啤酒酵母選育

1、啤酒酵母選育紫外誘變及其突變株的性能測試1材料與方法1.1 材料菌種：四鈴啤酒酵母儀器：分光光度計、恒溫振蕩器、水浴鍋、離心機、顯微鏡、蒸儲裝置、分析天平。培養(yǎng)基：麥芽汁培養(yǎng)基，麥芽汁固體培養(yǎng)基。（麥芽汁由四鈴啤酒廠提供）1.2 試驗方法1.2.1 酵母菌的活化取菌種接種至裝有麥芽汁液體培養(yǎng)基的錐形瓶130r/min振蕩培養(yǎng)，于28c恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)14h,得到正常生長時期的釀酒酵母菌懸液。然后接種于斜面麥芽汁固體培養(yǎng)基上，采納28c恒溫培養(yǎng)14h,得到1.2.2陶血母菌對數(shù)生長期的測定10.7 122d,淵 喝OmL完全活化的茯常生長的酵母菌懸液的制備/茴液離心收集菌”;洗滌2次后，菌體懸浮于

2、1OmL生理鹽搖勻，130/哼種沔養(yǎng)七產(chǎn)2卜巴/3工，普入冰箱，全部培養(yǎng)終止用722型分比優(yōu)度詁小波帶io600nm仙激黃|卷室眼吸光度值，以空白的麥芽汁培養(yǎng)液為對比，按照所得數(shù)搪做出釀酒酵母菌的生長曲線。取活脩如利懸液各1mL接種于36支含9mL的麥芽汁液體培養(yǎng)基中,圖1釀酒酵母菌的生長曲踐（此圖視為參考）1.2.3 紫外線誘變試驗用麥芽汁液體培養(yǎng)基將處于對數(shù)生長期的菌懸液稀釋，使菌種的濃度達到1x106個/mL。（此處菌懸液濃度的確定采納三種方法：1.顯微鏡直截了當(dāng)計數(shù)法；2.平板菌落計數(shù)法；3.光電比濁計數(shù)法）備注：平板直截了當(dāng)計數(shù)法：如果過少菌液不易涂布開，過多則在涂布完后或在培養(yǎng)時菌

3、液仍會在平板表面流淌，不易形成單菌落，且培養(yǎng)周期長，耗時多，工作量大，然而也是我們的強項，能夠錘煉大一的動手能力。2：顯微鏡直截了當(dāng)計數(shù)法：比較直觀，我們能夠直截了當(dāng)顯微觀看，多人工作計數(shù)。耗時較短，且工作量較小，同時我系其他實驗組采納此方法計數(shù)，可供參考。3：光電比濁法：盡管繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線要求較高，然而工作量較小，且一次繪制好標(biāo)準(zhǔn)曲線好后，以后能夠用，準(zhǔn)確率較高。比較三種方法，我傾向于第一種和第三種，二者相比較，能夠校正方案。實驗步驟：打開30W紫外燈預(yù)熱30min，使其功率達到穩(wěn)固。1取斜面菌苔一環(huán)于2OmL麥汁中混勻，28活化培養(yǎng)14h。2取4mL培養(yǎng)液以3000r/min的速度離心15m

4、in,棄上清液加入4mL生理鹽水洗滌，在電磁振蕩儀上震蕩10min左右，重復(fù)2次，制成5mL懸液，用血球計數(shù)板在顯微鏡下直截了當(dāng)計數(shù)，調(diào)整細胞濃度。3 取誘變前的1mL菌懸液進行適當(dāng)稀釋，分離出3個合適的稀釋度傾注瓊脂平板，約為10-3、10-4、10-5，每一個梯度3個平板，每一個平板加0.2mL菌液，進行培養(yǎng)后平板計數(shù)法，作為對比。4 取菌懸液5mL移入無菌培養(yǎng)皿中，加入一無菌磁力轉(zhuǎn)子，置于磁力攪拌器上。5 30W紫外燈下30cm處照耀，調(diào)整照耀時刻。此次預(yù)設(shè)為0，30，45，60，90，120，180，600.（單位s）6 取一定稀釋梯度的紫外照耀菌液0.1（視具體情形而定）用無菌涂布棒

5、涂布平均，每組做三個平行線培養(yǎng)記錄菌落數(shù)，運算各照耀時刻下的致死率。（選在75%-80%）。致死率=未經(jīng)照耀菌落數(shù)-紫外照耀菌落數(shù)未經(jīng)紫外照耀菌落數(shù)7 挑取平板上生長迅速菌落比較大的菌株進行斜面培養(yǎng)，然后重復(fù)1-5，再重復(fù)第5步，挑取平板上生長迅速、菌落比較大的菌株進行斜面培養(yǎng)，連續(xù)進行5次，28 培養(yǎng)20h左右，運算其突變率和致死率。（上述時刻等數(shù)字視為參考數(shù)值）1.2.3.1 初篩誘變后選擇在麥芽汁固體培養(yǎng)基上生長良好，菌落呈中等大小、乳白色、表面光滑和邊緣整齊的菌落移接斜面供復(fù)篩。1.2.3.2 復(fù)篩供復(fù)篩的菌株進行500ml三角瓶低溫發(fā)酵，測定發(fā)酵液中的雙乙酰含量并以此作為復(fù)篩的標(biāo)準(zhǔn)。

6、同時測定發(fā)酵液中雙乙酰含量最低的幾株酵母的其它性能。雙乙酰含量測定：初篩獲得的菌株經(jīng)500ml三角瓶內(nèi)裝300ml120Bx麥芽汁發(fā)酵8d后，測定發(fā)酵液中的雙乙酰含量，選擇發(fā)酵液中雙乙酰含量低的菌株進行二次發(fā)酵，將雙乙酰含量明顯降低的4株菌分不編號為FB-E1、FB-E2、FB-E3和FB-E4。結(jié)果見表1表1發(fā)酵液中雙乙酰含量的比較菌株FBFB-E1FB-E2FB-E3FB-E4雙乙酰含量（mg/L）0.12330.07060.09260.07760.0870降低率（%）042.724.937.129.4（此處繪制表格樣式視為參考）降低前驅(qū)物質(zhì)”乙酰乳酸的生產(chǎn)量措施：改良酵母菌種提升麥汁中%

7、-氨基氮含量，能夠抑制合成酶的活性2加速雙乙酰的還原措施：提升酵母的細胞密度（增大酵母菌的接種量）提升還原溫度（封罐后高溫還原）限制后期酵母的出芽率（封罐）國標(biāo)中關(guān)于啤酒中雙乙酰的量的要求二級啤酒：0.2mg/L一級啤酒：0.13mg/L方法：國標(biāo)GB4927-2001檢測培養(yǎng)條件：恒溫12度發(fā)酵栓培養(yǎng)8d后檢測發(fā)酵液中雙乙酰的含量。原理：雙乙酰的測定方法采納比色法。鄰苯二胺比色法是連二酮類都能發(fā)生顯色反應(yīng)的方法，因此，此法測得之值為雙乙酰與戊二酮的總量，結(jié)果偏高。但此法快速簡便。用蒸汽將雙乙酰從樣品中蒸餾出來，加鄰苯二胺，形成2，3二甲基喹喔琳，其鹽酸鹽在335nm波長下有一最大吸取峰，可進

8、行定量測定。1 儀器：帶有加熱套管的雙乙酰蒸餾器，蒸汽發(fā)生瓶(2000mL或3000mL)或者錐形瓶，平底燒瓶，容量瓶25mL2 試劑和溶液鹽酸溶液(4moL/L)，鄰苯二銨溶液：10g/L(稱取鄰苯二銨0.1g用鹽酸溶液溶解并定容至10mL搖勻，放于陰暗處，注意此溶液即用即配)消泡劑3 實驗步驟(1)把雙乙酰蒸餾器安裝好，把夾套蒸餾器下端的排氣夾子打開。(2)將內(nèi)裝2.5mL蒸餾水的容量瓶(或量筒)放于冷凝器下，使出口尖端浸沒在水面下，外加冰水冷卻。(3)加熱蒸汽發(fā)生器至沸，通汽加熱夾套，備用。(4)于100mL量筒中加入24滴消泡劑，再注入5左右未除氣啤酒100mL。(5)待夾套蒸餾器下端

9、冒大汽時，打開進樣口瓶塞，將啤酒迅速注入蒸餾器內(nèi)，再用約10mL蒸餾水沖洗量筒，同時倒入，迅速蓋好進樣口塞子，用水封口。(6)待夾套蒸餾器下端再次冒大汽時，將排氣夾子夾住，開始蒸餾，到餾出液接近25mL時取下容量瓶，用水定容至25mL，搖勻(蒸餾應(yīng)在3分鐘內(nèi)完成)。（7）分不吸取餾出液10mL于兩支比色管中。一管作為樣品管加入0.5mL鄰苯二胺溶液，另一管不加作空白，充分搖勻后，同時置于暗處放置2030分鐘，然后于樣品管中加2mL4N鹽酸溶液，于空白管中加2.5mL4N鹽酸溶掖，混勻。在335nm波長處，用1cm比色皿以空白作對比測定樣品吸光度。（9）運算：雙乙酰（mg/L）=A335X2.4

10、（用20mm石英比色皿時，吸光度與雙乙酰的換算系數(shù)）注：若用20mm的石英比色皿則換算系數(shù)則為1.21.2.4 不同菌株的發(fā)酵性能測試（CO2失重法）將發(fā)酵搖瓶置于26度恒溫環(huán)境中，每天稱重1次（直至日失重小于0.5g為止），因每瓶用于發(fā)酵的麥芽汁體積相同，因此只需運算發(fā)酵后單位時刻內(nèi)CO2的開釋量，發(fā)酵6d,以CO2產(chǎn)生量為縱坐標(biāo)，發(fā)酵時刻為橫坐標(biāo)，繪制C02產(chǎn)生量曲線。1.2.6 不同菌株發(fā)酵發(fā)酵液中殘留總糖含量測定從8個發(fā)酵后的發(fā)酵瓶中各取0.2mL發(fā)酵液并稀釋500倍，用硫酸-苯酚法測定發(fā)酵液中殘留總糖的含量。附錄：硫酸-苯酚法1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制準(zhǔn)確稱取干燥恒重的葡萄糖20mg,蒸

11、儲水準(zhǔn)確定容500mL得到0.04mg/L的葡萄糖液。2）試劑1）濃硫酸：分析純，95.5%2） 80%苯酚：80克苯酚（分析純重蒸餾試劑）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光長期儲存。3） 6%苯酚：臨用前以80%苯酚配制。（每次測定均需現(xiàn)配）4） 15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中長期儲存。5） 5%三氯乙酸（5%TCA）:25克TCA力口475克水使之溶解，可置冰箱中長期儲存。6） 6mol/L氫氧化鈉：120克分析純氫氧化鈉溶于500ml水。7） 6mol/L鹽酸表1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作步驟管號012345678葡萄糖0.00.40.60.81.01.2

12、1.41.61.8蒸餾水2.01.61.41.21.00.80.60.40.2苯酚液1.01.01.01.01.01.01.01.01.0濃硫酸5.05.05.05.05.05.05.05.05.0取8支潔凈的具塞試管按表2方法操作，搖勻后放置5min,置沸水浴中加熱15min,取出迅速冷卻至室溫，以0號作為空白調(diào)零，在最大吸取波長處測定吸光度。以葡萄糖濃度X為橫坐標(biāo)（ug/mL），吸光度Y為縱坐標(biāo)，從而來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1 .制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分不吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8,各以蒸儲水補

13、至2.0ml,然后加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml,搖勻冷卻，室溫放置20分鐘以后于490nm測光密度，以2.0ml水按同樣顯色操作為空白，橫坐標(biāo)為多糖微克數(shù)，縱坐標(biāo)為光密度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。2 .樣品含量測定：取樣品1克（濕樣）加1mL15%TCA（三氯醋酸）溶液研磨，再加少許5TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升離心管中，再加少許5TCA溶液研磨，倒上清液，重復(fù)3次。最后一次將殘渣一起到入離心管。注意：總的溶液不要超出10毫升。（既不要超出離心管的容量）。離心，轉(zhuǎn)速3000轉(zhuǎn)/分鐘，共三次。第一次15分鐘，取上清液。后兩次各5分鐘取上清液到25毫升錐形比色管中。最后濾液保持18毫升左右

14、。水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L鹽酸之后搖勻，在96c水浴鍋中水浴2小時。定容取樣。水浴后，用流水冷卻后加入2毫升6mol/L氫氧化鈉搖勻。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2ml的樣品液，以蒸餾補至2.0ml,然后加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml,搖勻冷卻室溫放置20分鐘以后于490nm測光密度。每次測定取雙樣對比。以標(biāo)準(zhǔn)曲線運算多糖含量。1.2.7不同菌株產(chǎn)酒精能力（酒精度）測試快速氧化法乙醇在酸性條件下,通過量的、一定濃度的重鉻酸鉀作用，氧化生成醋酸。再將剩余的的重鉻酸鉀經(jīng)硫代硫酸鈉還原。由反應(yīng)過程中，通過消耗的硫代硫酸鈉的量運算酒精含量。試劑：重鉻酸鉀溶液、硝酸溶液、

15、堿性碘化鉀溶液、淀粉溶液、硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液方法：在蒸餾器的接收瓶中，加入10.00ml重鉻酸鉀溶液和25ml硝酸溶液。并將空氣冷凝器的出口插入此溶液中。在蒸餾瓶中加入12ml水和1.00ml試樣。接好裝置，迅速加熱至沸，并連續(xù)煮沸3分鐘，蒸餾即告完成。在同意瓶中，加入300ml水、10ml堿性碘化鉀溶液及10ml淀粉溶液，在電磁攪拌器攪拌下，用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡青色的淀粉終點。通過如下公式運算酒精含量。酒精（%，V/V）=（20.00-0.6575V）/Vs式中V硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定量Vs試樣取樣量方法二：2.2蒸餾密度瓶法1.1.1 儀器全玻璃蒸餾器（500mL）、恒溫水浴（精度

16、±0.1）、容量瓶（100mL）、移液管（100ml）分析天平（感量0.1mg）、天平（感量0.1g）、25ml附溫度計密度瓶1.1.2 操作方法用100mL容量瓶準(zhǔn)確量取試樣100ml，置于蒸餾瓶中，用50ml水分三次沖洗容量瓶，洗液并入蒸餾瓶中，加玻璃珠數(shù)粒，裝上蛇型冷凝管，用原100ml容量瓶接收餾出液（外加冰?。?慢慢加熱蒸餾，收集約96ml餾出液（蒸餾應(yīng)在30-60分鐘內(nèi)完成），取下容量瓶，調(diào)溫到20，補水定容，混勻。用25mL附溫度計密度瓶測試樣餾出液20的相對密度，按照相對密度查表，得到試樣餾出液的酒精度（%，V/V），即為試樣的酒精度。2.3 蒸餾裝置2.3.2試劑重

17、鉻酸鉀溶液、優(yōu)級純無水乙醇2.4 操作方法2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備吸取1ml無水乙醇于100ml容量瓶中，稀釋至刻度，混勻。分不吸取此稀釋液0、1、2、3、4、5、6、7ml于50ml容量瓶中，各加15.0ml重鉻酸鉀溶液，加水至刻度，混勻。此標(biāo)準(zhǔn)系列相當(dāng)于試樣中含有0.0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00（V/V）的酒精。以空白標(biāo)準(zhǔn)作參比，在波長610nm,用1cm比色皿測定其余各標(biāo)準(zhǔn)的吸光度。用吸光度對酒精濃度作圖，繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.4.2試樣的測定在500ml蒸儲燒瓶中，加入100.0ml試樣。按1.2方法進行蒸儲，最后加適量水將蒸儲液補足為100.0

18、ml。吸取1.0ml蒸儲液于50ml容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備的操作測定其吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出酒精含量（%、V/V）。1.2.8氨基氮含量的測定水合茚三酮是一種氧化劑，可使氨基酸脫羧氧化，而本身被還原成還原型水合茚三酮。還原型水合茚三酮再與末還原的水合茚三酮及氨反應(yīng)，生成藍紫色縮合物，顏色深淺與游離口-氨基氮含量成正比，可在570nm下比色測定。（1）樣品稀釋適當(dāng)稀釋卞品至含13wg%-氨基氮/mL（麥汁一樣稀釋100倍，啤酒50倍，啤酒應(yīng)先除氣）。（2）測定取9支10mL比色管，其中3支吸入2mL甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，另3支各吸入2mL試樣稀釋液，剩下3支吸入2mL蒸餾水。然后各加顯色劑1mL,

19、蓋玻塞，搖勻，在沸水浴中加熱l6分鐘。取出，在20c冷水中冷卻20分鐘，分不加5mL碘酸鉀稀釋液，搖勻。在30分鐘內(nèi)，以水樣管為空白，在570nm波長下測各管的光密度。運算：認-氨基氮含量（抹g/mL）=（樣品管平均O.D./標(biāo)準(zhǔn)管平均O.D.）X2X稀釋倍數(shù)講明：式中（樣品管平均O.D./標(biāo)準(zhǔn)管平均O.D.）:表示樣品管與標(biāo)準(zhǔn)管之間的0c-氨基氮之比；2:標(biāo)準(zhǔn)管的-氨基氮濃度（區(qū)g/mL）,即（0.1072X14/75）X100;方法二：%-氨基氮的測定（苗三酮法）1、實驗試劑a顯色劑100克磷酸氫二鈉（Na2HPO4.12H2O）60克磷酸二氫鉀（KH2PO4）5.00克水合茚三酮3.00

20、克果糖用水溶液溶解后稀釋至1升（此溶液在低溫下用棕色瓶可儲存2周，pH應(yīng)為6.6-6.8。操作時能夠按比例配成100ml）。b稀釋溶液：2克碘酸鉀溶于600ml水中，再加入96%乙醇400ml.c標(biāo)準(zhǔn)溶液：溶107.2mg甘氨酸于100ml水中，0c貯藏。用時按要求稀釋。該溶液含有200mg%-氨基氮/升。2、實驗操作取糖化的麥芽汁1.00ml（或者是其他的合適量，使稀釋后的濃度為1-3mg%-氨基氮/升），放入100ml的容量瓶中，稀釋到刻度，搖勻。標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸溶液稀釋液：取1.00ml標(biāo)準(zhǔn)溶液，在100ml的容量瓶中稀釋到刻度。取麥芽汁稀釋溶液、水、標(biāo)準(zhǔn)的甘氨酸溶液（三個）稀釋液各2.00m

21、l,放入比色管中，（水用于空白對比），各比色管中分不加入1.00ml的顯色劑，搖勻，在沸水中加熱16min。（現(xiàn)在應(yīng)該預(yù)備20c的水浴）20c水浴中冷卻20min。加入5.00ml的碘酸鉀稀釋溶液，搖勻，在30min內(nèi)于570nm處測定吸光度值。3、運算游離的“氨基氮（毫克/升麥芽汁）=2X100X樣品溶液吸光度值/標(biāo)準(zhǔn)溶液平均吸光度1.2.9 絮凝性的測定良好的絮凝性不僅能夠減少發(fā)酵液的澄清時刻，降低酵母分離的能源消耗，還可防止酵母細胞長時刻懸浮于發(fā)酵液中致使細胞自溶，有損啤酒風(fēng)味。方法：取發(fā)酵度試驗沉淀的酵母，通過洗滌和離心，稱取1.0g置于帶刻度的錐形離心管內(nèi)，使其懸浮在10mLpH4.

22、5的醋酸緩沖液（O.5lg硫酸鈣，6.8g冰醋酸用水稀釋到1L）中，靜置5min后，將此懸浮液重新連續(xù)搖動，使酵母重新全部懸浮起來，靜置觀看酵母凝聚沉降速度。表2不同菌株絮凝性的比較菌株FBFB-E1FB-E2FB-E3FB-E4本斯值（ml）3.02.83.02.83.2分不稱取不同菌株酵母在離心管中搖勻，靜置沉降時，形成一清晰界面逐步下降。酵母在沉降時形成一清晰界面，講明該酵母是凝集性酵母，從圖2可見發(fā)酵度較高的菌株凝集性能稍差（做本試驗時，室溫若超過20C,這對酵母的凝集性可能稍有阻礙）。1.2.10 還原性糖的測定斐林試劑比色法測定還原糖（臨時不采納）二、材料、儀器設(shè)備及試劑1. 分光

23、光度計；2.分析天平（感量110000）；3.水浴鍋；4.具塞刻度試管；5.刻度吸管；6.容量瓶；7.離心機1 .斐林試劑A液：40gCuSO4.5H2O溶解于蒸儲水定容至1L。2.斐林試齊ijB液：200g酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6.5H2O）與150gNaOH溶于蒸儲水中，并定容至1升。A、B兩液分不貯存，使用前等體積混合。3.0.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：取80c下烘至恒重的葡萄糖0.1000g,加蒸儲水溶解，定容至100ml。4.0.1moL/LNaOH。5.甲基紅指示劑：0.1g甲基紅溶于250mL60%乙醇中。6.10Pb（Ac）2。7.飽和Na2SO4（2019.5g）。三、實驗步驟2 .對含蛋白質(zhì)較多的樣品，此間可加10%Pb（Ac）2,除去蛋白質(zhì)，至不再產(chǎn)生白色絮狀沉淀時，加飽和Na2SO4除去余外的鉛離子。3 .樣品測定：吸取6ml待測液，加4ml斐林試劑，其它操作與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同，在590nm波長下讀取吸光度。以不含樣品的空白管的吸光度減去樣品管的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出糖含量.按下式運算還原糖的百分含量：還原糖（）=查得的糖毫克數(shù)X樣品總體積X稀釋倍數(shù)/（測定時取用體積X樣品重X1000）X100方法2：試劑與材料（臨時采納此方法）1 .斐林試劑甲69.3CuSO4.5