蛋白質(zhì)與酶工程酶的提取分離和純化

1、 蛋白質(zhì)與酶工程蛋白質(zhì)與酶工程酶的提取、分離和純化酶的提取、分離和純化檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院張雪梅一、概述一、概述二、酶的提取二、酶的提取三、酶的分離純化三、酶的分離純化四、酶的結(jié)晶四、酶的結(jié)晶五、濃縮與干燥五、濃縮與干燥六、酶純化步驟的設(shè)計(jì)及評(píng)價(jià)六、酶純化步驟的設(shè)計(jì)及評(píng)價(jià)酶的提取、分離和純化 一、概述一、概述 1-1 1-1 酶提取與分離純化的定義酶提取與分離純化的定義 將酶從細(xì)胞或其它含酶原料中將酶從細(xì)胞或其它含酶原料中提取提取出來(lái)，出來(lái)，再與再與其它物質(zhì)分開(kāi)其它物質(zhì)分開(kāi)，從而獲得所需酶的技，從而獲得所需酶的技術(shù)過(guò)程術(shù)過(guò)程 * *酶的純化程度根據(jù)酶的純化程度根據(jù)需要需要而定而定 * *純化方法多種多樣

2、，為獲得較好的效純化方法多種多樣，為獲得較好的效果往往是果往往是2 2種或種或2 2種以上種以上聯(lián)合應(yīng)用聯(lián)合應(yīng)用 1-2 1-2 提取純化之目的提取純化之目的1)1)酶催化功能的應(yīng)用酶催化功能的應(yīng)用2)2)酶學(xué)研究酶學(xué)研究 酶的結(jié)構(gòu)、功能、催化機(jī)制、催化動(dòng)力學(xué)酶的結(jié)構(gòu)、功能、催化機(jī)制、催化動(dòng)力學(xué) 酶的生物合成及其調(diào)控規(guī)律等酶的生物合成及其調(diào)控規(guī)律等 1-3 1-3 純化的必要性純化的必要性1)1)生物細(xì)胞中同時(shí)存在多種多樣的酶生物細(xì)胞中同時(shí)存在多種多樣的酶2)2)多酶可能作用于同一個(gè)底物多酶可能作用于同一個(gè)底物3)3)酶在生物細(xì)胞中的分布并不是均一的酶在生物細(xì)胞中的分布并不是均一的二、酶的提取

3、二、酶的提取（extraction)extraction)2-1 2-1 了解所分離酶在細(xì)胞中的分布了解所分離酶在細(xì)胞中的分布 1 1、細(xì)胞外酶：、細(xì)胞外酶：由細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生后分泌到胞外發(fā)揮作用由細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生后分泌到胞外發(fā)揮作用的酶；大多屬于的酶；大多屬于水解酶水解酶，通常含量高，容易得到，通常含量高，容易得到2 2、細(xì)胞內(nèi)酶、細(xì)胞內(nèi)酶：在細(xì)胞內(nèi)合成后并不分泌到細(xì)胞外，：在細(xì)胞內(nèi)合成后并不分泌到細(xì)胞外，而在細(xì)胞內(nèi)起催化作用。該類(lèi)酶在細(xì)胞內(nèi)往往與而在細(xì)胞內(nèi)起催化作用。該類(lèi)酶在細(xì)胞內(nèi)往往與細(xì)胞器結(jié)合，不僅有一定的細(xì)胞器結(jié)合，不僅有一定的區(qū)域性，區(qū)域性，而且催化的而且催化的反應(yīng)具有一定反應(yīng)具有一定順序性順

4、序性 v真核細(xì)胞內(nèi)酶的分布真核細(xì)胞內(nèi)酶的分布細(xì)胞膜：細(xì)胞膜：ATPATP酶、腺苷酸環(huán)化酶等酶、腺苷酸環(huán)化酶等細(xì)胞核：細(xì)胞核：DNADNA聚合酶、連接酶和聚合酶、連接酶和RNARNA聚合酶等聚合酶等線粒體線粒體：三羧酸循環(huán)、電子傳遞、氧化磷酸化、尿素循三羧酸循環(huán)、電子傳遞、氧化磷酸化、尿素循環(huán)、脂肪酸氧化、脂肪酸合成酶以及蛋白質(zhì)合成、環(huán)、脂肪酸氧化、脂肪酸合成酶以及蛋白質(zhì)合成、DNADNA聚聚合酶、合酶、RNARNA聚合酶等聚合酶等高爾基體：高爾基體：多糖、核蛋白粘液生成酶多糖、核蛋白粘液生成酶溶酶體：溶酶體：各種水解酶等各種水解酶等葉綠體：葉綠體：參與光合作用形成參與光合作用形成ATPATP、

5、NADPHNADPH有關(guān)的酶有關(guān)的酶類(lèi)、與暗反應(yīng)有關(guān)的酶系類(lèi)、與暗反應(yīng)有關(guān)的酶系線粒體主要酶的分布（約有線粒體主要酶的分布（約有120120種酶）種酶）部部 位位酶酶 的的 名名 稱(chēng)稱(chēng)外外 膜膜單胺氧化酶、犬尿氨酸羥化酶、單胺氧化酶、犬尿氨酸羥化酶、NADH-NADH-細(xì)胞色素細(xì)胞色素C C還原酶、還原酶、脂類(lèi)代謝有關(guān)的酶（?；o酶脂類(lèi)代謝有關(guān)的酶（?；o酶A A合成酶、脂肪酸激酶等）合成酶、脂肪酸激酶等）特征酶：特征酶：?jiǎn)伟费趸竼伟费趸改つ?間間 隙隙腺苷酸激酶、核苷酸激酶、二磷酸激酶、亞硫酸氧化酶腺苷酸激酶、核苷酸激酶、二磷酸激酶、亞硫酸氧化酶特征酶：特征酶：腺苷酸激酶腺苷酸激酶內(nèi)內(nèi)

6、膜膜細(xì)胞色素氧化酶、琥珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素氧化酶、琥珀酸脫氫酶、NADHNADH脫氫酶、肉堿?；摎涿?、肉堿?；D(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)移酶、 - -羥丁酸和羥丁酸和 - -羥丙酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、羥丙酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、ATPATP合成酶系、腺嘌呤核苷酸載體合成酶系、腺嘌呤核苷酸載體特征酶：特征酶：細(xì)胞色素（細(xì)胞色素（c c）氧化酶）氧化酶基基 質(zhì)質(zhì)檸檬酸合成酶、烏頭酸酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、檸檬酸合成酶、烏頭酸酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、延胡索酸酶、谷氨酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶復(fù)合體、天冬氨延胡索酸酶、谷氨酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶復(fù)合體、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)和核酸合成酶系、脂肪

7、酸氧化酶系酸氨基轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)和核酸合成酶系、脂肪酸氧化酶系特征酶：特征酶：蘋(píng)果酸脫氫酶蘋(píng)果酸脫氫酶2-2 2-2 起始材料的選擇起始材料的選擇 原則：原則：選取酶含量高的材料選取酶含量高的材料 可以是可以是天然天然的動(dòng)植物的動(dòng)植物 或或人工培養(yǎng)人工培養(yǎng)的微生物、動(dòng)植物細(xì)胞等的微生物、動(dòng)植物細(xì)胞等 * *注意材料的生長(zhǎng)階段注意材料的生長(zhǎng)階段 * *注意酶在生物體內(nèi)的富集區(qū)域注意酶在生物體內(nèi)的富集區(qū)域 由于從動(dòng)物內(nèi)臟或植物果實(shí)中提取酶制劑受由于從動(dòng)物內(nèi)臟或植物果實(shí)中提取酶制劑受到到原料原料和和成本的限制成本的限制，因此，目前，因此，目前工業(yè)上工業(yè)上大多采大多采用培養(yǎng)微生物用培養(yǎng)微生物的方法來(lái)獲得

8、大量的酶制劑的方法來(lái)獲得大量的酶制劑2-3 2-3 細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的破碎細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的破碎1 1、主要方法：、主要方法： 1 1） 2 2）l 超聲波破碎法超聲波破碎法 3 3） 4 4）2 2、選擇原則、選擇原則如酶法+超聲 2-4 2-4 酶的提取酶的提取 1 1、定義、定義 在適當(dāng)條件下，用適當(dāng)?shù)奶崛∫禾幚砗冈希谶m當(dāng)條件下，用適當(dāng)?shù)奶崛∫禾幚砗冈?，使使酶充分溶于其中酶充分溶于其中的過(guò)程。的過(guò)程。 2 2、提取液的選擇、提取液的選擇 根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和和溶解特性溶解特性來(lái)選擇適當(dāng)?shù)奶崛∫簛?lái)選擇適當(dāng)?shù)奶崛∫?* *極性物質(zhì)極性物質(zhì)易溶解于易溶解于極性溶劑，極性溶劑，反之，

9、反之，即即相似相溶相似相溶 * *酸性物質(zhì)酸性物質(zhì)易溶解于易溶解于堿性溶液堿性溶液，反之亦然。反之亦然。2-4 2-4 酶的提取酶的提取3 3、常用的提取液：酶通常都溶于、常用的提取液：酶通常都溶于水水，因此通常用水，因此通常用水作為溶劑，配制成一定濃度的稀酸、稀堿、稀鹽作為溶劑，配制成一定濃度的稀酸、稀堿、稀鹽溶液進(jìn)行抽提溶液進(jìn)行抽提4 4、有些酶、有些酶與脂質(zhì)結(jié)合與脂質(zhì)結(jié)合或或含有較多的非極性基團(tuán)含有較多的非極性基團(tuán)，則則可用可用有機(jī)溶劑抽提，如：有機(jī)溶劑抽提，如：丙酮粉，丙酮粉，有助于有助于酶與脂酶與脂肪或磷脂膜分離；肪或磷脂膜分離； 高離子強(qiáng)度水溶液也高離子強(qiáng)度水溶液也有助于有助于酶從

10、結(jié)合的膜上解酶從結(jié)合的膜上解析下來(lái)。析下來(lái)。2-5 2-5 主要的提取方法主要的提取方法1 1、鹽溶液提取、鹽溶液提取 該法用于在該法用于在低濃度鹽溶液中溶解度大的酶低濃度鹽溶液中溶解度大的酶的提取的提取 常用的鹽濃度：常用的鹽濃度：0.02-0.05mol/L0.02-0.05mol/L，大多數(shù)，大多數(shù)P P酶酶用該用該 法提取法提取 R R酶酶常用常用0.14mol/L0.14mol/L的的NaClNaCl溶液提取。溶液提取。 * *鹽溶現(xiàn)象：鹽溶現(xiàn)象：低鹽條件下，酶在水中的溶解度隨鹽濃度升高低鹽條件下，酶在水中的溶解度隨鹽濃度升高而增加的現(xiàn)象而增加的現(xiàn)象 * *鹽析現(xiàn)象：鹽析現(xiàn)象：當(dāng)鹽濃

11、度達(dá)到一定界限后，酶的溶解度則隨鹽當(dāng)鹽濃度達(dá)到一定界限后，酶的溶解度則隨鹽濃度升高而降低的現(xiàn)象濃度升高而降低的現(xiàn)象2 2、酸溶液提取、酸溶液提取 在酸性條件下在酸性條件下溶解度大并穩(wěn)定溶解度大并穩(wěn)定的酶可用此法的酶可用此法 如：胰蛋白酶（如：胰蛋白酶（pI=8.9）可用可用0.12mol/L0.12mol/L的硫酸的硫酸溶液溶液3 3、堿溶液提取、堿溶液提取 在堿性條件下在堿性條件下溶解度大并穩(wěn)定溶解度大并穩(wěn)定的酶該法適用的酶該法適用 如：大腸埃希菌的如：大腸埃希菌的L-L-天冬酰胺酶（天冬酰胺酶（pI=4.85）可可用用pH11-12.5pH11-12.5的溶液的溶液 4 4、有機(jī)溶劑提?。?/p>

12、如、有機(jī)溶劑提?。喝缑概c脂質(zhì)結(jié)合牢固，或含酶與脂質(zhì)結(jié)合牢固，或含有較多非極性基團(tuán)的酶，可用有較多非極性基團(tuán)的酶，可用與水混溶的有機(jī)與水混溶的有機(jī)溶劑溶劑（乙醇、丙酮、丁醇等），（乙醇、丙酮、丁醇等），如：如： P P酶：酶：膽堿酯酶、細(xì)胞色素氧化酶、琥珀酸脫膽堿酯酶、細(xì)胞色素氧化酶、琥珀酸脫氫酶等用氫酶等用丁醇丁醇萃取，有較好效果萃取，有較好效果 R R酶：酶：可用可用酸苯酚溶液酸苯酚溶液提取提取 主要的提取方法小結(jié)主要的提取方法小結(jié)地5 5、影響酶提取的其它重要因素、影響酶提取的其它重要因素l溫度：溫度：適當(dāng)提高，適當(dāng)提高，可以提高酶的溶解度和酶分子可以提高酶的溶解度和酶分子的擴(kuò)散速度；的擴(kuò)

13、散速度；過(guò)高過(guò)高則引起酶失活則引起酶失活lpH:pH: 在等電點(diǎn)條件下，酶的溶解度最小；為提高在等電點(diǎn)條件下，酶的溶解度最??；為提高溶解度，要溶解度，要避開(kāi)酶的等電點(diǎn)避開(kāi)酶的等電點(diǎn); ;但是，也但是，也不宜偏離不宜偏離pIpI太遠(yuǎn)太遠(yuǎn)（過(guò)高或過(guò)低），以免引起（過(guò)高或過(guò)低），以免引起酶變性失活酶變性失活l 提取液體積提取液體積 * *適當(dāng)增加其體積，可以提高酶的產(chǎn)率適當(dāng)增加其體積，可以提高酶的產(chǎn)率 * *過(guò)量，則降低過(guò)量，則降低 酶酶 ，增加后續(xù)分離純化的難度，增加后續(xù)分離純化的難度 一般為一般為原始材料的原始材料的3-53-5倍，倍，且分且分3 3次使用次使用 l 加入保護(hù)劑，加入保護(hù)劑，以提

14、高酶的穩(wěn)定性以提高酶的穩(wěn)定性 如酶的如酶的底物、輔酶底物、輔酶和某些和某些抗氧化劑抗氧化劑 三、酶的分離純化三、酶的分離純化（isolation,separation) ( purification)isolation,separation) ( purification) 3-1 3-1 分離純化方法分類(lèi)分離純化方法分類(lèi) 1 1、基于分子大小或質(zhì)量、基于分子大小或質(zhì)量 (1)(1)離心離心 (2)(2)透析透析 (3)(3)凝膠過(guò)濾凝膠過(guò)濾 (4)(4)超過(guò)濾超過(guò)濾 2 2、基于電荷、基于電荷 (1) (1) 離子交換色譜離子交換色譜 (2) (2) 電泳電泳 (3) (3) 等電聚焦等電聚

15、焦 3 3、基于溶解度、基于溶解度 改變改變pHpH、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)等實(shí)現(xiàn)的、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)等實(shí)現(xiàn)的沉淀分離：沉淀分離： (1) (1) 鹽析法鹽析法 (2) (2) 復(fù)合沉淀法復(fù)合沉淀法 (3) (3) 有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法 (4) (4) 等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法 (5) (5) 選擇性變性沉淀法選擇性變性沉淀法4 4、基于特異性結(jié)合位置、基于特異性結(jié)合位置/ /親和力的差異親和力的差異 親和色譜（層析）親和色譜（層析）5 5、其它方法（略）、其它方法（略） （1 1）基于分配系數(shù)的差異：雙水相系統(tǒng)萃取法）基于分配系數(shù)的差異：雙水相系統(tǒng)萃取法 （2 2）基于疏水作用的差異：

16、疏水層析）基于疏水作用的差異：疏水層析 （3 3）在磷酸鈣凝膠柱上分級(jí)吸附）在磷酸鈣凝膠柱上分級(jí)吸附 （4 4）羥基磷灰石色譜）羥基磷灰石色譜 （5 5）冷凍干燥（濃縮）冷凍干燥（濃縮）1 1、沉淀分離、沉淀分離3-2 3-2 常用的分離純化方法常用的分離純化方法取正常人血清5ml加等量生理鹽水混勻攪拌下逐滴加入飽和硫酸銨使飽和度為204，10min離心(3000rpm), 10min，棄沉淀 上清繼續(xù)滴加飽和硫酸銨使飽和度為50 。 置4，3小時(shí)以上離心(3000rpm), 10min，棄上清所得沉淀物以0.02M PH7.4 PBS溶解至5ml 裝入透析袋中對(duì)PBS充分透析（換液3次）萘氏

17、試劑測(cè)透析外液無(wú)黃色取少許透析袋液適當(dāng)倍數(shù)稀釋后，測(cè)蛋白含量。 例例 鹽析純化血清免疫球蛋白鹽析純化血清免疫球蛋白2 2、離心（、離心（centrifugation)centrifugation)（1 1）定義：）定義：利用離心機(jī)旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力，使利用離心機(jī)旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力，使不不同大小、不同密度同大小、不同密度的顆粒分離的技術(shù)過(guò)程。的顆粒分離的技術(shù)過(guò)程。 * *優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：處理量大，可達(dá)幾升處理量大，可達(dá)幾升 * *離心條件的選擇：離心條件的選擇：以靶酶與雜質(zhì)的顆粒大小、以靶酶與雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的差異為依據(jù)，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、密度和特性的差異為依據(jù)，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離心方法和離

18、心條件離心方法和離心條件 v常速常速/ /低速離心機(jī)：低速離心機(jī)：主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘?jiān)瑞B(yǎng)基殘?jiān)扔行挝镔|(zhì)分離有形物質(zhì)分離，也可分離，也可分離較大顆粒的酶較大顆粒的酶結(jié)晶分離；結(jié)晶分離；v高速離心機(jī)高速離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速：最大轉(zhuǎn)速1 12.5x102.5x104 4rpmrpm。在酶的分離。在酶的分離中，主要用于中，主要用于沉淀沉淀及細(xì)胞碎片和細(xì)胞器的及細(xì)胞碎片和細(xì)胞器的分離；分離；為為防止離心過(guò)程中溫度升高而致酶失活，一般用防止離心過(guò)程中溫度升高而致酶失活，一般用高速高速冷凍離心機(jī)；冷凍離心機(jī)；v超速離心機(jī)超速離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速達(dá)：最大轉(zhuǎn)速達(dá)2.52.51

19、2x1012x104 4rpmrpm。主要用。主要用于于DNADNA、RNARNA（酶）、蛋白質(zhì)（酶）、蛋白質(zhì)( (酶）等酶）等生物大分子以生物大分子以及細(xì)胞器、病毒及細(xì)胞器、病毒等的分離純化等。等的分離純化等。（2 2）離心機(jī)的常用分類(lèi)）離心機(jī)的常用分類(lèi) 差速離心差速離心（differential centrifugation)differential centrifugation)：即采用即采用不同的離心速度和離心時(shí)間不同的離心速度和離心時(shí)間，使不同沉降使不同沉降速度的顆粒速度的顆粒分批分離分批分離。 主要用于分離那些差異大的顆粒；操作簡(jiǎn)單、主要用于分離那些差異大的顆粒；操作簡(jiǎn)單、方便，但

20、是方便，但是分離效果較差，一般用于粗分。分離效果較差，一般用于粗分。（3 3）離心方法的選擇）離心方法的選擇 差速離心舉例差速離心舉例沉淀：細(xì)沉淀：細(xì)胞核胞核上清液上清液沉淀：線粒體沉淀：線粒體 溶酶溶酶體體 細(xì)胞膜碎片細(xì)胞膜碎片 上清液上清液沉淀：沉淀：核糖核蛋白體核糖核蛋白體上清液：上清液：可溶性成分可溶性成分500g,10min500g,10min已經(jīng)破碎的細(xì)胞已經(jīng)破碎的細(xì)胞10,000g,10min10,000g,10min100,000g,3h100,000g,3h 密度梯度離心：密度梯度離心：用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成連續(xù)或不連續(xù)的成連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，

21、密度梯度，通過(guò)重力或離心力通過(guò)重力或離心力場(chǎng)的作用，使樣品中的組份依據(jù)其場(chǎng)的作用，使樣品中的組份依據(jù)其沉降速率沉降速率和和密密度的不同度的不同而而分層、分離分層、分離 這類(lèi)分離又分為：這類(lèi)分離又分為： 差速差速- -區(qū)帶（區(qū)帶（RateZonalRateZonal，R-ZR-Z） 等密度（等密度（IsopycnicIsopycnic）/ /平衡密度梯度離心平衡密度梯度離心 A. A.差速差速- -區(qū)帶區(qū)帶(R-Z)(R-Z)：是根據(jù)分離的顆粒在梯度是根據(jù)分離的顆粒在梯度液中液中沉降速度的不同沉降速度的不同，在離心力作用下處于不同，在離心力作用下處于不同密度梯度層，從而形成密度梯度層，從而形成一

22、系列區(qū)帶，一系列區(qū)帶，達(dá)到彼此分達(dá)到彼此分離的目的。離的目的。 方法：方法：在離心前于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)在離心前于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)（如蔗糖、甘油、（如蔗糖、甘油、CsClCsCl等），待分離的樣品以很等），待分離的樣品以很薄的一層鋪在梯度液的上部，在離心過(guò)程中由于薄的一層鋪在梯度液的上部，在離心過(guò)程中由于不同組份在梯度液中沉降速率的差別，而在離心不同組份在梯度液中沉降速率的差別，而在離心的的某一時(shí)刻某一時(shí)刻形成了形成了數(shù)個(gè)分別含數(shù)個(gè)分別含不同組份顆粒不同組份顆粒的區(qū)的區(qū)帶。帶。 B. B.平衡密度梯度離心法平衡密度梯度離心法（equilibrium density equil

23、ibrium density gradient centrifigationgradient centrifigation) )/ /等密度梯度離心法等密度梯度離心法 當(dāng)欲分離的不同顆粒的當(dāng)欲分離的不同顆粒的 密度不同時(shí)，密度不同時(shí)，配制包含其配制包含其 密度范圍的離心介質(zhì)，在離心力作用下，不同浮力密度范圍的離心介質(zhì)，在離心力作用下，不同浮力密度的顆?；虺两怠⒒蛏细?，只要時(shí)間足夠長(zhǎng)，就密度的顆粒或沉降、或上浮，只要時(shí)間足夠長(zhǎng)，就可以一直移動(dòng)到與它們各自的可以一直移動(dòng)到與它們各自的浮力密度恰好相等的浮力密度恰好相等的位置位置（等密度點(diǎn)），等密度點(diǎn)），形成區(qū)帶，從而實(shí)現(xiàn)分離目的形成區(qū)帶，從而實(shí)現(xiàn)分

24、離目的 常用介質(zhì)：常用介質(zhì)：銫鹽（氯化銫，硫酸銫，溴化銫等）銫鹽（氯化銫，硫酸銫，溴化銫等） （4 4）注意）注意離心溫度離心溫度和和介質(zhì)介質(zhì)pHpH的影響，以免目的的影響，以免目的酶酶凝集、變性和失活凝集、變性和失活，甚至引起轉(zhuǎn)子和離心機(jī)其，甚至引起轉(zhuǎn)子和離心機(jī)其它部件的它部件的腐蝕。腐蝕。 * *一般一般44左右，耐熱酶除外左右，耐熱酶除外 * *必須是酶穩(wěn)定的范圍內(nèi)，必要時(shí)采用緩沖液必須是酶穩(wěn)定的范圍內(nèi)，必要時(shí)采用緩沖液3 3、過(guò)濾與膜分離、過(guò)濾與膜分離（1 1）透析）透析 透析（透析（dialysis)dialysis)：利：利用用小分子物質(zhì)的擴(kuò)散作小分子物質(zhì)的擴(kuò)散作用，用，使小分子不

25、斷透過(guò)使小分子不斷透過(guò)半透膜而半透膜而擴(kuò)散到膜外，擴(kuò)散到膜外，而大分子則被截留于膜而大分子則被截留于膜內(nèi)，內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)分離。從而實(shí)現(xiàn)分離。用途：用途：去除酶液中無(wú)機(jī)鹽、有去除酶液中無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)溶劑或低分子量的抑制劑機(jī)溶劑或低分子量的抑制劑缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：耗時(shí)；透析結(jié)束后，樣耗時(shí)；透析結(jié)束后，樣品體積大，濃度低，難于工品體積大，濃度低，難于工業(yè)化生產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn) 透析膜透析膜是帶有微孔的篩是帶有微孔的篩子，其孔徑在一定范圍內(nèi)子，其孔徑在一定范圍內(nèi)是可選的；可用動(dòng)物膜、是可選的；可用動(dòng)物膜、羊皮紙、火棉膠等制成。羊皮紙、火棉膠等制成。 定義：定義：以膜兩邊的以膜兩邊的流體靜壓差為推動(dòng)力流體靜壓差為推動(dòng)力的

26、膜分離技的膜分離技術(shù)。在靜壓差作用下，小于孔徑的顆粒穿過(guò)膜孔，術(shù)。在靜壓差作用下，小于孔徑的顆粒穿過(guò)膜孔，而大于孔徑者被截留。而大于孔徑者被截留。 超濾膜截留的顆粒直徑為超濾膜截留的顆粒直徑為2-200nm2-200nm，相等于分，相等于分子量子量1x101x103 3-5x10-5x105 5，主要用于，主要用于病毒病毒和和各種生物大分各種生物大分子的分離。子的分離。 壓力一般由壓縮氣體來(lái)維持，操作壓力一般控壓力一般由壓縮氣體來(lái)維持，操作壓力一般控制在制在0.1-0.7MPa0.1-0.7MPa （2 2）超）超 濾（濾（ultrafiltration)ultrafiltration) 超濾

27、技術(shù)的優(yōu)勢(shì)：超濾技術(shù)的優(yōu)勢(shì)：v是純物理過(guò)程，是純物理過(guò)程，不會(huì)改變產(chǎn)品不會(huì)改變產(chǎn)品的理化性能和活性的理化性能和活性v與離心和層析法比，與離心和層析法比，處理量大，時(shí)間短，易線性處理量大，時(shí)間短，易線性放大，成本較低放大，成本較低v收集細(xì)胞效果優(yōu)良，處理量大，保持細(xì)胞活性良收集細(xì)胞效果優(yōu)良，處理量大，保持細(xì)胞活性良好，操作簡(jiǎn)單好，操作簡(jiǎn)單v可以進(jìn)行多種工藝的處理，可以進(jìn)行多種工藝的處理，如：細(xì)胞、菌體收集、如：細(xì)胞、菌體收集、破碎后的澄清過(guò)濾、分離、濃縮、緩沖液更換等破碎后的澄清過(guò)濾、分離、濃縮、緩沖液更換等v投資小，通用性強(qiáng)投資小，通用性強(qiáng)超濾技術(shù)應(yīng)用：超濾技術(shù)應(yīng)用：v 濃縮和透析濃縮和透析v

28、 除熱源除熱源v 脫鹽和緩沖液交換脫鹽和緩沖液交換v 小分子處理小分子處理v 細(xì)胞收集細(xì)胞收集/ /澄清澄清v 病毒收集病毒收集/ /澄清澄清4 4、色譜法（層析法）、色譜法（層析法）（1） 離子交換色譜（層析）離子交換色譜（層析）定義：定義： Ion Exchange Chromatography：以離子交以離子交換劑為換劑為固定相固定相，特定的離子溶液為，特定的離子溶液為流動(dòng)相流動(dòng)相，依據(jù)，依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同進(jìn)行分離純化的層析方式。同進(jìn)行分離純化的層析方式。使用規(guī)?？纱罂尚?；純化倍數(shù)為使用規(guī)模可大可?。患兓稊?shù)為101

29、0左右左右離子交換劑分類(lèi)離子交換劑分類(lèi) 按其活性基團(tuán)的不同來(lái)分按其活性基團(tuán)的不同來(lái)分 *陽(yáng)離子交換劑：陽(yáng)離子交換劑：其活性基團(tuán)為酸性基團(tuán)（如磺酸其活性基團(tuán)為酸性基團(tuán)（如磺酸基，磷酸基，羧基等），在一定條件下，可以解基，磷酸基，羧基等），在一定條件下，可以解離出氫離子（離出氫離子（H+)與其它陽(yáng)離子進(jìn)行交換，故稱(chēng)與其它陽(yáng)離子進(jìn)行交換，故稱(chēng)（如：（如： *陰離子交換劑：陰離子交換劑：其活性基團(tuán)為堿性基團(tuán)（季胺，其活性基團(tuán)為堿性基團(tuán)（季胺，叔胺，仲胺，伯胺等），在一定條件下可解離出叔胺，仲胺，伯胺等），在一定條件下可解離出OH-與其它陰離子交換。如：與其它陰離子交換。如： 按母體的種類(lèi)分：按母體的種

30、類(lèi)分：母體（基質(zhì)）一般是不溶性聚母體（基質(zhì)）一般是不溶性聚合物，如樹(shù)脂、纖維素、葡聚糖、醇脂糖等合物，如樹(shù)脂、纖維素、葡聚糖、醇脂糖等 *離子交換離子交換纖維素纖維素: 是纖維素作為母體，交換容量大是纖維素作為母體，交換容量大（0.2-1.0mg/克干膠）克干膠）*離子交換離子交換樹(shù)脂樹(shù)脂: 聚苯乙烯樹(shù)脂為母體聚苯乙烯樹(shù)脂為母體*離子交換離子交換凝膠凝膠: 葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠為母體，葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠為母體，交換容量更大交換容量更大2.5-4.5mg/克干膠）克干膠）離子交換層析的基本步驟離子交換層析的基本步驟解吸方法解吸方法-洗脫原理洗脫原理 蛋白質(zhì)是通過(guò)蛋白質(zhì)是通過(guò)靜電引力靜電引力

31、可逆結(jié)合在相應(yīng)的離子可逆結(jié)合在相應(yīng)的離子交換劑上，洗脫蛋白質(zhì)（即打開(kāi)蛋白質(zhì)與離子交交換劑上，洗脫蛋白質(zhì)（即打開(kāi)蛋白質(zhì)與離子交換劑之間的離子鍵）的換劑之間的離子鍵）的常用方法常用方法： 加大反離子的濃度，加大反離子的濃度，常用的反離子是常用的反離子是NaCl 改變?nèi)芤旱母淖內(nèi)芤旱膒H （改變結(jié)合基團(tuán)的電荷）（改變結(jié)合基團(tuán)的電荷） 同時(shí)同時(shí)改變改變pH與與離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度分離酶蛋白時(shí)交換劑選擇的一般原則：分離酶蛋白時(shí)交換劑選擇的一般原則： 根據(jù)酶穩(wěn)定性的需要：根據(jù)酶穩(wěn)定性的需要： *酶蛋白穩(wěn)定存在的酶蛋白穩(wěn)定存在的pHpI，用陰離子交換劑，用陰離子交換劑 *兩種兩種pH條件下均能穩(wěn)定存在，二種交換

32、劑條件下均能穩(wěn)定存在，二種交換劑均可均可 也稱(chēng)凝膠層析、凝膠過(guò)濾或分子排阻也稱(chēng)凝膠層析、凝膠過(guò)濾或分子排阻層析：是指以各種多孔凝膠為層析：是指以各種多孔凝膠為固定相固定相，利用利用流動(dòng)相流動(dòng)相中所含有各種組份的中所含有各種組份的相對(duì)分相對(duì)分子量不同而達(dá)到分離子量不同而達(dá)到分離的一種層析技術(shù)的一種層析技術(shù) 2020世紀(jì)世紀(jì)5050年代末發(fā)展起來(lái)的快速簡(jiǎn)便的分年代末發(fā)展起來(lái)的快速簡(jiǎn)便的分離技術(shù)離技術(shù)操作簡(jiǎn)便，不需要再生處理即可反復(fù)操作簡(jiǎn)便，不需要再生處理即可反復(fù)使用，適用于分子量不同的各種物質(zhì)的分離使用，適用于分子量不同的各種物質(zhì)的分離（2 2）分子篩層析）分子篩層析l原理：原理： 其其分離是因?yàn)?/p>

33、不同大小的分子或進(jìn)入或不進(jìn)入分離是因?yàn)椴煌笮〉姆肿踊蜻M(jìn)入或不進(jìn)入凝膠微孔，因而凝膠微孔，因而所經(jīng)過(guò)的路程不同所經(jīng)過(guò)的路程不同、走過(guò)柱全長(zhǎng)、走過(guò)柱全長(zhǎng)所需的時(shí)間各異，實(shí)現(xiàn)彼此分離的目的：所需的時(shí)間各異，實(shí)現(xiàn)彼此分離的目的： 能進(jìn)入微孔的小分子能進(jìn)入微孔的小分子不斷地進(jìn)出于一個(gè)個(gè)凝膠不斷地進(jìn)出于一個(gè)個(gè)凝膠顆粒的微孔，做無(wú)定向的分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)（布朗運(yùn)顆粒的微孔，做無(wú)定向的分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)（布朗運(yùn)動(dòng)），因而其向下動(dòng)），因而其向下移動(dòng)的速度就很慢移動(dòng)的速度就很慢； 不能進(jìn)入微孔的不能進(jìn)入微孔的大分子大分子則只能分布于凝膠顆粒則只能分布于凝膠顆粒的間隙，隨溶液流動(dòng)而進(jìn)行的間隙，隨溶液流動(dòng)而進(jìn)行垂直向下的移動(dòng)，

34、以垂直向下的移動(dòng)，以較快較快的速度通過(guò)凝膠柱。的速度通過(guò)凝膠柱。l凝膠材料種類(lèi)凝膠材料種類(lèi) 層析用的微孔凝膠是層析用的微孔凝膠是凝膠材料凝膠材料與與交聯(lián)劑交聯(lián)劑交聯(lián)聚合而交聯(lián)聚合而成的；凝膠內(nèi)部具有成的；凝膠內(nèi)部具有微細(xì)的、微細(xì)的、多孔網(wǎng)狀多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。 * *常用的交聯(lián)劑：常用的交聯(lián)劑：環(huán)氧氯丙烷環(huán)氧氯丙烷 * *常用的凝膠材料：常用的凝膠材料：葡聚糖凝膠（葡聚糖凝膠（SephadexGSephadexG） 交聯(lián)丙烯基葡聚糖（交聯(lián)丙烯基葡聚糖（SephacrylSephacryl） 聚丙烯酰胺凝膠（聚丙烯酰胺凝膠（Bio-gel PBio-gel P） 瓊脂糖凝膠（瓊脂糖凝膠（Seph

35、arose) Sepharose) * *新型凝膠材料新型凝膠材料：superosesuperose，superdexsuperdex * *分離性能分離性能：凝膠孔徑大小：凝膠孔徑大小決定決定其能夠分離的顆粒的其能夠分離的顆粒的大大小??；凝膠顆粒越細(xì)，流速越慢，；凝膠顆粒越細(xì)，流速越慢，分離效果越好分離效果越好。 l相對(duì)分子量相對(duì)分子量不是唯一的分離依據(jù)；不是唯一的分離依據(jù)； 對(duì)于分子量相同的分子，也可依據(jù)其對(duì)于分子量相同的分子，也可依據(jù)其分子形狀分子形狀的不同，的不同，再加上各種物質(zhì)與凝膠之間的再加上各種物質(zhì)與凝膠之間的非特異性吸附作用的差異，非特異性吸附作用的差異，也可以分離。也可以分離

36、。分子篩層析的優(yōu)缺點(diǎn)分子篩層析的優(yōu)缺點(diǎn)（3）親和色譜）親和色譜(層析）層析） （1）定義：利用生物分子與配基之間所具有的）定義：利用生物分子與配基之間所具有的專(zhuān)一專(zhuān)一而又可逆而又可逆的親和力，分離純化生物分子的技術(shù)，是的親和力，分離純化生物分子的技術(shù)，是酶分離純化的重要技術(shù)酶分離純化的重要技術(shù) 專(zhuān)一而可逆的結(jié)合包括：專(zhuān)一而可逆的結(jié)合包括： 酶蛋白與底物、競(jìng)爭(zhēng)性抑制物和輔助因子酶蛋白與底物、競(jìng)爭(zhēng)性抑制物和輔助因子 酶蛋白（抗原）與抗體酶蛋白（抗原）與抗體 酶酶RNA與互補(bǔ)的與互補(bǔ)的RNA （2）原理：）原理： 酶的底物或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑等通過(guò)酶的底物或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑等通過(guò)共價(jià)鍵共價(jià)鍵與惰性與惰性載體（

37、如瓊脂糖）相連接，形成載體（如瓊脂糖）相連接，形成親和載體親和載體； 當(dāng)含酶混合物通過(guò)親和載體時(shí)，靶酶便與底物或當(dāng)含酶混合物通過(guò)親和載體時(shí)，靶酶便與底物或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑發(fā)生特異性結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑發(fā)生特異性結(jié)合，保留保留在柱子上，其在柱子上，其它酶和雜蛋白則因它酶和雜蛋白則因“無(wú)處可依無(wú)處可依”而被洗出柱子而被洗出柱子 最后通過(guò)解吸附，將酶洗脫：最后通過(guò)解吸附，將酶洗脫： *通過(guò)加入底物與通過(guò)加入底物與親和載體親和載體競(jìng)爭(zhēng)競(jìng)爭(zhēng)酶分子酶分子 *也可也可改變改變pH或離子強(qiáng)度或離子強(qiáng)度使結(jié)合的酶使結(jié)合的酶解吸解吸（3）特點(diǎn)）特點(diǎn)因其結(jié)合的專(zhuān)一因其結(jié)合的專(zhuān)一性，所以產(chǎn)品的性，所以產(chǎn)品的純度高純度高步驟

38、少步驟少親和載體的制備親和載體的制備較難較難造價(jià)高、規(guī)模小造價(jià)高、規(guī)模小四、酶的結(jié)晶四、酶的結(jié)晶4-1 4-1 定義：定義： 溶質(zhì)以晶體形式從溶液中溶質(zhì)以晶體形式從溶液中析出析出的過(guò)程，是酶的過(guò)程，是酶分離純化的手段之一分離純化的手段之一 時(shí)間可以從幾小時(shí)，幾天，幾個(gè)月，甚至幾時(shí)間可以從幾小時(shí)，幾天，幾個(gè)月，甚至幾年。年。 為獲得較高純度的酶創(chuàng)造了條件。為獲得較高純度的酶創(chuàng)造了條件。 為酶結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了適宜的樣品；為酶結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了適宜的樣品； Art or science？1 1、鹽析結(jié)晶法：、鹽析結(jié)晶法： 在適當(dāng)?shù)臏囟群驮谶m當(dāng)?shù)臏囟群蚿HpH條件下，于接近飽和的酶條件下，于

39、接近飽和的酶液中液中緩慢增加緩慢增加某種中性鹽的濃度，使酶的溶解度某種中性鹽的濃度，使酶的溶解度慢慢降低，達(dá)到慢慢降低，達(dá)到稍微過(guò)飽和狀態(tài)稍微過(guò)飽和狀態(tài)，而析出酶晶體，而析出酶晶體的過(guò)程的過(guò)程; ; 多用硫酸銨，也用硫酸鈉等多用硫酸銨，也用硫酸鈉等4-2 4-2 結(jié)晶方法結(jié)晶方法 通過(guò)汽相擴(kuò)散的方式增加鹽濃度，使蛋白析出結(jié)晶。使用的試劑盒為商品化的Hampton Research Crystal Screen I&II和PEG Screen篩選試劑盒進(jìn)行，分別采用懸滴法和坐滴法。SP0987SP0987、SPD0280SPD0280蛋白質(zhì)的結(jié)晶蛋白質(zhì)的結(jié)晶SP0987在0.2M檸檬酸鋰

40、、20%PEG3350條件晶體質(zhì)量較好SPD0280在0.2M硫酸鎂、20%PEG3350條件下晶體質(zhì)量較好 圖圖3 SPD0280蛋白質(zhì)母體晶體蛋白質(zhì)母體晶體 圖圖4 SPD0280蛋白質(zhì)硒代晶體蛋白質(zhì)硒代晶體 圖圖1 SP0987蛋白質(zhì)母體晶體蛋白質(zhì)母體晶體 圖圖2 SP0987蛋白質(zhì)硒代晶體蛋白質(zhì)硒代晶體 2 2、有機(jī)溶劑結(jié)晶法：是在接近飽和的酶液中慢慢、有機(jī)溶劑結(jié)晶法：是在接近飽和的酶液中慢慢加入某種有機(jī)溶劑，使酶的加入某種有機(jī)溶劑，使酶的溶解度降低溶解度降低而而析出析出酶酶晶體的過(guò)程；常用的有機(jī)溶劑有乙醇、丙醇、甲晶體的過(guò)程；常用的有機(jī)溶劑有乙醇、丙醇、甲醇等醇等3 3、透析平衡結(jié)晶

41、法：將酶液裝進(jìn)透析袋，對(duì)一定、透析平衡結(jié)晶法：將酶液裝進(jìn)透析袋，對(duì)一定濃度的鹽溶液進(jìn)行透析，使?jié)舛鹊柠}溶液進(jìn)行透析，使酶液逐漸達(dá)到飽和態(tài)酶液逐漸達(dá)到飽和態(tài)而而析出結(jié)晶析出結(jié)晶的過(guò)程的過(guò)程4 4、等電點(diǎn)結(jié)晶法：是通過(guò)緩慢改變酶液的、等電點(diǎn)結(jié)晶法：是通過(guò)緩慢改變酶液的pHpH，使，使之逐漸之逐漸達(dá)到其等電點(diǎn)達(dá)到其等電點(diǎn)，而使，而使酶析出結(jié)晶酶析出結(jié)晶的過(guò)程的過(guò)程 五、酶的濃縮與干燥五、酶的濃縮與干燥 濃縮（濃縮（concentration)concentration)與干與干燥（燥（Drying)Drying)都是都是酶酶與與溶劑溶劑（通（通常是水）常是水）分離的技術(shù)過(guò)程，是酶分離的技術(shù)過(guò)程，是酶

42、分離純化的一個(gè)重要環(huán)節(jié)分離純化的一個(gè)重要環(huán)節(jié)1 1、濃縮、濃縮：是從低濃度溶液中：是從低濃度溶液中除去除去水分水分或或其它溶劑其它溶劑而成為而成為高濃度溶高濃度溶液液的過(guò)程的過(guò)程 蒸發(fā)濃縮，即通過(guò)蒸發(fā)濃縮，即通過(guò)加熱加熱或或減減壓壓方法使溶液中的部分溶劑方法使溶液中的部分溶劑汽化汽化蒸發(fā)，得以濃縮：蒸發(fā)，得以濃縮： 真空蒸發(fā)器、薄膜蒸發(fā)器真空蒸發(fā)器、薄膜蒸發(fā)器真空蒸發(fā)器真空蒸發(fā)器薄膜蒸發(fā)器薄膜蒸發(fā)器2 2、干燥：、干燥：將固體、半固體或濃縮液中的水分或其它將固體、半固體或濃縮液中的水分或其它溶劑除去一部分，獲得含水較少的溶劑除去一部分，獲得含水較少的固體物質(zhì)固體物質(zhì)的過(guò)程的過(guò)程 干燥時(shí)，首先是

43、從其表面蒸發(fā)，隨后才是其內(nèi)部干燥時(shí)，首先是從其表面蒸發(fā)，隨后才是其內(nèi)部的水分子擴(kuò)散到表面繼續(xù)蒸發(fā)。的水分子擴(kuò)散到表面繼續(xù)蒸發(fā)。 干燥后的物質(zhì)穩(wěn)定性好，利于干燥后的物質(zhì)穩(wěn)定性好，利于保存、運(yùn)輸和使用保存、運(yùn)輸和使用 常用的方法：常用的方法：真空干燥真空干燥 冷凍干燥冷凍干燥 噴霧干燥噴霧干燥 氣流干燥氣流干燥 吸附干燥等吸附干燥等 獲得的酶質(zhì)量最高的是獲得的酶質(zhì)量最高的是冷凍干燥冷凍干燥3 3、酶的保存、酶的保存 在合適的條件下，酶一般可保存較長(zhǎng)的時(shí)間。在合適的條件下，酶一般可保存較長(zhǎng)的時(shí)間。 在在44下，可將酶懸浮在濃硫酸銨或下，可將酶懸浮在濃硫酸銨或PEGPEG溶液中溶液中保存，保存，10

44、mg/ml10 mg/ml的濃酶液可加入的濃酶液可加入25%25%50%50%甘油保存甘油保存 可將酶液可將酶液過(guò)濾除菌過(guò)濾除菌，以減少微生物降解作用，以減少微生物降解作用 需需還原性巰基還原性巰基維持催化活性的酶，可與維持催化活性的酶，可與1mmol.L1mmol.L- -1 1EDTAEDTA和還原性巰基試劑一起在液氮中保存和還原性巰基試劑一起在液氮中保存 許多酶在許多酶在冰凍狀態(tài)冰凍狀態(tài)下保存得很好下保存得很好1 1、防止酶變性失活：、防止酶變性失活：（1 1）低溫）低溫 （2 2）一般在中性）一般在中性pHpH環(huán)境操作（環(huán)境操作（pH4pH1010不穩(wěn)定）不穩(wěn)定）（3 3）防重金屬）防

45、重金屬, ,有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑, ,微生物及蛋白酶污染微生物及蛋白酶污染2 2、追蹤酶分離每一步的、追蹤酶分離每一步的總活力總活力和和比活力比活力，評(píng)判每，評(píng)判每個(gè)步驟的可行性。個(gè)步驟的可行性。6-1 6-1 酶分離純化的基本原則酶分離純化的基本原則六、酶純化步驟的設(shè)計(jì)及評(píng)價(jià)六、酶純化步驟的設(shè)計(jì)及評(píng)價(jià)6-2 6-2 選擇純化方法時(shí)注意事項(xiàng)選擇純化方法時(shí)注意事項(xiàng)1 1、樣品體積、酶和雜質(zhì)的量、樣品體積、酶和雜質(zhì)的量、pHpH及離子強(qiáng)度及離子強(qiáng)度2 2、酶的物理化學(xué)性質(zhì)：、酶的物理化學(xué)性質(zhì)： 大小、等電點(diǎn)、溶解度、親水性大小、等電點(diǎn)、溶解度、親水性3 3、需要純化的酶的生物學(xué)性質(zhì)：、需要純化的酶的生

46、物學(xué)性質(zhì)： 穩(wěn)定性、輔助因子穩(wěn)定性、輔助因子6-3 6-3 分離方法的順序選擇分離方法的順序選擇v樣品量由大到小樣品量由大到小v分辨率由低到高分辨率由低到高v酶的回收率由低到高酶的回收率由低到高預(yù)處理預(yù)處理-粗分粗分-細(xì)分細(xì)分-酶的制品酶的制品粗分：初步純化粗分：初步純化細(xì)分細(xì)分1細(xì)分細(xì)分2檢查純化的進(jìn)展情況檢查純化的進(jìn)展情況有機(jī)溶劑、硫酸銨沉淀、有機(jī)溶劑、硫酸銨沉淀、磷酸鈣分級(jí)吸附、超濾磷酸鈣分級(jí)吸附、超濾等等離子交換層析、凝膠過(guò)離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、親和層析、聚濾層析、親和層析、聚焦層析等焦層析等SDS-PAGE電泳、等電聚焦電泳、等電聚焦6-4 6-4 純化步驟的定量評(píng)價(jià)純化步驟的

47、定量評(píng)價(jià)測(cè)定試樣中酶的活力測(cè)定試樣中酶的活力和蛋白質(zhì)濃度和蛋白質(zhì)濃度計(jì)算比活力計(jì)算比活力制作純化表制作純化表酶單位酶單位/mg/mg蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)酶活性及比活性測(cè)定酶活性及比活性測(cè)定酶的活性酶的活性酶的活性單位酶的活性單位是衡量酶活力大小的尺度，它反映是衡量酶活力大小的尺度，它反映在規(guī)定條件下，酶促反應(yīng)在單位時(shí)間（在規(guī)定條件下，酶促反應(yīng)在單位時(shí)間（s s、minmin或或h h）內(nèi)生成一定量（）內(nèi)生成一定量（mgmg、gg、molmol等）的產(chǎn)物等）的產(chǎn)物或消耗一定數(shù)量的底物所需的酶量?；蛳囊欢〝?shù)量的底物所需的酶量。酶活性測(cè)定的酶活性測(cè)定的國(guó)際單位國(guó)際單位(IU)(IU)在特定的條件下，每分鐘催化在特定的條件下，每分鐘催化1 1molmol底物底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量為一個(gè)國(guó)際單位。轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量為