈉法。物，如過碘酸鈉法。 構(gòu)成的結(jié)合物為：酶構(gòu)成的結(jié)合物為：酶- -抗體抗原?？贵w抗原。 二、二、 辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, (Horseradish Peroxidase, HRP)HRP)標(biāo)志抗體的制備例如標(biāo)志抗體的制備例如 一辣根過氧化物酶和底物簡介一辣根

24、過氧化物酶和底物簡介 Horseradish Peroxidase,HRP Horseradish Peroxidase,HRP 比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以最常用。容易制備，所以最常用。 HRP HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白，糖含量結(jié)合而成的糖蛋白，糖含量1818。 底物：鄰苯二胺、四甲基聯(lián)苯胺底物：鄰苯二胺、四甲基聯(lián)苯胺簡易過碘酸鹽氧化法原理： 辣根過氧化物酶的標(biāo)志常用過碘酸鹽氧化法，這種方法法只適用于含糖量較高的酶。過碘酸

25、鈉將HRP分子外表的多糖氧化為醛基，醛基與抗體分子上的氨基構(gòu)成Schiff堿而結(jié)合。后者可進(jìn)一步用NaBH (氫硼化鈉(或乙醇胺)復(fù)原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)志抗體。 四 操作步驟 1稱取5mgHRP溶解于0.5ml蒸餾水中。2向溶液中參與0.5ml新配的0.1M NaIO溶液，混勻， 4靜置30分鐘。3參與0.16M乙二醇水溶液0.5ml，混勻， 靜置30分鐘。4參與含5mg抗體的水溶液1ml，混勻裝入透析袋，pH9.5 碳酸鹽緩沖液透析，4過夜。5加0.2 mL 新配的5 mg/mL NaBH液，混勻，再置4 , 2h。6在攪拌下逐滴參與等體積飽和硫酸銨，置4 1h。73000 r/min 離心半小

26、時(shí)，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15moL/L pH7.4 的PBS中。8 將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.15 moL/L pH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10,000 r/min 離心30 min 去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保管。( (二) )HRPHRP標(biāo)志抗體的方法 1 1、原理、原理 戊二醛為一種雙功能試劑，經(jīng)過戊二醛為一種雙功能試劑，經(jīng)過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價(jià)結(jié)合，構(gòu)成酶基共價(jià)結(jié)合，構(gòu)成酶- -戊二醛戊二醛- -免疫球免疫球蛋白結(jié)合物。蛋白結(jié)合物。2 2、 試劑

27、及器材試劑及器材 (1)0.1M PH6.8(1)0.1M PH6.8磷酸緩沖鹽水磷酸緩沖鹽水(PBS)(PBS)：?。喝?.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml51ml，NaCl 1.8gNaCl 1.8g，加蒸餾水至，加蒸餾水至200ml200ml。(2)1.25(2)1.25戊二醛液：取戊二醛液：取2525戊二醛戊二醛50ml50ml與與PH6.8PH6.8的的PBS1mlPBS1ml混合。混合。(3)1M PH9.5(3)1M PH9.5碳酸鹽緩沖液：取碳酸鹽緩沖液：取1M1M碳酸鈉碳酸鈉3

28、ml3ml與與1M1M碳酸氫鈉碳酸氫鈉7ml7ml混合。混合。(4)0.2M(4)0.2M賴氨酸溶液：稱賴氨酸賴氨酸溶液：稱賴氨酸29.2mg29.2mg溶溶于于0.01M PH9.50.01M PH9.5碳酸緩沖液碳酸緩沖液1ml1ml中。中。(5)0.15M PH7.4 PBS(5)0.15M PH7.4 PBS及生理鹽水。及生理鹽水。(6)PH7.8(6)PH7.8飽和硫酸銨溶液及半飽和硫酸銨溶飽和硫酸銨溶液及半飽和硫酸銨溶液。液。(7)(7)萘氏試劑及聚乙二醇萘氏試劑及聚乙二醇(PEG(PEG，MW2000)MW2000)。(8)(8)純化的特異性抗體或抗純化的特異性抗體或抗IgGIg

29、G抗體?？贵w。(9)HRP(RZ3.0)(9)HRP(RZ3.0)。(10)Sephadex G-25(10)Sephadex G-25層析柱層析柱(2cm(2cm50cm)50cm)。(11)(11)攪拌器，分光光度計(jì)，離心機(jī)。攪拌器，分光光度計(jì)，離心機(jī)。(12)(12)透析袋，大、小燒杯，試管，吸管等。透析袋，大、小燒杯，試管，吸管等。3 3、標(biāo)志步驟、標(biāo)志步驟 (1)(1)稱取稱取HRP 25mgHRP 25mg溶于溶于1.251.25戊二醛戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜。溶液中，于室溫靜置過夜。(2)(2)反響后的酶溶液經(jīng)反響后的酶溶液經(jīng)Sephadex G-25Sephadex G-2

30、5層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在在1ml/1ml/分鐘，搜集棕色流出液。如體分鐘，搜集棕色流出液。如體積大于積大于5ml5ml，那么以，那么以PEGPEG濃縮至濃縮至5ml5ml。放。放置置25ml25ml小燒杯中，緩慢攪拌。小燒杯中，緩慢攪拌。(3)(3)將待標(biāo)志的抗體將待標(biāo)志的抗體12.5mg12.5mg用生理鹽水用生理鹽水稀釋至稀釋至5ml5ml，攪拌下逐滴參與酶溶液中。，攪拌下逐滴參與酶溶液中。(4)(4)用用1M PH9.51M PH9.5碳酸鹽緩沖液碳酸鹽緩沖液0.25ml0.25ml，繼續(xù)攪拌繼續(xù)攪拌3 3小時(shí)。小時(shí)。(5)(5)加加0.2M0

31、.2M賴氨酸賴氨酸0.25ml0.25ml，混勻后，置室，混勻后，置室 溫溫2 2小時(shí)。小時(shí)。(6)(6)在攪拌下逐滴參與等體積飽和硫酸銨，在攪拌下逐滴參與等體積飽和硫酸銨， 置置4 14 1小時(shí)。小時(shí)。(7)(7)3000rpm3000rpm離心離心30min30min，棄上清。沉淀物，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量于少量0.15M PH7.40.15M PH7.4的的PBSPBS中。中。(8)(8)將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.15M PH7.40.15M PH7.4的的PBSPBS緩沖鹽水透析，緩沖鹽水透

32、析，去除銨離子后去除銨離子后( (用萘氏試劑檢測用萘氏試劑檢測) )，10000rpm10000rpm離心離心3030分鐘去除沉淀，分鐘去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保管。冰凍保管。4 4、 結(jié)果斷定結(jié)果斷定(1)(1)定性及效價(jià)滴定定性及效價(jià)滴定: : 用特異性抗原用特異性抗原( (或抗體或抗體) )同酶標(biāo)志抗體同酶標(biāo)志抗體( (或抗免疫球或抗免疫球蛋白抗體蛋白抗體) )作雙向瓊脂分散實(shí)驗(yàn)或免作雙向瓊脂分散實(shí)驗(yàn)或免疫電泳實(shí)驗(yàn)。疫電泳實(shí)驗(yàn)。 然后用酶的底物使沉淀弧顯色，然后用酶的底物使沉淀弧顯色，可初步鑒定其活性。最后以直接可初步鑒定其活性。最后以直接E

33、LISAELISA法法( (或在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里或在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里) )對(duì)酶對(duì)酶結(jié)合物進(jìn)展滴定。結(jié)合物進(jìn)展滴定。(2)(2)定量和克分子比值測定定量和克分子比值測定 可用分光光度可用分光光度計(jì)測定計(jì)測定( (光程光程1cm)1cm)。 酶量酶量(mg(mgml)ml)OD403nmOD403nm0.4 0.4 IgG IgG量量(mg(mgml)ml)OD280nm- OD280nm- OD403nm OD403nm0.42)0.42)0.940.940.620.62 ( (三三) )本卷須知本卷須知 1.1.在具備高質(zhì)量在具備高質(zhì)量HRPHRP的條件下，所要標(biāo)志的抗的條件下，所要標(biāo)志的抗體也要

34、活性高體也要活性高, ,效價(jià)高效價(jià)高( (最低最低116),116),純度高，純度高，親和力好，這是保證標(biāo)志物效價(jià)高，免疫親和力好，這是保證標(biāo)志物效價(jià)高，免疫活性好的首要條件。活性好的首要條件。2.2.所運(yùn)用試劑的所運(yùn)用試劑的PHPH和濃度及用量必需嚴(yán)厲和濃度及用量必需嚴(yán)厲掌握。所用試劑，最好掌握。所用試劑，最好( (或必需或必需) )新穎配制。新穎配制。如在戊二醛標(biāo)志法中所用戊二醛應(yīng)為新穎如在戊二醛標(biāo)志法中所用戊二醛應(yīng)為新穎純品，因戊二醛儲(chǔ)存過久可構(gòu)成縮和體純品，因戊二醛儲(chǔ)存過久可構(gòu)成縮和體( (雜雜質(zhì)質(zhì)) )。否那么，影響標(biāo)志效果。否那么，影響標(biāo)志效果。3.3.室溫?cái)嚢钑r(shí)須避光，室內(nèi)溫度普

35、通在室溫?cái)嚢钑r(shí)須避光，室內(nèi)溫度普通在2525為宜。標(biāo)志物每次透析前，須仔為宜。標(biāo)志物每次透析前，須仔細(xì)檢查，防止漏液。細(xì)檢查，防止漏液。4.4.濃的標(biāo)志物相當(dāng)穩(wěn)定，常參與濃的標(biāo)志物相當(dāng)穩(wěn)定，常參與30304040甘油于甘油于-10-10下保管。下保管。44可保管可保管1 12 2年，但稀釋成年，但稀釋成110110，只能保管數(shù)周。，只能保管數(shù)周。已配制的運(yùn)用液應(yīng)在已配制的運(yùn)用液應(yīng)在1212小時(shí)內(nèi)用完。小時(shí)內(nèi)用完。切忌反復(fù)凍融。切忌反復(fù)凍融。三、酶免疫技術(shù)類型和運(yùn)用三、酶免疫技術(shù)類型和運(yùn)用 酶免疫技術(shù)按照抗原抗體系統(tǒng)是定酶免疫技術(shù)按照抗原抗體系統(tǒng)是定位于組織細(xì)胞上還是存在于液體樣品位于組織細(xì)胞上

36、還是存在于液體樣品中分為酶免疫組化技術(shù)和酶免疫測定中分為酶免疫組化技術(shù)和酶免疫測定EIAEIA。 酶免疫測定分為酶免疫測定分為 均相酶免疫測定和異相酶免疫測定。均相酶免疫測定和異相酶免疫測定。 1 1、酶免疫加強(qiáng)測定技術(shù)、酶免疫加強(qiáng)測定技術(shù)EMITEMIT 2 2、克隆酶供體免疫分析、克隆酶供體免疫分析CEDIACEDIA1 1、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)2 2、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)3 3、生物素親和素、生物素親和素ELISAELISA4 4、發(fā)光酶免疫測定、發(fā)光酶免疫測定一均相酶免疫測定一均相酶免疫測定 1 1、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme link

37、ed immunosorbent (enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) assay,ELISA) 是酶免疫測定中運(yùn)用最廣的技術(shù)，用于是酶免疫測定中運(yùn)用最廣的技術(shù)，用于測定可溶性抗原或抗體。測定可溶性抗原或抗體。 將知抗原或抗體吸附在固相載體聚將知抗原或抗體吸附在固相載體聚苯乙烯微量反響板外表，使抗原苯乙烯微量反響板外表，使抗原- -抗體反抗體反響在固相外表進(jìn)展，借助洗滌將固相上的響在固相外表進(jìn)展，借助洗滌將固相上的抗原抗原- -抗體復(fù)合物與液相中游離成分分別。抗體復(fù)合物與液相中游離成分分別。酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀 (1) (1)間接法：用于測定抗體。先將抗原

38、被覆，間接法：用于測定抗體。先將抗原被覆，洗滌后加待檢血清，充分漂洗后參與酶標(biāo)志的洗滌后加待檢血清，充分漂洗后參與酶標(biāo)志的抗抗體，洗后即可供顯色察看?？箍贵w，洗后即可供顯色察看。 (2)雙抗體夾心法：先用抗體(IgG)被覆，加待檢抗原，作用洗滌后，加酶標(biāo)志抗體。3 3競爭法競爭法 即可檢測抗原又可檢測抗體。它是即可檢測抗原又可檢測抗體。它是用酶標(biāo)抗原抗體與待測的非標(biāo)志用酶標(biāo)抗原抗體與待測的非標(biāo)志抗原抗體競爭性的與固相載體上抗原抗體競爭性的與固相載體上的限量抗體抗原結(jié)合，待測抗原的限量抗體抗原結(jié)合，待測抗原抗體多，那么構(gòu)成非標(biāo)志復(fù)合物抗體多，那么構(gòu)成非標(biāo)志復(fù)合物多，酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合就少，也就多

39、，酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合就少，也就是酶標(biāo)志復(fù)合物少，因此，顯色程度是酶標(biāo)志復(fù)合物少，因此，顯色程度與待測物含量成反比。與待測物含量成反比。競爭法競爭法待測樣本待測樣本酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體底底 物物終止液終止液2 2、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(ELISPOT) (ELISPOT) 原理：將抗細(xì)胞因子抗體包被固相原理：將抗細(xì)胞因子抗體包被固相載體，參與不同來源的細(xì)胞，細(xì)胞分載體，參與不同來源的細(xì)胞，細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子與包被抗體結(jié)合，在細(xì)泌的細(xì)胞因子與包被抗體結(jié)合，在細(xì)胞周圍構(gòu)成抗體胞周圍構(gòu)成抗體- -抗原細(xì)胞因子復(fù)抗原細(xì)胞因子復(fù)合物。合物。 然后參與相應(yīng)酶標(biāo)志的抗細(xì)胞因子抗體，然后參與相應(yīng)酶標(biāo)志

40、的抗細(xì)胞因子抗體，經(jīng)過底物顯色反響測定結(jié)合在固相載經(jīng)過底物顯色反響測定結(jié)合在固相載體上的細(xì)胞因子量，并可在光鏡下察體上的細(xì)胞因子量，并可在光鏡下察看分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞?？捶置诩?xì)胞因子的細(xì)胞。 3 3、BAS-ELISABAS-ELISA 生物素生物素biotinbiotin是廣泛分布于動(dòng)、植是廣泛分布于動(dòng)、植物體內(nèi)的一種生長因子，又稱輔酶物體內(nèi)的一種生長因子，又稱輔酶R R或維生或維生素素H H。親和素。親和素(avidin)(avidin)是卵白及某些微生物是卵白及某些微生物中的一種蛋白質(zhì)。生物素與親和素間具有中的一種蛋白質(zhì)。生物素與親和素間具有高度親和力，且均能偶聯(lián)抗體、抗原和辣高度親和力

41、，且均能偶聯(lián)抗體、抗原和辣根過氧化物酶而不影響其生物學(xué)活性。在根過氧化物酶而不影響其生物學(xué)活性。在生物素生物素- -親和素系統(tǒng)親和素系統(tǒng)(biotin avidin (biotin avidin system,BAS)system,BAS)中，借助所構(gòu)成的親和素中，借助所構(gòu)成的親和素- -生生物素物素- -酶復(fù)合物，追蹤生物素標(biāo)志的抗原或酶復(fù)合物，追蹤生物素標(biāo)志的抗原或抗體，經(jīng)過酶催化底物顯色，可檢出相應(yīng)抗體，經(jīng)過酶催化底物顯色，可檢出相應(yīng)抗體或抗原?？贵w或抗原。 生物素酶標(biāo)親合素系統(tǒng)反響表示圖4 4、 發(fā)光酶免疫測定發(fā)光酶免疫測定 與普通與普通EIAEIA的區(qū)別是酶所催化的底物是發(fā)的區(qū)別是酶

42、所催化的底物是發(fā)光劑。產(chǎn)物不是普通光劑。產(chǎn)物不是普通EIAEIA的有色物質(zhì)，而是的有色物質(zhì)，而是發(fā)光產(chǎn)物，所發(fā)出的光可用特定的儀器測定。發(fā)光產(chǎn)物，所發(fā)出的光可用特定的儀器測定。常用的酶是常用的酶是HRPHRP和和APAP，HRPHRP的發(fā)光底物有魯米的發(fā)光底物有魯米諾及衍生物、對(duì)諾及衍生物、對(duì)- -羥基苯乙酸；羥基苯乙酸；APAP的底物為的底物為3-3-2-2-螺旋金剛烷螺旋金剛烷-4-4-甲氧基甲氧基-(3-(3-磷酸氧磷酸氧基基)-)-苯基苯基-1-1，2-2-二氧乙烷和二氧乙烷和4-4-甲基傘形酮磷甲基傘形酮磷酸鹽。酸鹽。四、四、 酶免疫技術(shù)實(shí)驗(yàn)例如酶免疫技術(shù)實(shí)驗(yàn)例如酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)酶聯(lián)

43、免疫吸附實(shí)驗(yàn) Enzyme Linked Immunosorbent Enzyme Linked Immunosorbent Assay ,ELISAAssay ,ELISA雙抗體夾心法檢測雙抗體夾心法檢測HBsAgHBsAg【原【原 理】理】 以特異性抗體以特異性抗體( (抗抗-HBs)-HBs)致敏載體外致敏載體外表，然后將含有抗原的標(biāo)本與致敏的表，然后將含有抗原的標(biāo)本與致敏的載體一同孵育，洗去過量溶液。再加載體一同孵育，洗去過量溶液。再加人酶標(biāo)特異抗體人酶標(biāo)特異抗體( (酶標(biāo)抗酶標(biāo)抗-HBs)-HBs)。酶標(biāo)。酶標(biāo)抗體就銜接到已結(jié)合于抗體致敏的載抗體就銜接到已結(jié)合于抗體致敏的載體外表的抗

44、原上，孵育后，洗去過量體外表的抗原上，孵育后，洗去過量的結(jié)合物。最后加底物溶液，根據(jù)顏的結(jié)合物。最后加底物溶液，根據(jù)顏色反響來斷定抗原含量。色反響來斷定抗原含量?！静摹静?料】料】 HBsAg HBsAg試劑盒，本試劑盒采用雙試劑盒，本試劑盒采用雙抗體夾心法檢測抗體夾心法檢測HBsAgHBsAg，適用于血，適用于血清或血漿標(biāo)本，具有快速簡便，特清或血漿標(biāo)本，具有快速簡便，特異性強(qiáng)，靈敏度高，反復(fù)性好，所異性強(qiáng)，靈敏度高，反復(fù)性好，所需標(biāo)本量少等優(yōu)點(diǎn)。需標(biāo)本量少等優(yōu)點(diǎn)。試劑盒含試劑盒含: : 1 1、 包被抗包被抗-HBs-HBs反應(yīng)條反應(yīng)條1 1板板 2 2、 酶結(jié)合物酶結(jié)合物 1 1瓶瓶 3

45、 3、 HBsAgHBsAg陽性對(duì)照陽性對(duì)照1 1瓶瓶 4 4、 HBsAgHBsAg陰性對(duì)照陰性對(duì)照1 1瓶瓶 5 5、 洗滌液洗滌液: :用前每瓶作用前每瓶作1 1：2020稀釋稀釋1 1瓶瓶 6 6、 顯色劑（顯色劑（TMBTMB）A A 1 1瓶瓶 7 7、 顯色劑（顯色劑（TMBTMB）B B1 1瓶瓶 8 8、 終止液終止液 1 1瓶瓶 【方【方 法】法】 1 1、 加人待測標(biāo)本加人待測標(biāo)本 每孔每孔5050微升，并設(shè)微升，并設(shè)HBsAgHBsAg陽性對(duì)照陽性對(duì)照2 2孔，孔，HBsAgHBsAg陰性對(duì)照陰性對(duì)照2 2孔，空白對(duì)照孔，空白對(duì)照1 1孔，然后參與酶結(jié)合物孔，然后參與酶

46、結(jié)合物每孔每孔1 1滴滴 (50 (50微升、空白對(duì)照孔不加微升、空白對(duì)照孔不加) )，充分混勻后置充分混勻后置3737孵育孵育3030分鐘。分鐘。2 2、 手工洗板：棄去反響條孔內(nèi)液體、手工洗板：棄去反響條孔內(nèi)液體、拍干、用洗滌液注滿每孔，棄去拍干，拍干、用洗滌液注滿每孔，棄去拍干，反復(fù)五次后拍干。反復(fù)五次后拍干。 ( (洗板機(jī)洗板：選擇洗滌五次程序洗板，洗板機(jī)洗板：選擇洗滌五次程序洗板，洗滌液注滿每孔，浸泡時(shí)間不短于洗滌液注滿每孔，浸泡時(shí)間不短于2020秒，洗滌程序完成后拍干。秒，洗滌程序完成后拍干。) )3 3、 加顯色劑：先加顯色劑加顯色劑：先加顯色劑A A每孔每孔1 1滴滴 (50(

47、50微升微升) )，然后再加顯色劑，然后再加顯色劑B B每孔每孔1 1滴滴 ( (約約5050微升，混勻，微升，混勻，3737孵育孵育1010分鐘。分鐘。 【結(jié)果判別】【結(jié)果判別】 比色法：比色法： 每孔加終止液每孔加終止液1 1滴滴 (50 (50微升微升) )，混勻，混勻，波長波長450nm450nm，先用空白孔校零點(diǎn)，然后，先用空白孔校零點(diǎn)，然后讀取各孔光密度值樣品讀取各孔光密度值樣品ODOD值值2.12.1判別判別為陽性，否那么為陰性。為陽性，否那么為陰性。備注：陰性對(duì)照平均備注：陰性對(duì)照平均ODOD值值 低于低于0.050.05作作0.050.05計(jì)算，高于計(jì)算，高于0.050.05

48、按實(shí)踐按實(shí)踐ODOD值計(jì)算。值計(jì)算。【本卷須知】1 1、 試劑盒置試劑盒置2288保管。保管。2 2、 運(yùn)用前試劑應(yīng)搖勻，并棄去運(yùn)用前試劑應(yīng)搖勻，并棄去1 12 2滴滴后垂直滴加。后垂直滴加。3 3、 從冷藏環(huán)境中取出試劑盒內(nèi)全部瓶從冷藏環(huán)境中取出試劑盒內(nèi)全部瓶裝試劑及待測標(biāo)本所需微孔條，置室裝試劑及待測標(biāo)本所需微孔條，置室溫平衡溫平衡3030分鐘后再行測試，余者應(yīng)及分鐘后再行測試，余者應(yīng)及時(shí)封存于冰箱中以備后用。時(shí)封存于冰箱中以備后用。4 4、 待測標(biāo)本不可用待測標(biāo)本不可用NaN3NaN3防腐。防腐。5 5、 不同批號(hào)試劑請(qǐng)勿通用。不同批號(hào)試劑請(qǐng)勿通用。6 6、 結(jié)果判別須在結(jié)果判別須在10

49、10分鐘內(nèi)完成。分鐘內(nèi)完成。7 7、 假設(shè)濃縮洗滌液出現(xiàn)結(jié)晶時(shí)，請(qǐng)置假設(shè)濃縮洗滌液出現(xiàn)結(jié)晶時(shí)，請(qǐng)置 3737至溶解。至溶解。 第四節(jié)第四節(jié) 放射免疫技術(shù)放射免疫技術(shù) 一、原理與方法一、原理與方法一原理一原理 放射免疫分析法放射免疫分析法radioimmunoassay RIAradioimmunoassay RIA 運(yùn)用競爭性結(jié)合的原理，運(yùn)用放射性同素運(yùn)用競爭性結(jié)合的原理，運(yùn)用放射性同素標(biāo)志抗原或抗體與相應(yīng)抗體或抗原結(jié)標(biāo)志抗原或抗體與相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合，經(jīng)過測定抗原抗體結(jié)合物的放射活性判別合，經(jīng)過測定抗原抗體結(jié)合物的放射活性判別結(jié)果。結(jié)果。 本方法可進(jìn)展超微量分析，敏感性高，可用本方法可進(jìn)展超

50、微量分析，敏感性高，可用于測定抗原、抗體、抗原抗體復(fù)合物。于測定抗原、抗體、抗原抗體復(fù)合物。 放射免疫標(biāo)志技術(shù)常用的同位素有放射免疫標(biāo)志技術(shù)常用的同位素有125125和和1311311 1、液相法、液相法 將待檢標(biāo)本例如含胰島素抗原將待檢標(biāo)本例如含胰島素抗原與定時(shí)的同位素標(biāo)志的胰島素抗原與定時(shí)的同位素標(biāo)志的胰島素抗原和定時(shí)的抗胰島素抗體混合，經(jīng)一定和定時(shí)的抗胰島素抗體混合，經(jīng)一定作用時(shí)間后，分別搜集抗原抗體復(fù)合作用時(shí)間后，分別搜集抗原抗體復(fù)合物及游離的抗原，測定這兩部分的放物及游離的抗原，測定這兩部分的放射活性，計(jì)算結(jié)合率。射活性，計(jì)算結(jié)合率。 放射免疫分析常用的有液相法和固相法兩種放射免疫分

51、析常用的有液相法和固相法兩種二方法2 2、固相法、固相法 將抗原或抗體吸附到固相載體外表，將抗原或抗體吸附到固相載體外表，然后加待檢標(biāo)本，最后加標(biāo)志抗體測然后加待檢標(biāo)本，最后加標(biāo)志抗體測定固相載體的放射活性。常用的固相定固相載體的放射活性。常用的固相載體有溴化氰載體有溴化氰CNBrCNBr海豹化的紙片海豹化的紙片或聚苯乙烯小管。或聚苯乙烯小管。二、放射免疫分析加樣程序二、放射免疫分析加樣程序一放射免疫分析順序飽和加樣程序一放射免疫分析順序飽和加樣程序1 1、根本原理、根本原理 先將規(guī)范物或血樣品與抗血清混勻，免先將規(guī)范物或血樣品與抗血清混勻，免疫反響疫反響6 624h24h，使抗原與抗體充分結(jié)

52、合，使抗原與抗體充分結(jié)合，甚至到達(dá)平衡，然后再參與標(biāo)志抗原，與甚至到達(dá)平衡，然后再參與標(biāo)志抗原，與抗體反響抗體反響121224h24h，最后分別，最后分別B B與與F F，這稱為，這稱為順序飽和分析法。順序飽和分析法。 2 2、加樣程序、加樣程序 以人血漿精氨酸加壓素以人血漿精氨酸加壓素RIARIA測定程序?yàn)槔郎y定程序?yàn)槔?直接測定。直接測定。1 1加樣單位加樣單位ll；總反響體；總反響體600l600l。2 2孵育：孵育：44，24h24h。3 3分別分別B B與與F F。無肽血漿，用于血漿的直接。無肽血漿，用于血漿的直接測定。其制備方法為：在電磁攪拌下，抽測定。其制備方法為：在電磁攪拌下，

53、抽取取2%2%加膜活性炭溶液加膜活性炭溶液5ml5ml，共兩管，離心、，共兩管，離心、去上清。血漿去上清。血漿5ml5ml，倒入上述活性炭管中，倒入上述活性炭管中，加蓋，充分振蕩加蓋，充分振蕩10min10min，離心，上清倒入上，離心，上清倒入上述另一活性炭管中，振蕩述另一活性炭管中，振蕩10min10min，再離心，再離心，取上清，即無肽血漿。取上清，即無肽血漿。二放射免疫分析平衡飽和加樣程序二放射免疫分析平衡飽和加樣程序1 1、根本原理、根本原理 所謂平衡飽和，是指抗原和抗體所謂平衡飽和，是指抗原和抗體反響到達(dá)即不結(jié)合，也不解離的平反響到達(dá)即不結(jié)合，也不解離的平衡形狀，稱為飽和形狀，即平

54、衡飽衡形狀，稱為飽和形狀，即平衡飽和。所以，有人稱此為飽和分析法。和。所以，有人稱此為飽和分析法。這意味著抗原或被測抗原、標(biāo)志抗這意味著抗原或被測抗原、標(biāo)志抗原、抗體三者一同溫育。原、抗體三者一同溫育。2 2、加樣程序、加樣程序 普通先加規(guī)范物或被測樣品，普通先加規(guī)范物或被測樣品，再加抗血清，最后加標(biāo)志物。這樣再加抗血清，最后加標(biāo)志物。這樣的順序是讓規(guī)范物或被測物與抗體的順序是讓規(guī)范物或被測物與抗體有短暫的結(jié)合，提高抗原的競爭抑有短暫的結(jié)合，提高抗原的競爭抑制才干。在小分子半抗原的放射免制才干。在小分子半抗原的放射免疫分析中，標(biāo)志抗原和未標(biāo)志抗原疫分析中，標(biāo)志抗原和未標(biāo)志抗原與抗體結(jié)合的親合力

55、經(jīng)常是不一樣與抗體結(jié)合的親合力經(jīng)常是不一樣的，前者比后者的親合力高。的，前者比后者的親合力高。 以大鼠垂體、下丘腦以大鼠垂體、下丘腦-內(nèi)啡肽內(nèi)啡肽RIARIA測定測定程序?yàn)槔撼绦驗(yàn)槔? 1加樣單位加樣單位ll；總反響體積；總反響體積500l500l。2 2孵育：孵育：44，24h24h。3 3分別分別B B與與F F：每管參與：每管參與2%2%加膜活性炭加膜活性炭溶液溶液300l300l，搖勻，立刻離心，去上，搖勻，立刻離心，去上清，測沉淀清，測沉淀F F的的cpmcpm數(shù)。數(shù)。三、放射免疫分析的質(zhì)量控制三、放射免疫分析的質(zhì)量控制一質(zhì)量控制的目的和內(nèi)容一質(zhì)量控制的目的和內(nèi)容 1 1、在一個(gè)

56、測定方法內(nèi)產(chǎn)生的誤差。、在一個(gè)測定方法內(nèi)產(chǎn)生的誤差。 2 2、在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不同方法之間產(chǎn)生的誤、在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不同方法之間產(chǎn)生的誤 差。這兩種情況屬于內(nèi)部質(zhì)量控制。差。這兩種情況屬于內(nèi)部質(zhì)量控制。 3 3、用同一測定方法，在各實(shí)驗(yàn)室之間產(chǎn)生、用同一測定方法，在各實(shí)驗(yàn)室之間產(chǎn)生 的誤差。的誤差。 4 4、采用不同方法，在各實(shí)驗(yàn)室之間產(chǎn)生的、采用不同方法，在各實(shí)驗(yàn)室之間產(chǎn)生的 誤差。后兩種情況屬于外部質(zhì)量控制。誤差。后兩種情況屬于外部質(zhì)量控制。二產(chǎn)生丈量誤差的要素二產(chǎn)生丈量誤差的要素三放射免疫分析中丈量誤差的控制三放射免疫分析中丈量誤差的控制1 1、選擇準(zhǔn)確性高的方法、選擇準(zhǔn)確性高的方法2 2、

57、建立方法對(duì)比、建立方法對(duì)比3 3、建立各種類型的規(guī)范。如規(guī)定規(guī)范品的、建立各種類型的規(guī)范。如規(guī)定規(guī)范品的 純度、制備方法、運(yùn)用年限及運(yùn)用條件純度、制備方法、運(yùn)用年限及運(yùn)用條件4 4、建立操作規(guī)程，按規(guī)程操作、建立操作規(guī)程，按規(guī)程操作5 5、建立可靠的檢查制度、建立可靠的檢查制度四、標(biāo)志抗原的放射免疫技術(shù)四、標(biāo)志抗原的放射免疫技術(shù)RIARIA一原一原 理理 將標(biāo)志抗原和未標(biāo)志抗原一同參與相應(yīng)的將標(biāo)志抗原和未標(biāo)志抗原一同參與相應(yīng)的抗體時(shí)那么兩種抗原產(chǎn)生相互的競爭，而生成抗體時(shí)那么兩種抗原產(chǎn)生相互的競爭，而生成有標(biāo)志抗原和抗體復(fù)合物以及非標(biāo)志抗原和抗有標(biāo)志抗原和抗體復(fù)合物以及非標(biāo)志抗原和抗體復(fù)合物。

58、二者含量在一定限制內(nèi)呈反比，利體復(fù)合物。二者含量在一定限制內(nèi)呈反比，利用此法可測定未知抗原或抗體。用此法可測定未知抗原或抗體。 抗體為限量的抗體為限量的二放射免疫抗原的制備二放射免疫抗原的制備1 1、完全抗原、完全抗原 為了保證免疫反響的特異性，放射免為了保證免疫反響的特異性，放射免疫抗原純度必需在疫抗原純度必需在90%90%以上。通常采用電以上。通常采用電泳、凝膠過濾、離子交換層析等技術(shù)獲泳、凝膠過濾、離子交換層析等技術(shù)獲得較高純度的抗原。得較高純度的抗原。2 2、半抗原、半抗原 要獲得較好的免疫原性，必需將半抗原要獲得較好的免疫原性，必需將半抗原與蛋白質(zhì)大分子的載體結(jié)合起來構(gòu)成一個(gè)完與蛋白

59、質(zhì)大分子的載體結(jié)合起來構(gòu)成一個(gè)完全抗原。結(jié)合的載體，通常包括血潔白蛋白、全抗原。結(jié)合的載體，通常包括血潔白蛋白、 球蛋白、纖維蛋白、甲狀腺球蛋白、雞卵蛋球蛋白、纖維蛋白、甲狀腺球蛋白、雞卵蛋白等白等三抗體的制備與提純?nèi)贵w的制備與提純 四抗原的標(biāo)志四抗原的標(biāo)志1 1、放射性同位素的選擇、放射性同位素的選擇 選擇同位素的原那選擇同位素的原那么：么： 方法簡單、經(jīng)濟(jì)、便于推行運(yùn)用。方法簡單、經(jīng)濟(jì)、便于推行運(yùn)用。 易于防護(hù)。易于防護(hù)。 同位素與標(biāo)志物結(jié)合好，不易從標(biāo)志物同位素與標(biāo)志物結(jié)合好，不易從標(biāo)志物上零落。上零落。 對(duì)標(biāo)志物不引起輻射損傷，使蛋白變性。對(duì)標(biāo)志物不引起輻射損傷，使蛋白變性。 具有較

60、高的計(jì)數(shù)效率。目前常用的同位具有較高的計(jì)數(shù)效率。目前常用的同位素有素有3H3H、125 I125 I，其它還有，其它還有14C14C、35S35S和和32P32P等。等。表表1 1 各種標(biāo)志同位素的性質(zhì)比較各種標(biāo)志同位素的性質(zhì)比較同位素同位素毒性分類毒性分類半衰期半衰期3 3H H1414C C131131I I125125I I3535S S3232P P低毒低毒低毒低毒高毒高毒低毒低毒中毒中毒中毒中毒12.2612.26年年57305730年年8.078.07天天60.2060.20天天67.4867.48天天14.2614.26天天2 2、標(biāo)志方法、標(biāo)志方法 目前常用的是碘標(biāo)志目前常用的