連翹的抗氧化成分研究

1、連翹的抗氧化成分研究        【摘要】     目的研究連翹的抗氧化作用，并分離、鑒定連翹抗氧化有效成分。方法用二苯代苦味肼基自由基 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 清除實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)連翹的甲醇提取物及其二氯甲烷、正丁醇、水的萃取物進(jìn)行抗氧化作用評(píng)價(jià)，并從有效部位分離得到化合物。結(jié)果與結(jié)論連翹的二氯甲烷萃取物具有很強(qiáng)的清除DPPH自由基的抗氧化活性，并從中分離、鑒定4個(gè)化合物，分別為連翹脂素(phillygenin)、連

2、翹苷(phillyrin)、forsythialan A 、連翹酯苷 (forsythoside A)。其中，forsythialan A和連翹酯苷 (forsythoside A)具有較強(qiáng)的DPPH清除作用，其半數(shù)有效值IC50分別為154.05和69.80 g/ml。     【關(guān)鍵詞】  連翹； 抗氧化； DPPH； forsythialan A； 連翹酯苷    Antioxidants from Forsythia suspensaPIAO Xianglan, WU Qian, TIAN Yan

3、zeInstitute of Chinese Minority Traditional Medicine, Minzu University of China, Beijing 100081,ChinaAbstract：ObjectiveTo investigate the antioxidative activity of Forsythia suspensa and to isolate and identify the active components. MethodsDPPH radical scavenging activity was tested for the MeOH ex

4、tract and its CH2Cl2, BuOH, H2O fractions.Results and ConclusionCH2Cl2 fractions from F. suspensa appeared potent antioxidant effects against the DPPH radical. Four components were isolated and identified as phillyrin, forsythialan A and forsythoside A, respectively. Forsythialan A and forsythoside

5、have strong antioxidant activity and the IC50 values were 154.05 and 69.80 g/ml, respectively.Key words： Forsythia suspensa;   Antioxidant;   DPPH;   Forsythialan A;   Forsythoside A    現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)氧化性應(yīng)激大約與兩百多種疾病的發(fā)生有關(guān), 其中包括自身免疫性疾病、糖尿病、白內(nèi)障、癌癥等的產(chǎn)生與發(fā)

6、展都可由自由基及其代謝產(chǎn)物誘發(fā)1。生物體具有有效的防御系統(tǒng)來保護(hù)它們，免遭活性氧或其它自由基導(dǎo)致的紊亂與疾病24。然而，自由基形成與抗氧化防御系統(tǒng)之間出現(xiàn)不平衡，過多的氧化壓抑，遠(yuǎn)超過防御機(jī)制能力，出現(xiàn)酶抗氧化防御的活性減小或在血清中的抗氧化劑濃度降低57。生物體內(nèi)過量的氧自由基會(huì)造成生物膜損傷、蛋白質(zhì)變性、酶失活及DNA復(fù)制出現(xiàn)錯(cuò)誤等，這些勢(shì)必導(dǎo)致一系列疾病，如血管粥樣硬化、高血壓病、糖尿病、癌、帕金森病、老年癡呆癥、衰老等。這時(shí)抗氧化劑就起到非常重要的角色?？寡趸烙到y(tǒng)是靠消除活性氧或使活性氧非活性化來完成810。所以人們更多地關(guān)心這種酶抗氧化體系活性的提高或可以直接消除活性氧的抗氧化劑

7、。現(xiàn)在研究主要集中在類似-lipoic acid、coenzyme Q10、GSH等人體內(nèi)細(xì)胞水平形成的抗氧化劑，或如維生素 C、維生素 E等人體內(nèi)不形成但通過食物、天然物攝入多種多樣的抗氧化劑11。但是合成的抗氧化劑，不僅是因?yàn)樗旧淼亩拘裕€有在高濃度攝取等都可以引起有害身體的問題，而且已有很多研究說明吃藥不如通過天然物攝取抗氧化劑，因此越來越多的研究者關(guān)心天然抗氧化劑。    中藥連翹為木犀科連翹屬植物連翹 Forsythia suspensa (Thunb. )Vahl的干燥果實(shí)，始載于神農(nóng)本草經(jīng)，性平，氣微香，味微苦，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱、消癰散結(jié)、強(qiáng)

8、心利尿和降血壓之功效，主產(chǎn)于我國(guó)東北、華北、長(zhǎng)江流域至云南等地，其中以山西晉南，河南豫西所產(chǎn)不但色澤鮮亮且質(zhì)量佳，為道地藥材。連翹是我國(guó)常用的大宗藥材，主要含有連翹酚( forsythol)、連翹苷(Phillyrin)、連翹苷元(phillygenin)、齊墩果酸( oleanolic acid, OLA)、白樺脂酸(betulinic acid)、烏索酸(ursolic acid,UA)、松脂素(pinoresinol)、甾醇化合物、馬苔樹脂醇苷(matairesinoside)和多種烴類、醛酮類、醇酯醚類揮發(fā)性成分12?，F(xiàn)代藥理研究表明，連翹具有廣譜抗菌、抗病毒等作用，對(duì)丹毒、頸淋巴結(jié)結(jié)

9、核、尿路感染、扁桃體炎、腎炎雙球菌等均有抑制作用，常用于急性胃炎，呼吸道感染等病癥。國(guó)內(nèi)有連翹敗毒片、復(fù)方鱉甲軟肝片、復(fù)方金連片、雙黃連口服液、復(fù)方金銀花沖劑等連翹復(fù)方制劑。    雖然對(duì)連翹的抗氧化活性報(bào)道了一些，但對(duì)連翹的活性氧消除作用及對(duì)氧化應(yīng)激保護(hù)作用的活性物質(zhì)的研究還不多。因此，對(duì)糖尿病、癌、動(dòng)脈硬化、老年癡呆以及老化等諸多疾病起主要因素的氧化應(yīng)激，進(jìn)行闡明連翹抗氧化性能，是很有研究意義的。所以，本研究利用體外二苯代苦味肼基自由基1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)清除方法，來探討連翹的抗氧化效果，并分離、鑒定有效成分

10、。1  材料    1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 購自日本W(wǎng)ako Pure Chemical Industries, Ltd.，分離用硅膠（200400目）購自青島化工廠，連翹果實(shí)購于北京同仁堂藥店，并經(jīng)本教研室鑒定為Forsythia suspensa果實(shí)。所有試劑均為分析純。2  方法2.1  連翹的提取與分離連翹根（500 g），用 8，6，6倍量的 80% MeOH加熱回流提取 3次，每次 3 h，合并3次提取液，減壓濃縮，真空干燥，得甲醇提取干膏 84.5 g。甲醇提取物用 50

11、0 ml的水混懸，依次用二氯甲烷（3次）、正丁醇（3次）萃取，得二氯甲烷萃取物 45.3 g。2.2  連翹抗氧化有效成分的分離取連翹二氯甲烷萃取物 (24 g)進(jìn)行硅膠柱色譜，醋酸乙酯-甲醇（1001 21）梯度洗脫，薄層色譜配合檢識(shí)，得到6個(gè)組分（Fr. 16）。Fr. 4再經(jīng)硅膠柱色譜，三氯甲烷-甲醇（201）洗脫，重結(jié)晶，得到化合物1（20 mg），2（98 mg），3（20 mg），4（25 mg）。2.3  DPPH自由基消除活性抗氧化活性是參照文獻(xiàn)13稍加修改后用光譜儀檢測(cè)。用乙醇溶解的不同濃度的樣品100 l與120 mol/L DPPH溶液 100 l，加

12、入96孔板中，混勻后，室溫放置30 min，然后在517 nm處測(cè)吸收度。DPPH 自由基水平用 microplate reader (SPECTRAmax 340PC, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 測(cè)定。用百分率與不加樣品的對(duì)照組進(jìn)行自由基消除效果的比較，然后用半數(shù)抑制率IC50（抑制50%的DPPH自由基生成所需樣品的濃度）表示抗氧化活性。2.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法每組結(jié)果以±s表示，控制組與樣品處理組間通過SAS 8.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)軟件，用one-way ANOVA

13、分析數(shù)據(jù)。P < 0.05則可認(rèn)為組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著差異。3  結(jié)果3.1  體外DPPH消除作用DPPH自由基(二苯代苦味肼基自由基, 1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl)是一種穩(wěn)定的以氮為中心的質(zhì)子自由基，其乙醇溶液呈紫色，并在517 nm 處有強(qiáng)烈吸收，在有自由基清除劑存在時(shí)，自由基清除劑提供一個(gè)電子與DPPH 的孤對(duì)電子配對(duì)，而使其褪色，褪色程度與其接受的電子呈定量關(guān)系，在517 nm處的吸光度變小，其變化程度與自由基清除程度呈線性關(guān)系，即自由基清除劑的清除自由基能力越強(qiáng)，吸光度越小。    連翹甲醇提取物

14、及其不同溶劑萃取物均有濃度依賴性的 DPPH 消除作用，尤其是二氯甲烷萃取物具有較強(qiáng)的DPPH 消除作用（見圖 1）。    如圖所示，不同濃度的連翹的甲醇提取物以及其二氯甲烷萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物均顯示出劑量依賴性地DPPH 自由離子基消除活性（P< 0.05）。尤其是二氯甲烷萃取物對(duì)DPPH自由離子基的產(chǎn)生具有最強(qiáng)的抑制作用（P< 0.05），在100 g/ml濃度就清除75%的DPPH，在各萃取組分中活性最強(qiáng)，可判斷為活性成分集中在連翹的二氯甲烷萃取物中。3.2  連翹有效成分的鑒定從連翹二氯甲烷萃取物中，分離得到4個(gè)化合物。根

15、據(jù)它們的理化性質(zhì)及其質(zhì)譜、1H-NMR、13C-NMR，與文獻(xiàn)1416一致，被鑒定為連翹脂素 (phillygenin)、連翹苷(phillyrin)、forsythialan A 、連翹酯苷 (forsythoside A) (見圖2)。3.3  連翹有效成分的鑒定對(duì)所分離的4個(gè)化合物進(jìn)行DPPH自由基清除活性檢測(cè)，結(jié)果forsythianlan A和連翹酯苷 (forsythoside A) 具有較高的DPPH清除活性（見表1）。它們的半數(shù)抑制率 （IC50）分別為154.05和69.80 g/ml，而其它兩個(gè)化合物的半數(shù)抑制率超過200 g/ml。表1  連翹有效成分

16、的DPPH自由基清除作用(略)4  討論    活性氧自由基是生物體生命活動(dòng)過程中由機(jī)體生物化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，是一些處于激發(fā)態(tài)的含氧基團(tuán)，在生物體衰老與疾病、正常的免疫代謝、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等過程中都起著重要的作用。在正常情況下，體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除是平衡的，一旦自由基產(chǎn)生過多或抗氧化體系出現(xiàn)故障，體內(nèi)自由基代謝可能失衡，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞損傷、DNA斷裂等。研究發(fā)現(xiàn)，生物體的多種疾病都與自由基對(duì)機(jī)體的氧化損傷有關(guān)。抗氧化劑或自由基清除劑能有效抑制或緩解自由基對(duì)機(jī)體的不利影響，起到防病、治病和延緩衰老的作用，因此尋找和開發(fā)能夠清除氧自由基的抗

17、氧化劑成為當(dāng)前許多學(xué)科研究的熱點(diǎn)。    本實(shí)驗(yàn)采用了DPPH自由基清除活性方法來測(cè)定連翹各組分的抗氧化活性，這種方法在國(guó)外廣泛用于植物材料的總抗氧化活性的評(píng)價(jià)和抗氧化劑的篩選。DPPH是一種穩(wěn)定存在的有機(jī)自由基，由于苯環(huán)的內(nèi)軛和位阻及硝基的吸電子作用，呈現(xiàn)紫色，被還原后變?yōu)闇\黃色，通過測(cè)定反應(yīng)體系在517 nm附近的吸收峰的下降程度可以直接評(píng)價(jià)其抗氧化活性，變化程度與自由基清除程度呈線性關(guān)系。該方法簡(jiǎn)便易行，且靈敏度高。    實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，連翹的甲醇提取物及其二氯甲烷、正丁醇和水萃取物都具有一定的抗氧化活性。甲醇提取物和二氯甲烷萃

18、取物具有較強(qiáng)的抗DPPH自由基活性，尤其是二氯甲烷萃取物具有最強(qiáng)的抗氧化活性（P<0.05），從中分離、鑒定了有效成分forsythialan A和連翹酯苷，但其確切的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。在接下來的實(shí)驗(yàn)中，課題組將結(jié)合化學(xué)成分研究配合現(xiàn)代藥理學(xué)跟蹤，對(duì)獲得的主要成分進(jìn)行深入研究，為其開發(fā)利用提供化學(xué)和藥理學(xué)依據(jù)，以便擴(kuò)大我國(guó)藥用資源的開發(fā)和利用。    【參考文獻(xiàn)】  1Beckman K B, Ames B N. The free radical theory of aging matures J. Physiol Rev.，

19、1998， 78(2): 547.2Sies H. Oxidative stress: oxidants and antioxidants J. Exp Physiology.， 1997， 82(2): 291.3Evans P， Halliwell B. Free radicals and hearing: cause， consequence， and criteria J. Ann N Y Acad of Sci.， 1999， 884(Ototoxicity): 19.4Abraham S， Soundararajan C C. Vivekanandhan S， et al. Ery

20、throcyte antioxidant enzymes in Parkinson's disease J. Indian J Med Res.， 2005， 121(2): 111.5Redon J， Oliva M R， Tormos C， et al. Antioxidant Activities and Oxidative Stress Byproducts in Human Hypertension J. Hypertension， 2003， 41(5): 1096.6Sanchez-Moreno C， Dashe J F， Scott T， et al. Decrease

21、d Levels of Plasma Vitamin C and Increased Concentrations of Inflammatory and Oxidative Stress Markers After Stroke J. Stroke， 2004， 35(1): 163.7Bokov A， Chaudhuri A， Richardson A. The role of oxidative damage and stress in aging J. Mech Ageing Dev.， 2004， 125(10): 811.8Cavalca V， Cighetti G， Bamont

22、i F， et al. Oxidative stress and homocysteine in coronary artery disease J. Clin Chem.， 2001， 47(5): 887.9Gibson G E， Huang H. Oxidative stress in Alzheimer's disease J. Neurobiol Aging， 2005， 26(5): 575.10Ray G， Batra S， Shukla N K， et al. Lipid peroxidation， free radical production and antioxidant status in breast cancer J. Breast Cancer Res Treat.， 2000， 59(2): 163.11Kuhn M A. Oxygen free radicals and antioxidant