人骨髓間充質(zhì)干細胞體外向肝樣細胞的誘導(dǎo)分化

1、人骨髓間充質(zhì)干細胞體外向肝樣細胞的誘導(dǎo)分化         11-04-01 14:42:00     作者：馬兆文，吳煒，陳瑜    編輯：studa20【摘要】  目的 ：研究人骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(human bone marrow derived mesenchymal stem cells，hBM-MSCs)在肝細胞生長因子(HGF)、成纖維細胞生長因子-4(FGF-4)、抑瘤素M(OSM)誘導(dǎo)下，體外向肝樣細胞的

2、誘導(dǎo)分化。方法：通過密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法獲得hBM-MSCs，分離的hBM-MSCs擴增傳至第6代，流式細胞儀檢測hBM-MSCs表面CD34、CD45、CD105、CD166表達。第6代hBM-MSCs生長達100%融合時采用兩步法對hBM-MSCs進行誘導(dǎo)分化。第1第14天采用IMDM誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含2% FCS、20 ng/mL HGF、20 ng/mL FGF-4)，第15第21天在上述培養(yǎng)基中加OSM(10 ng/mL)，促進誘導(dǎo)細胞的成熟，同時收集第0、第7、第14、第21天培養(yǎng)上清液標(biāo)本，ELISA法測ALB濃度。誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后采用RT-PCR、免疫熒光技術(shù)檢測誘導(dǎo)后肝細胞

3、特異標(biāo)志CK18、ALB的表達，PAS染色檢測誘導(dǎo)MSCs糖原儲存。結(jié)果：傳至第6代的hBM-MSCs CD34、CD45表達陰性，CD105、CD166表達陽性。在細胞因子的作用下，經(jīng)過21 d的體外培養(yǎng)，hBM-MSCs形態(tài)發(fā)生變化，由長梭形變?yōu)槎噙呅?、類圓形，并具有肝細胞特異的表型和功能。RT-PCR可檢測到CK18、ALB表達，免疫熒光可檢測到誘導(dǎo)后細胞內(nèi)CK18、ALB，培養(yǎng)上清中有ALB的分泌，且誘導(dǎo)后的肝樣細胞內(nèi)有糖原儲存。結(jié)論：hBM-MSCs體外能轉(zhuǎn)化為具有肝功能的肝樣細胞。 【關(guān)鍵詞】  間充質(zhì)干細胞;人骨髓間充質(zhì)干細胞;肝樣細胞;細胞因子Abstract: Ob

4、jective: To investigate the differentiation and induction ability of human bone marrow derived mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells induced by hepatocyte growth factor，fibroblast growth factor-4 and oncostatin Min vitro. Methods: Mesenchymal stem cells (MSCs) from human bone marrow were

5、 selected with density gradient centrifugation and plastic adherence. Flow cytometry was performed using the following mouse anti-human antibodies: anti-CD34 FITC， anti-CD45 FITC， anti-CD105 PE， anti-CD166 APC. The sixth generation MSCs were incubated with the each antibody and analyzed with a FACS-

6、Calibur with CellQuest software. For hepatogenic differentiation，the sixth generation cells reaching 100% confluence were induced by 2-step methed. Differentiation was induced by treating sixth generation MSCs with Step-1 differentiation medium， consisting of IMDM supplemented with 2% FCS， 20 ng/mL

7、HGF and 20 ng/mL FGF-4 for 14 days， followed by treatment with step-2 maturation medium， consisting of IMDM supplemented with 2% FCS， 20 ng/mL HGF， 20 ng/mL FGF-4，10 ng/mL oncostatin M. Medium changes were performed twice weekly. After 21 days culture，mRNA of ALB and CK18 was assessed with reverse t

8、ranscription polymerase chain reaction. Production of ALB and CK18 was assessed with immunofluorescence analysis and Elisa. Glycogen deposits were visualised in cells fixed in paraffin with conventional periodic acid-Schiff (PAS) staining. Results: The sixth generation MSCs from human bone expressed

9、 CD105 and cd166，and were negative for CD34 and CD45. After 21 days culture，MSCs gained in vitro the characteristic morphology and function of hepatocytes. Cellolar morphology changed from a spindle to a rather polygonal shape typically. Differentiated hBM-MSCs were highly positive for glycogen，and

10、expressed specific markers， such as CK-18 (cytokeratin 18) and ALB (albumin). Moreover， secretion of ALB by differentiated hBM-MSCs increased as culture time went by. Conclusion: Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells can differentiate into hepatocyte-like cells in response to HGF， FGF-4 a

11、nd OSM， which may be used as a kind of cell resources to treat severe hepatic disease.Key words: mesenchymal stem cells;human bone marrow-derived mesenchymal stem cells; hepatocyte-like;cytokine肝細胞移植、生物型人工肝是治療肝衰竭的有效手段，卻面臨肝細胞來源缺乏的困境，因此尋找新的肝細胞源代替成體肝細胞尤為迫切1-2。骨髓間充質(zhì)干細胞(human bone marrow derived mesenchy

12、mal stem cells，hBM-MSCs)體外容易分離，免疫原性弱，可大量擴增3，把hBM-MSCs定向分化為肝細胞，將對肝病的治療帶來新的思路和新的前景。當(dāng)前對骨髓體外向肝樣細胞誘導(dǎo)分化沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，細胞因子之間組合、誘導(dǎo)分化時細胞生長融合狀態(tài)也有爭議。本實驗探討了生長100%融合時的hBM-MSCs，在肝細胞生長因子(HGF)、成纖維細胞生長因子-4(FGF-4)、抑瘤素M(OSM)誘導(dǎo)培養(yǎng)下，向肝樣細胞的轉(zhuǎn)化，從而為骨髓間充質(zhì)干細胞對肝衰竭的治療提供理論依據(jù)。1 材料和方法1.1 實驗材料 骨髓由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨髓室提供。L-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FCS)、PAS

13、染色液、0.25%胰蛋白酶購于GIBCO公司，F(xiàn)icoll分離液購于Stem Cell公司，鼠抗人FITC-CD34，F(xiàn)ITC-CD45，PE-CD105，APC-CD166抗體購于美國BD公司，HGF，F(xiàn)GF-4，OSM購于Peprotec公司，RNA提取試劑盒購于Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Promega公司，PCR試劑盒購于大連寶誠公司，ALB測定試劑盒購于Bethyl公司。鼠抗人ALB，CK18抗體、兔抗鼠IgG-FITC購于美國BD公司。1.2 方法1.2.1 骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)：抽取肝素抗凝的健康成人骨髓5 mL，加等量體積的PBS稀釋，加于5 mL Fico

14、ll分離液中，1 500 r/min離心30 min。提取單個核細胞，PBS洗兩遍，用L-DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)配成濃度為2×109/L細胞懸液接種于六孔培養(yǎng)板中，每3天換液1次。當(dāng)細胞生長至80%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。1.2.2 第6代hBM-MSCs的鑒定：消化第6代hBM-MSCs，配成細胞濃度為1×106/mL的細胞懸液。取100 L細胞懸液，加鼠抗人FITC-CD34，F(xiàn)ITC-CD45，PE-CD105，APC-CD166熒光抗體，同時加各熒光抗體的同型對照抗體，4 避光孵育30 min，流式細胞儀檢測hBM-MSCs的純度。1.2.

15、3 MSCs誘導(dǎo)分化：當(dāng)?shù)?代MSCs生長100%融合時，按下述培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化。第1第14天IMDM誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含20 ng/mL HGF，20 ng/mL FGF-4，2% FCS)，第15第21天IMDM成熟培養(yǎng)基(含20 ng/mL HGF，20 ng/mL FGF-4，2% FCS，10 ng/mL OSM)。1.2.4 RT-PCR檢測誘導(dǎo)后ALB、CK-18的表達： 誘導(dǎo)后的細胞提取RNA，采用RT-PCR檢測ALB、CK18 表達。ALB上游引物：5-GATGTCTTCCTGGGCA-3，ALB下游引物：5-CTTGGGCTTGTGTTTCAC-3，PCR產(chǎn)物長度645 bp，退

16、火溫度52 ;CK18上游引物：5-GAAGGAGACCATGCAAAGCCTG-3，下游引物：5-CATGAAGAGCAGCTCCTCCTTG-3，PCR產(chǎn)物長度400 bp，退火溫度62 。內(nèi)參采用GAPDH，GAPDH上游引物：5-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3，下游引物：5-CAAAGT TGTCATGGATGACC-3，PCR產(chǎn)物長度195 bp4。1.2.5 PAS染色測定誘導(dǎo)后的糖原表達：細胞爬片后，誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d取玻片，4%的多聚甲醛固定后按說明書PAS染色。出現(xiàn)紅色、紫紅色顆粒說明糖原存在。1.2.6 免疫熒光測定誘導(dǎo)后MSCs細胞內(nèi)ALB，CK18表達：第6代h

17、BM-MSCs做細胞爬片，誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后，用PBS緩沖液洗細胞兩遍，4%的多聚甲醛固定15 min，3%的甲醛H2O2液浸泡5 min，PBS緩沖液沖洗兩遍，TritonX-100打孔，PBS洗兩遍，加封閉血清20 min，滴加一抗(鼠抗人ALB、CK18抗體)，4 過夜，滴加二抗(兔抗鼠IgG-FITC)，37 孵育90 min，PBS洗兩遍，熒光顯微鏡觀察。暗視野下綠色熒光為陽性。1.2.7 誘導(dǎo)培養(yǎng)上清液ALB測定：收集培養(yǎng)第0、第7、第14、第21天上清培養(yǎng)液，ELISA法測定上清中的ALB。2 結(jié)果2.1 hBM-MSCs體外培養(yǎng) 骨髓分離的PBMC細胞接種于六孔板中，3 d后可

18、見到梭形、紡錘形、多角形細胞克隆生長，起初生長較慢，20 d左右可生長到80%90%融合，胰酶消化傳代，傳代后的細胞兩個小時大部分貼壁，生長較快，一般來說35 d可增殖一倍，細胞形態(tài)變大，長梭形變成短梭形。圖1和圖2分別是原代和第6代細胞形態(tài)。2.2 第6代hBM-MSCs的鑒定 流式細胞儀測定顯示第6代hBM-MSCs CD105，CD166陽性，CD34，CD45陰性，MSCs純度較高。結(jié)果見圖3、圖4。2.3 刺激21 d后hBM-MSCs形態(tài)變化 誘導(dǎo)組hBM-MSCs出現(xiàn)明顯的細胞形態(tài)、體積變化，可見細胞由梭形變?yōu)槿切巍⒍嘟切位蝾悎A形。見圖5、圖6。2.4 RT-PCR檢測ALB，

19、CK-18表達 RT-PCR可以檢測到明顯的ALB，CK18條帶，ALB的PCR產(chǎn)物為645 bp，CK18的PCR產(chǎn)物為400 bp，與目的條帶相符。見圖7、圖8。2.5 PAS染色結(jié)果 21 d誘導(dǎo)后的MSCs細胞內(nèi)可見紅色、紫紅色顆粒，說明糖原有表達。見圖9、圖10。2.6 免疫熒光測定細胞內(nèi)ALB，CK18 MSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d可以檢測到細胞內(nèi)ALB，CK18表達。顯微鏡下呈綠色熒光，圖11、圖12是誘導(dǎo)后MSCs細胞內(nèi)ALB，CK18測定結(jié)果。2.7 上清液ALB測定 分別取誘導(dǎo)培養(yǎng)液第0、第7、第14、第21天上清培養(yǎng)液測定ALB的濃度。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品濃度計算公式，得出上清中ALB的濃度，結(jié)果如表1。3 討論肝細胞的來源是肝細胞移植、生物型人工肝首先要解決的問題。hBM-MSCs作為組織工程和基因工程的種子細胞有比較明顯的優(yōu)勢它貼壁生長，容易獲得，體外增殖能力強;通過反復(fù)換液，可以除去懸浮生長的造血干細胞，因此容