Chapter10Transcriptioninprokaryotes

1、轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 (transcription) 生物體以生物體以DNA為模板合成為模板合成RNA的過程的過程 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄RNADNA 5 5 3 3 3 3 5 5 模板鏈模板鏈編碼鏈編碼鏈編碼鏈編碼鏈模板鏈模板鏈結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄方向轉(zhuǎn)錄方向轉(zhuǎn)錄方向轉(zhuǎn)錄方向不對稱轉(zhuǎn)錄不對稱轉(zhuǎn)錄(asymmetric transcription) 在在DNA分子雙鏈上某一區(qū)段，一股鏈用分子雙鏈上某一區(qū)段，一股鏈用作模板指引轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄作模板指引轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄 ； 模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一條單鏈上。模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一條單鏈上。參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)原料原料: : NTP (ATP, UTP, GTP

2、, CTP) 模板模板: : 解開成單鏈的解開成單鏈的DNA酶酶: : RNA聚合酶聚合酶(RNA polymerase, RNA pol)其他蛋白質(zhì)因子其他蛋白質(zhì)因子單鏈單鏈DNA病毒病毒：正鏈，有意義鏈，編碼鏈；：正鏈，有意義鏈，編碼鏈； 負(fù)鏈，反義鏈，轉(zhuǎn)錄模板。負(fù)鏈，反義鏈，轉(zhuǎn)錄模板。正鏈正鏈RNA病毒病毒：作為：作為mRNA或序列與或序列與mRNA一致一致負(fù)鏈負(fù)鏈RNA病毒病毒：以其：以其RNA的互補鏈為的互補鏈為mRNA編碼鏈編碼鏈sense strand ：鏈、有意義鏈、非模板鏈，堿基序列與鏈、有意義鏈、非模板鏈，堿基序列與 mRNA一致一致（DNA：T，RNA：U），），無轉(zhuǎn)錄功

3、能無轉(zhuǎn)錄功能模板鏈模板鏈antisense strand ：鏈、反義鏈，合成鏈、反義鏈，合成RNA的轉(zhuǎn)錄模板的轉(zhuǎn)錄模板 ：RNA聚合酶識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段聚合酶識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。是序列。是 原核啟動子區(qū)大約原核啟動子區(qū)大約70-80bp長，有特殊的結(jié)構(gòu)。長，有特殊的結(jié)構(gòu)。 轉(zhuǎn)錄因子：轉(zhuǎn)錄因子：RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄需要的輔助因子。聚合酶起始轉(zhuǎn)錄需要的輔助因子。 -35-105-9bpTATAAT16-19bpTTGACA轉(zhuǎn)錄起點轉(zhuǎn)錄起點大腸桿菌啟動子的保守序列大腸桿菌啟動子的保守序列 - 35序列其保守序列為序列其保守序列為TTGACA（T82T84G78A65C54A

4、45），）， 與與-10序列相隔序列相隔1619bp。功能：功能：l 為為RNA 聚合酶的識別位點。聚合酶的識別位點。RNA 聚合酶的核心酶只能起聚合酶的核心酶只能起到和模板結(jié)合和催化的功能，并不能識別到和模板結(jié)合和催化的功能，并不能識別-35序列，只有序列，只有亞基才能識別亞基才能識別-35序列，為轉(zhuǎn)錄選擇模板鏈。序列，為轉(zhuǎn)錄選擇模板鏈。l -35序列和序列和-10序列的距離是相當(dāng)穩(wěn)定的，過大或過小都會序列的距離是相當(dāng)穩(wěn)定的，過大或過小都會降低轉(zhuǎn)錄活性。這可能是因為降低轉(zhuǎn)錄活性。這可能是因為RNA 聚合酶本身的大小和聚合酶本身的大小和空間結(jié)構(gòu)有關(guān)?？臻g結(jié)構(gòu)有關(guān)。原核生物的原核生物的RNA聚合

5、酶聚合酶核心酶(core enzyme) :2as a specificity factor細(xì)菌細(xì)菌RNA聚合酶的組成：聚合酶的組成： E. Coli RNA聚合酶全酶由聚合酶全酶由5個亞基個亞基組成：組成：2 ，分子量為，分子量為480kd。2 構(gòu)成核心酶，與構(gòu)成核心酶，與亞基構(gòu)成全酶。亞基構(gòu)成全酶。 核心酶不能區(qū)分啟動子和一般序列，核心酶不能區(qū)分啟動子和一般序列，與與DNA結(jié)合常數(shù)約為結(jié)合常數(shù)約為109，停留半衰期，停留半衰期約為約為60min，當(dāng)，當(dāng)因子與核心酶構(gòu)成全因子與核心酶構(gòu)成全酶后，與酶后，與DNA一般序列結(jié)合常數(shù)為一般序列結(jié)合常數(shù)為105，半衰期小于半衰期小于1S，而與啟動子區(qū)

6、結(jié)合常，而與啟動子區(qū)結(jié)合常數(shù)為數(shù)為1012，半衰期為數(shù)小時，所以，半衰期為數(shù)小時，所以亞亞基又稱起始亞基?；址Q起始亞基。 核心酶核心酶 (core enzyme)全酶全酶 (holoenzyme)細(xì)菌細(xì)菌RNA聚合酶的功能聚合酶的功能:l識別和結(jié)合DNA鏈上的啟動子；l能沿著DNA雙鏈作單向運動；l解開DNA雙螺旋，轉(zhuǎn)錄后又恢復(fù)雙螺旋；l同時與局部分離的DNA鏈以及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA鏈結(jié)合；l按模板原則選擇正確底物，按5-3方向合成RNA鏈；l識別轉(zhuǎn)錄的終止信號；l能與轉(zhuǎn)錄因子互相作用，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄速度；l能在轉(zhuǎn)錄受到阻遏的情況下進(jìn)行自身調(diào)整，借助輔助因 子，恢復(fù)和維持RNA合成E. Coli的的R

7、NA聚合酶各亞基的性質(zhì)和功能聚合酶各亞基的性質(zhì)和功能2 、因子因子功能：功能： 它識別啟動子并將封閉的啟動子復(fù)合物轉(zhuǎn)換成它識別啟動子并將封閉的啟動子復(fù)合物轉(zhuǎn)換成開放的狀態(tài)。開放的狀態(tài)。一旦轉(zhuǎn)錄起始，一旦轉(zhuǎn)錄起始，因子從全酶中脫離。核心因子從全酶中脫離。核心酶能與酶能與DNA結(jié)合，但效率低，特異性差。結(jié)合，但效率低，特異性差。 增加增加RNA聚合酶對啟動子的特異性結(jié)合，減少聚合酶對啟動子的特異性結(jié)合，減少非特異性結(jié)合。非特異性結(jié)合。不同啟動子需要不同不同啟動子需要不同因子因子 大腸桿菌大腸桿菌RNA聚合酶與聚合酶與DNA的相互作用的相互作用E.coli的不同的不同因子識別不同的共同順序因子識別不

8、同的共同順序1 轉(zhuǎn)錄的起始轉(zhuǎn)錄的起始 轉(zhuǎn)錄起始需解決兩個問題：轉(zhuǎn)錄起始需解決兩個問題： RNA聚合酶必須準(zhǔn)確地結(jié)合在轉(zhuǎn)錄模板的起始區(qū)域。 DNA雙鏈解開，使其中的一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板。 起始的過程可分為四個階段起始的過程可分為四個階段 1）亞基辨認(rèn)起始點，RNA聚合酶全酶(2)與模板結(jié)合， 形成閉合轉(zhuǎn)錄復(fù)合體； 2）DNA雙鏈解開形成開放轉(zhuǎn)錄復(fù)合體； 3）在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng)，形成轉(zhuǎn)錄起始 復(fù)合物RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3。 RNA鏈的延伸階段開始后，因子即從核心酶-DNA-新生RNA復(fù)合體上解離下來，并可再用于和新的核心酶結(jié)合. 因子被釋

9、放的原因：它已不起作用；因子如仍然存在將會造成RNA聚合酶與啟動子序列結(jié)合過緊，以致不能再沿著模板移動。 當(dāng)因子被釋放后，新生鏈-酶復(fù)合體與DNA模板的結(jié)合很弱，并且酶亦不再要求與特異序列的DNA結(jié)合時，鏈的延伸才能達(dá)到最佳狀態(tài)。2 2 轉(zhuǎn)錄的延伸轉(zhuǎn)錄的延伸 延伸的時候，酶后端邊緣的分界線也可作為RNA鏈延伸的末端處。即酶的后端向前每移動1bp，RNA延伸的末端也就加上了一個rNTP，但酶的前端并沒有移動，仍保持原來的位置，只不過酶整體收縮了1bp的長度。酶內(nèi)部所覆蓋的DNA雙鏈的開放區(qū)及RNA的生長點（3端）都向前移動了1個bp。 當(dāng)RNA鏈已延伸到多個nt時，酶的前端突然向前一下子延伸7-

10、8bp。延伸時RNA 聚合酶以穩(wěn)定收縮和突然伸展的方式在DNA上“爬行”，穩(wěn)定的收縮是指RNA聚合酶從35bp長連續(xù)地收縮到28bp，然后前端又突然向前伸展8bp,RNA聚合酶又恢復(fù)到35bp長。 1. 亞基脫落，亞基脫落，RNApol聚合酶核心酶變構(gòu)，聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松弛，沿著與模板結(jié)合松弛，沿著DNA模板前移；模板前移； 2. 在在核心酶核心酶作用下，作用下，NTP不斷聚合，不斷聚合，RNA鏈鏈不斷延長。不斷延長。(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi轉(zhuǎn)錄的延伸階段：轉(zhuǎn)錄的延伸階段：轉(zhuǎn)錄空泡轉(zhuǎn)錄空泡(transcription bubble)：轉(zhuǎn)錄過程中，轉(zhuǎn)

11、錄過程中，RNA聚合酶及其所覆蓋的聚合酶及其所覆蓋的DNA雙鏈以及合成的雙鏈以及合成的RNA共同共同構(gòu)成的復(fù)合物構(gòu)成的復(fù)合物,又稱為又稱為轉(zhuǎn)錄復(fù)合物轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。RNA-pol （核心酶）（核心酶） DNA RNA3 3 原核生物轉(zhuǎn)錄的終止原核生物轉(zhuǎn)錄的終止 原核生物轉(zhuǎn)錄的終止處有特殊結(jié)構(gòu)的存在，稱為終止子，RNA Pol能識別t位點在此處停止，然后釋放RNA，最終RNA聚合酶也脫離模板，終止了轉(zhuǎn)錄。 在原核細(xì)胞中有兩種不同的終止子，一種是強終止子，另一種是弱終止子。強終止子在體外實驗中，無需其他任何因子的幫助就可以終止核心酶，這種終止子被稱為內(nèi)部終止子。弱終止子需要在一種蛋白質(zhì)因子（rho f

12、actor）的幫助一才能終止，所以又稱為依賴性終止子。 強終止子的結(jié)構(gòu)有三個特點強終止子的結(jié)構(gòu)有三個特點 有回文結(jié)構(gòu)存在。由它轉(zhuǎn)有回文結(jié)構(gòu)存在。由它轉(zhuǎn)錄出錄出mRNAmRNA可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，可可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，可阻止阻止RNA RNA 聚合酶的前進(jìn)；聚合酶的前進(jìn)； 莖的區(qū)域富內(nèi)含莖的區(qū)域富內(nèi)含G-CG-C，使，使莖環(huán)不易解開；莖環(huán)不易解開； 強終止子強終止子33端上有端上有6 6個個U U，由于它和模板形成的連續(xù)由于它和模板形成的連續(xù)U-AU-A配對較易打開，從而便于釋放配對較易打開，從而便于釋放出出RNARNA。圖圖 強終止子的結(jié)構(gòu)強終止子的結(jié)構(gòu)為什么這兩個結(jié)構(gòu)能引起終止呢為什么這兩個結(jié)構(gòu)能引

13、起終止呢? 發(fā)夾的莖的前半部過早地和發(fā)夾的莖的前半部過早地和RNA-DNA雜交雜交雙鏈中的后半部分退火，僅剩下多聚雙鏈中的后半部分退火，僅剩下多聚U序列和模序列和模板鏈雜交。因為這樣一個由幾個板鏈雜交。因為這樣一個由幾個U和幾個和幾個dA形成形成的的RNA-DNA雜交雙鏈?zhǔn)呛懿环€(wěn)定的，于是新生雜交雙鏈?zhǔn)呛懿环€(wěn)定的，于是新生RNA鏈將很快自鏈將很快自DNA雙鏈中被排除出來。雙鏈中被排除出來。莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止的機理莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止的機理 使使RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓；聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓； 使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解離，使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解離，RNA產(chǎn)物釋放。產(chǎn)物釋放。5 pppG5 3 3 5 RN

14、A-pol圖圖 弱終止子的結(jié)構(gòu)弱終止子的結(jié)構(gòu)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄聚合酶轉(zhuǎn)錄mRNA因子附著到因子附著到mRNA識別位點識別位點 因 子 在因 子 在 R N A 聚 合 酶 后 面 沿聚 合 酶 后 面 沿mRNA移動移動RNA聚合酶在終止位點停留，聚合酶在終止位點停留，因子趕上了聚合酶因子趕上了聚合酶在轉(zhuǎn)錄泡中在轉(zhuǎn)錄泡中因子解開因子解開DNA-RNA雜合鏈雜合鏈終止終止RNA聚合酶，聚合酶，因子和因子和RNA被釋被釋放放 圖圖1 在原核在原核mRNA轉(zhuǎn)錄中轉(zhuǎn)錄中依賴性終止機制。依賴性終止機制。圖圖 轉(zhuǎn)錄的過程轉(zhuǎn)錄的過程電鏡下的轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象電鏡下的轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象5 3 DNA原核生物轉(zhuǎn)錄過程中的羽毛狀現(xiàn)象原

15、核生物轉(zhuǎn)錄過程中的羽毛狀現(xiàn)象核糖體核糖體RNARNA聚合酶聚合酶 F雅各布（Francois Jacob 19202013）法國生物化學(xué)家、分子生物學(xué)家 JL莫諾（Jacques L. Monod 19101976）法國生物學(xué)家 大腸桿菌可以利用葡萄糖、乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖等作為碳源而生長繁殖，當(dāng)培養(yǎng)基中含有葡萄糖和乳糖時，細(xì)菌優(yōu)先使用葡萄糖，當(dāng)葡萄糖耗盡，細(xì)菌停止生長，經(jīng)過短時間所以適應(yīng)，就能利用乳糖，細(xì)菌繼續(xù)呈指數(shù)式繁殖增長。 操縱子：操縱子：在代謝途徑中功能密切相關(guān)的一組蛋白質(zhì)編碼的在代謝途徑中功能密切相關(guān)的一組蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因區(qū)域加上其調(diào)控區(qū)域組成的控制單元。結(jié)構(gòu)基因區(qū)域加上其調(diào)

16、控區(qū)域組成的控制單元。結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因操縱基因操縱基因控制區(qū)信息區(qū)乳糖操縱元典型的操縱子可分為控制區(qū)和信息區(qū)兩部分?？刂茀^(qū)由各種調(diào)控基因所組成，而信息區(qū)則由若干結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起構(gòu)成。結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因（structural gene, SG）：編碼蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)多肽鏈和功能RNA的基因。在細(xì)菌基因組中，編碼功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因通常成簇排列在一起，共轉(zhuǎn)錄到一條mRNA分子上，由同一個控制元件和啟動子驅(qū)動。調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因（regulatory gene）：編碼能與操縱序列結(jié)合的調(diào)控蛋白的基因。調(diào)節(jié)蛋白與DNA上特定位點結(jié)合控制轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白阻遏蛋白(repressor)(repress

17、or)的結(jié)合位點的結(jié)合位點當(dāng)操縱序列結(jié)合有當(dāng)操縱序列結(jié)合有阻遏蛋白阻遏蛋白時，會阻礙時，會阻礙RNARNA聚合酶與啟動序列的結(jié)合，或是聚合酶與啟動序列的結(jié)合，或是RNARNA聚合酶聚合酶不能沿不能沿DNADNA向前移動向前移動 ，阻礙轉(zhuǎn)錄。，阻礙轉(zhuǎn)錄。啟動序列啟動序列編碼序列編碼序列操縱序列操縱序列polpol阻遏蛋白阻遏蛋白 操縱序列操縱序列 其他調(diào)節(jié)序列、調(diào)節(jié)蛋白其他調(diào)節(jié)序列、調(diào)節(jié)蛋白如：激活蛋白如：激活蛋白(activator)(activator)可結(jié)合啟動序可結(jié)合啟動序列鄰近的列鄰近的DNADNA序列，促進(jìn)序列，促進(jìn)RNARNA聚合酶與啟動序聚合酶與啟動序列的結(jié)合，增強列的結(jié)合，增強

18、RNARNA聚合酶活性。聚合酶活性。啟動序列啟動序列編碼序列編碼序列操縱序列操縱序列polpol激活蛋白激活蛋白有些基因在沒有激活蛋白存在時，有些基因在沒有激活蛋白存在時，RNARNA聚聚合酶很少或完全不能結(jié)合啟動序列。合酶很少或完全不能結(jié)合啟動序列。啟動序列啟動序列編碼序列編碼序列操縱序列操縱序列polpol激活蛋白激活蛋白圖圖 轉(zhuǎn)錄水平的負(fù)調(diào)控與正調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平的負(fù)調(diào)控與正調(diào)控 mRNA阻遏蛋白阻遏蛋白IDNAZYAOPpol沒有乳糖存在時沒有乳糖存在時阻遏基因阻遏基因乳糖操縱子的負(fù)調(diào)節(jié)機制乳糖操縱子的負(fù)調(diào)節(jié)機制mRNA阻遏蛋白阻遏蛋白有乳糖存在時有乳糖存在時IDNAZYAOPpol啟動轉(zhuǎn)錄

19、啟動轉(zhuǎn)錄mRNA乳糖乳糖半乳糖半乳糖-半乳糖苷酶半乳糖苷酶阻遏物阻遏物有有2個結(jié)合位點：一個是誘導(dǎo)物結(jié)合位點，另一個結(jié)合位點：一個是誘導(dǎo)物結(jié)合位點，另一個是操縱基因結(jié)合位點。當(dāng)誘導(dǎo)物在相應(yīng)位點結(jié)合時，個是操縱基因結(jié)合位點。當(dāng)誘導(dǎo)物在相應(yīng)位點結(jié)合時，它改變了阻遏蛋白的構(gòu)象，干擾了另一位點的活性。這它改變了阻遏蛋白的構(gòu)象，干擾了另一位點的活性。這種類型的調(diào)控叫種類型的調(diào)控叫變構(gòu)調(diào)控變構(gòu)調(diào)控。 lac操操縱縱子子可可誘誘導(dǎo)導(dǎo)的的負(fù)負(fù)調(diào)調(diào)控控乳糖操縱子的正調(diào)節(jié)機制乳糖操縱子的正調(diào)節(jié)機制 細(xì)菌優(yōu)先利用葡萄糖作為碳源，抑制其細(xì)菌優(yōu)先利用葡萄糖作為碳源，抑制其他糖類代謝的操縱子表達(dá)，如果有葡萄糖存他糖類代謝

20、的操縱子表達(dá)，如果有葡萄糖存在，即使有乳糖等其它誘導(dǎo)物碳源的存在，在，即使有乳糖等其它誘導(dǎo)物碳源的存在，也優(yōu)先利于葡萄糖。也優(yōu)先利于葡萄糖。CAP的正性調(diào)節(jié)的正性調(diào)節(jié):catabolic activator protein (CAP蛋白蛋白)是一個同二聚體，是一個同二聚體，具有具有DNA結(jié)合域和結(jié)合域和cAMP結(jié)合位點。當(dāng)沒有葡萄糖存在時，結(jié)合位點。當(dāng)沒有葡萄糖存在時，由于由于cAMP的濃度受葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)，的濃度受葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)，cAMP濃度表現(xiàn)濃度表現(xiàn)為較高，這時為較高，這時cAMP與與CAP蛋白結(jié)合形成蛋白結(jié)合形成cAMP- CAP復(fù)復(fù)合物。此復(fù)合物可結(jié)合劑合物。此復(fù)合物可結(jié)合劑lac啟動基因上游附近的啟動基因上游附近的CAP位位點上，從而可增強轉(zhuǎn)錄達(dá)點上，從而可增強轉(zhuǎn)錄達(dá)50倍之多。倍之多。葡萄糖分解代謝降低葡萄糖分解代謝降低cAMP水平，使得其他分解代謝受阻。水平，使得其他分解代謝受阻。AYZOPI無葡萄糖，cAMP濃度高時CAPcAMPRNA pol有葡萄糖，cAMP濃度低時AYZOPIRNA polCAP乳糖操縱子調(diào)控方式的比較乳糖操縱子調(diào)控方式的比較與變構(gòu)物結(jié)合與變構(gòu)物結(jié)合 無活性無活性 有活性有活性負(fù)調(diào)控負(fù)調(diào)控正調(diào)控正調(diào)控調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)蛋白 阻遏蛋白阻遏蛋