傳染病病原診斷技術(shù)

1、Friend or Foe?RotavirusEbola virusBacteriumAlgaeProtozoanVirusl大部分人類致命性疾病均是由動物傳播，包括現(xiàn)正肆虐全球的禽流感。l每年至少有一種新病原體，包括病毒、細(xì)菌、寄生蟲、原生動物和真菌等從動物傳染給人類。l前所未有的速度產(chǎn)生突變，并傳給人類，就如艾滋病、馬爾堡出血熱、SARS以及現(xiàn)正肆虐全球的禽流感等難抗病毒。l研究人員分辨1407種令人類生病的病原體，發(fā)現(xiàn)其中至少800種越過種物界線，由動物傳至人類。 新發(fā)傳染病動物傳播新發(fā)傳染病動物傳播人類與傳染病較量中的四方面重大人類與傳染病較量中的四方面重大突破突破隔離檢疫制度的建立;

2、病原微生物的發(fā)現(xiàn);特效藥物的出現(xiàn);疫苗的誕生 .AdenovirusRotavirus(courtesy of Linda Stannard, University of Cape Town, S.A.)Positive immunofluorescence test for rabies virus antigen. (Source: CDC)(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital)From Principles of Virology , Flint et al ASM pressFrom Principles of Virology ,

3、 Flint et al ASM pressFrom Principles of Virology , Flint et al ASM pressgenomeprobe32P 35S 3H 125I 生物素生物素 地高辛地高辛 酶酶genomegenomegenomeprobeprobeprobe檢測方法：放射自顯影檢測方法：放射自顯影 底物顯色底物顯色 化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光斑點雜交（斑點雜交（spot blot hybridization)凝膠電泳印跡轉(zhuǎn)移雜交（凝膠電泳印跡轉(zhuǎn)移雜交（Southern blot hybridization)原位雜交（原位雜交（in-situ hybridizati

4、on)聚合酶鏈反應(yīng)（聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本步驟和原理基本步驟和原理變性（高溫）變性（高溫）退火（低溫）延伸（適溫）延伸（適溫）每一循環(huán)每一循環(huán)模模 板板引物引物引物引物dATP dGTP dTTP dCTP Taq酶酶PCR原理和步驟原理和步驟建立該病原體的鑒定方法動物試驗臨床實驗室診斷流行病學(xué)研究等分離到該病原體確定一種疾病病原體的基本步驟確定一種疾病病原體的基本步驟最終確定病原體與疾病的病因?qū)W關(guān)系Multiplex PCR-Mass Tag system多重 PCR-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)美國哥倫比亞大學(xué)Lipkin 研究組發(fā)明了一種基于multiplex PCR-MassTag（多重PCR與質(zhì)

5、譜聯(lián)用）的高通量病原體快速篩選技術(shù)。優(yōu)點：由于使用光敏感的分子量標(biāo)簽，增強了multiplex PCR引物設(shè)計的適應(yīng)性和靈活性，使檢測通量有大幅度的提高。應(yīng)用質(zhì)譜分析PCR產(chǎn)物上的分子量標(biāo)簽克服了凝膠電泳分辨率的局限或熒光染料種類的局限。1. PCR amplification with conjugated primers90 minutes2. PCR purification on filter plate30 minutes3. Elution into 96-well loading platefor mass spectrometer analysis4. Automated sa

6、mple injection, photocleavageand detection1:30 minutes/sampleUltraviolet Light5. Identification of pathogen by signal analysisTHE JEROME L. AND DAWN GREENEINFECTIOUS DISEASE LABORATORYMAILMAN S C H OO L OF PUB L I C H EA L T H Co l u m b i a U n i ver s it yPCR-Mass Tag systemNUCLEIC ACID CONJUGATED

7、 MASS TAGSTHE JEROME L. AND DAWN GREENEINFECTIOUS DISEASE LABORATORYMAILMAN S C H OO L OF PUB L I C H EA L T H Co l u m b i a U n i ver s it yPhotocleavable linker and spacerMS sensitivity enhancerVariable mass unit DETECTION OF 58 DIFFERENT MASS TAGS BY APCI-MSTHE JEROME L. AND DAWN GREENEINFECTIOU

8、S DISEASE LABORATORYMAILMAN S C H OO L OF PUB L I C H EA L T H Co l u m b i a U n i ver s it y目前，建立在此技術(shù)上的有呼吸道病原體檢測模塊（包括19個病毒和3種細(xì)菌），流感病毒亞型檢測模塊，出血熱病原體檢測模塊，痘疹病毒檢測模塊和腦炎腦膜炎病原體檢測模塊。盡管目前已開發(fā)的分子量標(biāo)簽只有64個，但根據(jù)質(zhì)譜分析的分子量范圍，還可有極大的拓展空間，保證了這一技術(shù)具有足夠的發(fā)展前景和潛力。 THE JEROME L. AND DAWN GREENEINFECTIOUS DISEASE LABORATORYMA

9、ILMAN S C H OO L OF PUB L I C H EA L T H Co l u m b i a U n i ver s it yCurrent Respiratory PanelIn ProgressTHE JEROME L. AND DAWN GREENEINFECTIOUS DISEASE LABORATORYMAILMAN S C H OO L OF PUB L I C H EA L T H Co l u m b i a U n i ver s it yEnterovirusAdenovirusCurrent PanelIn ProgressTHE JEROME L. A

10、ND DAWN GREENEINFECTIOUS DISEASE LABORATORYMAILMAN S C H OO L OF PUB L I C H EA L T H Co l u m b i a U n i ver s it yACBLabNetworkEpidemiology Microbiology research service training infectiousagentssamplesclinical dataGLOBAL SURVEILLANCE NETWORK Animal modelsdrugsvaccinesDrosten, HamburgLipkin, New

11、YorkMackenzie, PerthPauli, BerlinPeiris, Hong KongQian, BeijingPerez-Brena, MadridSwanepoel, South AfricaWebster, MemphisWen, ShanghaiLUMINEX XMAP技術(shù)：多技術(shù)：多指標(biāo)并行檢測系指標(biāo)并行檢測系統(tǒng)（流式熒光技統(tǒng)（流式熒光技術(shù)或液芯技術(shù)）術(shù)或液芯技術(shù)）技術(shù)技術(shù)GENOCA Templex PCR技術(shù)技術(shù):多指多指標(biāo)并行擴增標(biāo)并行擴增Super PrimerTemplex PCR技術(shù)原理技術(shù)原理Templex PCR技術(shù)原理技術(shù)原理流式熒光技術(shù)（液芯）原理流

12、式熒光技術(shù)（液芯）原理XMAP每種微球的地址由兩每種微球的地址由兩種紅色熒光顏料的摻種紅色熒光顏料的摻入比例唯一決定入比例唯一決定CONHLuminex 100多功能流式點陣儀多功能流式點陣儀流式熒光檢測儀流式熒光檢測儀 呼吸道感染型11種DNA基因組的病原體呼吸道感染型13種RNA基因組病毒型病原體 微小的乳膠顆粒（Beads,微球）分別染成不同的熒光色，然后再把針對不同檢測物的蛋白（如抗原抗體）以共價方式結(jié)合到特定顏色的微球上。應(yīng)用時，先把針對不同檢測物的、用不同顏色編碼的微球混合，再加入被檢測物（被測物可以是血清中的抗原、抗體、或酶等）。The Red Laser is Used to

13、Identify the Bead CodeThe Green Laser is Used to Identify the Reporter Signal MASAMASATMTM和ELISA靈敏度的比較基因芯片（基因芯片（Gene ChipGene Chip） 何謂基因芯片：何謂基因芯片：基因芯片（或DNA Chip,或Microarray）又稱DNA微陣列，是指固定在固相載體上的高密度DNA微點陣。即將大量靶基因或寡核苷酸片段有序地，高密度地（點與點間距一般小于500m） 排列在玻璃、硅等載體上，稱之為基因芯片。基因芯片的種類：基因芯片的種類： 按應(yīng)用，基因芯片主要可分為3類：1、表達譜基

14、因芯片：主要用于基因功能研究；2、診斷基因芯片：如肝癌診斷芯片、糖尿病診斷芯片、病原體多基因診斷芯片等：3、檢測芯片：如商品檢疫芯片、病原體檢測芯片等。Viral Pathogen Custom Microarray病原體診斷基因芯片0.05 CPSMDetect 5 dye molecules in 10um pixel0.1 CPSMDetect 10 dye molecules in 10um pixelBackName Your DesignSelect Array FormatAgrobacteriumAnopheles (AG) and Plasmodium (PB).ie. ma

15、laria microarrayArchaeon, Halobacterium sp. Bacillus cereus Bacterial pathogensBifidobacterium longum Bordetella PertussisChlamydophila abortusCulex pipiensCyanobacterium SynechocystisE.ColiErwinia carotovora atroseptica/Solanum tuberosumLactobacillus plantarum Methylobacterium extorquens AM1Plasmod

16、ium falciparumPseudomonas aeruginosaS.aureus; N.meningococcus; E.coliSalmonella typhimuriumStaphylococcus aureusSARS CoronavirusHuman Coronavirus OC43Human Coronavirus 229ESample: WNV NY99 100,000 RNA copies/ml32/45 top hits are WNV-specific; remainder are JEV group or other flavivirus-genus probesC

17、ollaboration between the Greene Laboratory of Columbia University, ICTV , Northeast Biodefense Center, and Agilent CorporationSample: SARS-CoV100,000 RNA copies/mlColumbia (Briese, Lipkin, Liu, Lussier Palacios), ICTV (Bchen-Osmond), and Agilent (Hirschberg) 251,000 sequence database, 1710 vertebrat

18、e viruses方法關(guān)鍵環(huán)節(jié)優(yōu)點缺點cDNA文庫篩選構(gòu)建文庫適用范圍廣過程繁瑣，工作量大，需篩選大量的克隆基于保守序列的PCR引物的選擇簡便高效局限于檢測同源性相近的未知病毒代表性差異分析基于PCR技術(shù)的消減雜交非常靈敏不能消除不同mRNA豐度的差異，需多輪雜交，涉及接頭連接和去除的效率，技術(shù)難抑制性消減雜交差異雜交的cDNA消減重復(fù)性高靈敏度低，不易檢測低豐度基因SISPA接頭與片斷的連接、克隆篩選適用范圍廣易受試劑中的核酸污染，工作量大，需篩選大量的克隆隨機PCR法克隆篩選、減少污染適用范圍廣、簡便易受試劑中的核酸污染，工作量大，需篩選大量的克隆芯片芯片的設(shè)計通量大成本高，無法克服保守的

19、同源序列及重序?qū)﹄s交信息的干擾滾環(huán)擴增法滾環(huán)復(fù)制高效只適合于環(huán)狀病毒A Novel Coronavirus AssociatedA Novel Coronavirus Associatedwith Severe Acute Respiratory Syndromewith Severe Acute Respiratory Syndromevirus-isolation techniques electron-microscopical histologic studiesMolecular and serologic assaysPrimer pair IN-2 (+) 5GGGTTGGGACTATCCTAAGTGTGA3IN-4 () 5TAACACACAACICCATCATCA3conserved regions of open reading frame 1bA 405-nucleotide segmentThe Ge