急性脊髓損傷動物模型的建立與評估

1、急性脊髓損傷動物模型的建立與評估吳楊鵬，范 筱，張 俐(福建中醫(yī)藥大學(xué)骨傷學(xué)院省部共建教育部重點實驗室，福建省福州市 350122)引用本文：吳楊鵬，范筱，張俐. 急性脊髓損傷動物模型的建立與評估J.中國組織工程研究，2016，20(49):7341-7348.DOI:6.49.007 ORCID: 0000-0002-6554-0329(張俐)文章快速閱讀：通過自制改良Allens法成功建立脊髓撞擊損傷模型吳楊鵬，男，1990年生，福建省漳州市人，漢族，福建中醫(yī)藥大學(xué)在讀碩士，主要從事脊髓損傷方面的研究。通訊作者：張俐，博士，教授，博士生導(dǎo)師，福建中醫(yī)藥大學(xué)骨傷學(xué)院省部共建教育部重點實驗室，

2、福建省福州市350122中圖分類號:R318文獻(xiàn)標(biāo)識碼:B文章編號:2095-4344(2016)49-07341-08稿件接受：2016-09-06選用健康雌性SD大鼠30只，隨機(jī)分為5組。實驗結(jié)果：通過與NYU 脊髓損傷模型比較，證明了實驗自制打擊器建立的脊髓損傷模型是一種穩(wěn)定性較好的脊髓損傷模型，方法簡單，重復(fù)性強(qiáng)，可為脊髓損傷機(jī)制研究及藥物治療提供穩(wěn)定的動物模型。術(shù)后1周測定指標(biāo)：(1)行為學(xué)評分(BBB和Reuter評分)；(2)觀察神經(jīng)元半定量計數(shù)分析以及脊髓損傷面積比變化；(3)進(jìn)行病理學(xué)檢查。假手術(shù)組6只，只摘除椎板，不打擊。模型組24只(分為自制打擊器5， 10 cm組， N

3、YU打擊器1.25，2.5 cm組，每組6只)，摘除椎板，用兩種打擊器建立不同程度的脊髓損傷模型。病理切片示：假手術(shù)組見脊髓灰、白質(zhì)分界清晰，呈蝴蝶狀，神經(jīng)元細(xì)胞核大、核仁明顯、數(shù)量較多，胞質(zhì)內(nèi)斑塊狀或虎斑樣尼氏體清晰;余各組出現(xiàn)不同程度的淤血灶，神經(jīng)元數(shù)目減少，損傷處可見細(xì)胞腫脹，軸突脫髓鞘改變，部分細(xì)胞呈空泡樣改變，尼氏體模糊或消失，說明造模成功。 文題釋義：脊髓損傷：是是指外力直接或間接作用于脊髓，引起脊髓功能性或器質(zhì)性損害，以及繼發(fā)一系列病理改變進(jìn)一步加重脊髓損傷，從而出現(xiàn)不可逆性的損傷平面以下感覺、運(yùn)動、括約肌功能障礙、肌張力異常及病理反射。脊髓損傷模型：建立與人類發(fā)病相近的動物模型

4、，探其發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療藥物逐漸引起重視。文章選用成年雌性SD大鼠，用撞擊損傷模型方法進(jìn)行造模，方法容易重復(fù)，通過自制打擊器改良Allens法成功建立脊髓撞擊損傷模型。摘要背景：目前國內(nèi)外脊髓損傷模型的設(shè)計種類繁多，各有其優(yōu)缺點，但尚未有一種客觀化、標(biāo)準(zhǔn)化的模型以滿足臨床研究。目的：設(shè)計一種簡易打擊器并建立脊髓損傷模型，通過與NYU(New York University)打擊器建立的脊髓損傷模型進(jìn)行對比，評估自制改良Allens 脊髓損傷模型的參數(shù)及穩(wěn)定性。方法：雌性SD大鼠隨機(jī)分為5組，即假手術(shù)組(A組6只)，自制打擊器5，10 cm組(B1，B2組)，NYU打擊器1.25，2.5

5、cm組(C1，C2組)，A組不打擊，其余各組根據(jù)分組的不同高度進(jìn)行打擊，每組6只；各組分別與造模術(shù)后1，3，5，7 d進(jìn)行行為學(xué)評分，冰凍切片后用尼氏染色法觀察病理學(xué)改變，并進(jìn)行半定量分析。結(jié)果與結(jié)論：在行為學(xué)評分、脊髓損傷面積比和脊髓前、后角神經(jīng)元半定量分析中，同一時間點，其他4組與A組比較差異均有顯著性意義(P < 0.05)，B1組和C1組、B2組和C2組差異無顯著性意義 (P > 0.05)，B1組和B2組、C1組和C2組差異均有顯著性意義(P < 0.05)；病理學(xué)改變：A組見脊髓灰、白質(zhì)分界清晰，呈蝴蝶狀，神經(jīng)元細(xì)胞核大、核仁明顯、數(shù)量較多，胞質(zhì)內(nèi)斑塊狀或虎斑樣尼

6、氏體清晰；余各組出現(xiàn)不同程度的淤血灶，神經(jīng)元數(shù)目減少，損傷處可見細(xì)胞腫脹，軸突脫髓鞘改變，部分細(xì)胞呈空泡樣改變，尼氏體模糊或消失；結(jié)果證實，自制打擊器能制備出不同損傷程度的脊髓損傷模型，與NYU脊髓損傷模型效果相近，可靠性高，穩(wěn)定性好，且操作簡單，易于推廣，可為大鼠脊髓損傷的研究提供基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：實驗動物；神經(jīng)損傷與修復(fù)動物模型；脊髓損傷；動物模型；改良Allens法；感覺評分；BBB評分；尼氏染色；冰凍切片；國家自然科學(xué)基金主題詞：脊髓損傷；模型，動物；神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)；組織工程基金資助：國家自然科學(xué)基金項目(81273775)；福建省百千萬工程領(lǐng)軍人才項目(閩委人才20144號)Establ

7、ishment and evaluation of the animal model of acute spinal cord injuryWu Yang-peng, Fan Xiao, Zhang Li (Key Laboratory of Ministry of Education of the Peoples Republic of China, School of Orthopaedics and Traumatology of TCM, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian P

8、rovince, China )AbstractBACKGROUND: There are a variety of methods for modeling spinal cord injury at home and abroad, showing their own advantages and disadvantages, but not yet a kind of objective and standardized model meeting the clinical research.OBJECTIVE: To design a simple impactor used for

9、establishing the spinal cord injury model, then to evaluate the parameters and stability of the Allens spinal cord injury model through comparing with the New York University (NYU) impactor established model. METHODS: Female rats were equivalently allotted into five groups: sham-operation group (gro

10、up A), self-made impactor 5 and 10 cm groups (group B1 and B2) and NYU 1.25 and 2.5 cm groups (group C1 and C2). All groups except group A were subjected to striking at different heights. Behavioral scores were detected at 1, 3, 5 and 7 days after modeling. Nissl staining was used to observe the mor

11、phological changes after freezing section and semiquantitative analysis. RESULTS AND CONCLUSION: (1) At the same time point, the behavioral scores, damaged area ratio of spinal cord and semiquantitative analysis of dorsal horn neurons showed significant differences in the group A compared with the o

12、ther groups, also between groups B1 and B2, and groups C1 and C2 (P < 0.05), but no significant differences were found between groups B1 and C1, as well as groups B2 and C2 (P > 0.05). (2) In the group A, there was a clear boundary between the grey and white matter in a butterfly shape, numero

13、us neurons with large nucleus and obvious nucleolus, and plaques or tabby of Nissl body appeared in the cytoplasm. In contrast, in the other four groups, there were few neurons, different degrees of Gore focal, swelling, demyelinating, and vacuole of cellula could be found, and Nissl body was fuzzy

14、or disappeared. These results administrate that the self-made impactor can establish different damage degrees of spinal cord inury models, which are close to the NYU-made models. Moreover, it can be helpful for study on spinal cord injury for reasons of good stability, low cost, and operated easily.

15、Subject headings: Spinal Cord Injury; Animal Models; Neurobehavioral Manifestations; Tissue EngineeringFunding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81273775; the Millions Talents Engineering of Fujian Province, No. 20144Cite this article: Wu YP, Fan X, Zhang L. Establishment and ev

16、aluation of the animal model of acute spinal cord injury. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(49):7341-7348.Wu Yang-peng, Studying for masters degree, Key Laboratory of Ministry of Education of the Peoples Republic of China, School of Orthopaedics and Traumatology of TCM, Fujian University of T

17、raditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, ChinaCorresponding author: Zhang Li, M.D., Professor, Doctoral supervisor, Key Laboratory of Ministry of Education of the Peoples Republic of China, School of Orthopaedics and Traumatology of TCM, Fujian University of Traditional Chinese M

18、edicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China0 引言 Introduction脊髓損傷是指外力直接或間接作用于脊髓，引起脊髓功能性或器質(zhì)性損害，以及繼發(fā)一系列病理改變進(jìn)一步加重脊髓損傷，從而出現(xiàn)不可逆性的損傷平面以下感覺、運(yùn)動、括約肌功能障礙、肌張力異常及病理反射。脊髓損傷因治療費(fèi)用高、傷情嚴(yán)重復(fù)雜、處理難度大、并發(fā)癥多和治愈率低等特點，給患者、家屬及社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)1-5。目前對脊髓損傷的療效仍急待提高5-6。建立理想的脊髓損傷模型是研究脊髓損傷機(jī)制及治療的前提。目前脊髓損傷模型主要有脊髓撞擊損傷模型、脊髓缺血損傷模型、脊髓壓迫損傷模型、脊髓

19、牽拉損傷模型、鉗夾型脊髓損傷模型、光化學(xué)損傷模型、橫向骨折脫位致?lián)p傷模型、脊髓橫貫損傷模型等7-23。早期Allen設(shè)計的脊髓損傷模型，臨床相似性高，可控性好，易于復(fù)制，但打擊瞬間脊髓容易偏移導(dǎo)致脊髓受力不均，未能較好定量分析；Gruner24對Allens法進(jìn)行改良，研制出NYU(New York University)打擊模型, 并在部分重點實驗室運(yùn)用25-26，該法集智能化、可調(diào)可控、精確打擊和可重復(fù)性好等優(yōu)點，已成為當(dāng)今一種相對標(biāo)準(zhǔn)化的脊髓損傷模型，但因價格昂貴，未能普及。實驗基于經(jīng)典Allens法的基本原理進(jìn)行改良，并與NYU打擊模型進(jìn)行比較，旨在設(shè)計出一種臨床相似性高、可控制、可復(fù)

20、制、操作簡單、易于推廣的脊髓損傷模型，為進(jìn)一步脊髓損傷研究奠定基礎(chǔ)。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 實驗材料 隨機(jī)對照動物實驗，于2015年10月至2016年1月在福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗室完成。 自制打擊器：該打擊器主要適用于制備大鼠脊髓撞擊損傷模型，參考國內(nèi)外學(xué)者自制打擊模型的設(shè)計原理，并進(jìn)行簡化、改良，設(shè)備由底座、支架、持管夾、小墊片、1 mL針筒套管、撞針、切口撐開器組成。NYU打擊器：型號：Impactor M-(Spinal Cord Contusion System)，Serial No.Cs099。實驗試劑：尼氏染色液(焦油紫法)：試劑A：Cres

21、yl violet Stain，試劑B：Nissl Differentiation，由上海源葉生物科技有限公司提供。1.2 實驗動物 隨機(jī)選取成年雌性SD大鼠30只，體質(zhì)量200-220 g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，許可證號：SCXK(滬)2012-0002。1.3 造模方法 簡易打擊器的設(shè)計 撞針為直徑約2.5 mm、質(zhì)量7 g的鋼制克氏針，1 mm針筒套管內(nèi)徑為約3.2 mm，用于導(dǎo)引撞針精確打擊脊髓，套管外粘貼醫(yī)用膠布并標(biāo)記刻度，墊片為1 mm厚的塑料片，用于貼附在暴露的脊髓表面，使撞針打擊處受力均勻，防止撞擊或移動套管時使硬脊膜破裂。使用前在重物垂直參照下，調(diào)整裝置，使套

22、管垂直地面，并移到貼附有小墊片的目標(biāo)脊髓上方約2 mm處，通過調(diào)控撞擊針的打擊高度，從而制備出不同程度的脊髓損傷模型，撞擊后，鋼針停留5 s(見圖1a)。對照NYU打擊器(見圖1b)。 動物分組 取SD雌性大鼠30只，根據(jù)不同打擊高度，按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，首先對30只雌鼠進(jìn)行稱重，編號1-30，再通過SPSS隨機(jī)數(shù)生成法對1-30號隨機(jī)分為5組，然后將對應(yīng)編號的老鼠放到相應(yīng)組別中，即假手術(shù)組(A組)，實驗組B1(5 cm)組、B2(10 cm)組，NYU組C1(1.25 cm)組、C2(2.5 cm)組，每組6只。 脊髓撞擊損傷模型建立 先用7%水合氯醛 (500 mg/kg)腹腔麻醉后，

23、用硫化鈉脫毛，并在T13肋骨與脊柱中線做一“倒置T”標(biāo)記，常規(guī)消毒后，于標(biāo)記處做一2.0-3.0 cm縱行切口，依次切開皮膚、皮下筋膜,暴露手術(shù)區(qū)肌肉，肉眼觀察，可見椎旁肌表面銀白色腱膜，兩側(cè)腱膜在后正中線最接近處，約平對T13棘突，用血管鉗鈍性剝離肌肉暴露棘突、椎板和橫突。一側(cè)用眼科剪緊貼棘突剪斷與其相連的肌肉、肌腱，制造一切口，長度以T9-T11，深度達(dá)關(guān)節(jié)突為止。為減少出血，采用以小幅度撕扯為主，剪離為輔的方法進(jìn)行操作。將附于椎管側(cè)壁以及關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)的肌、肌鍵等軟組織清理干凈，清晰暴露關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)、椎間孔以及椎管側(cè)壁，同時顯露T9-T11 3個棘突及其椎板，其中可見T9棘突傾向尾側(cè)，T10棘

24、突中立位，T11棘突傾向頭側(cè)，3個胸椎的棘突簇在一起，這一特征作為解剖定位的標(biāo)志。依次切斷棘上韌帶，棘間韌帶，小咬骨鉗咬除T10棘突，用齒鑷輕提起T9橫突，在T11兩側(cè)橫突處剪開兩個小口，并往下剪斷T10椎弓根，再用小咬骨鉗剪開缺口處的椎板，由下往上時擴(kuò)窗時，可用神經(jīng)剝離子撥開脊髓，再用小咬骨鉗咬除雙側(cè)T10椎板，充分暴露目標(biāo)脊髓段T10，將1 mm后的小墊片貼附在硬脊膜上。A組不打擊，B1、B2組用自制打擊器、C1、C2組用NYU打擊器打擊T10段脊髓，根據(jù)分組的不同高度進(jìn)行打擊，打擊后鋼針停留5 s。造模成功后分層縫合，關(guān)閉創(chuàng)口，術(shù)后將大鼠放在SPF環(huán)境中單籠飼養(yǎng)，人工按摩幫助大鼠尿便，3

25、次/d，直到排尿反射恢復(fù)，術(shù)后運(yùn)用青霉素4×104 U/(只d)，紅霉素軟膏0.2 g涂擦傷口，連用3 d，抗感染，術(shù)后必要時于腹腔注射生理鹽水5 mL以補(bǔ)充體液丟失，最大限度避免大鼠術(shù)后死亡。 造模成功的檢測標(biāo)準(zhǔn) 脊髓撞擊模型成功表現(xiàn)為大鼠全身迅速回縮樣抖動，局部脊髓表面迅速水腫、淤血，硬脊膜保持完整。1.4 行為學(xué)觀察 采用BBB評分法27、感覺功能Reuter評分法28，評分時采用雙人、雙盲法，分別于術(shù)后1，3，5，7 d同一時間點進(jìn)行，評分者為熟悉評分標(biāo)準(zhǔn)的非實驗人員，雙人獨立觀察記錄，取均值29。BBB評分滿分為21分，可分為3個部分：評價大鼠下肢各關(guān)節(jié)活動(0-7分)；評

26、價大鼠下肢步態(tài)及協(xié)調(diào)功能(8-13分)；評價大鼠下肢運(yùn)動中爪的精細(xì)動作(14-21分)。感覺功能Reuter評分法包括牽張反射、疼痛回縮反射、沿背部感覺、肌張力、肌力5個方面進(jìn)行評分。1.5 組織學(xué)觀察 每組于術(shù)后7 d行為學(xué)評分后處死，立即進(jìn)行心臟灌注取材：用7%水合氯醛5 mL/kg腹腔麻醉后，用60 mL帶有針頭的針筒經(jīng)左心室插入主動脈，切開右心耳后快速注入生理鹽水約240 mL，待右心耳流出澄清亮的液體，四肢及頭面部變白后，換用4 的 40 g/L多聚甲醛緩沖液，快速灌注約60 mL后，見四肢劇烈抽搐，再繼續(xù)緩慢注入180 mL后見頭部、軀干及四肢堅硬則表示成功。灌注結(jié)束后自背部原切口

27、進(jìn)入，鈍性分離，顯露脊髓后切取損傷處為中心長約2 cm損傷段脊髓，放入4 的40 g/L多聚甲醛緩沖液24 h后，經(jīng)濃ba圖1 兩種不同的打擊器Figure 1 Two different impactors圖注：圖a為自制打擊器；b為NYU 打擊器。ba圖2 脊髓外觀形態(tài)的變化Figure 2 Change of appearance of spinal cord圖注：圖a為打擊前后脊髓外觀形態(tài)；b為取材后脊髓外觀形態(tài)。A組為假手術(shù)組；B1，B2為自制打擊器5，10 cm組；C1，C2組為NYU打擊器1.25，2.5 cm組。ba圖3 大鼠脊髓撞擊損傷術(shù)后BBB和Reuter評分比較Figu

28、re 3 Comparisons of the Basso, Beattie and Bresnahan and Reuter scores of rats after spinal cord injury 圖注：圖a為BBB評分；b為Reuter評分。A組為假手術(shù)組；B1，B2為自制打擊器5，10 cm組；C1，C2組為NYU打擊器1.25，2.5 cm組。均值感覺Reuter評分組別組別10864202520151050均值BBB評分AB1B2C1C2AB1B2C1C2天數(shù)天數(shù)1.00 3.00 5.00 7.001.00 3.00 5.00 7.00ba圖4 尼氏染色法觀察脊髓組織形態(tài)F

29、igure 4 Morphological observation of spinal cord tissue with Nissl staining圖注：圖a示各組脊髓組織尼氏染色觀察結(jié)果(×200)：其中A組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有明顯的斑塊狀或虎斑樣尼氏體；B1、C1組輕度損傷，淤血區(qū)較小，神經(jīng)元數(shù)目減少；B2、C2組重度損傷，淤血范圍大，神經(jīng)元數(shù)目明顯減少。圖b示各組脊髓組織尼氏體染色觀察結(jié)果(×400)：A組細(xì)胞核大、核仁明顯，數(shù)量較多，胞質(zhì)內(nèi)斑塊狀尼氏體清晰；B1、C1組細(xì)胞腫大，可見軸突脫髓鞘改變，尼氏體模糊；B2、C2細(xì)胞呈空泡樣改變，尼氏體模糊或消失。A組為假手術(shù)組；B

30、1，B2為自制打擊器5，10 cm組；C1，C2組為NYU打擊器1.25，2.5 cm組。度為20%，30%蔗糖各脫水24 h后，常規(guī)冰凍切片厚度10 m后，行尼氏焦油紫染色，觀察脊髓受損情況。1.6 圖像處理和大鼠脊髓最大受損面積比、受損脊髓前后角神經(jīng)元計數(shù) 每組于術(shù)后7 d行為學(xué)評分后處死，立即進(jìn)行心臟灌注取材，切片、染色后用Leica Motic Med 6.0光鏡圖像采集分析系統(tǒng)拍照后存盤，分析對比圖片，用Motic Med 6.0 顯微圖像分析系統(tǒng)，采用手動分析法測得損傷處象素數(shù)與脊髓橫截面總象素數(shù)，從而計算出受損面積比30-31；運(yùn)用免疫組化圖像分析法對前后角尼氏體著色呈藍(lán)色斑點狀

31、的神經(jīng)元(即陽性目標(biāo))進(jìn)行半定量分析32-33。1.7 主要觀察指標(biāo) 各組術(shù)后1，3，5，7 d應(yīng)用BBB評分法和感覺功能Reuter評分法進(jìn)行行為學(xué)評分；術(shù)后7 d取材后，用尼氏染色法觀察脊髓及神經(jīng)元組織學(xué)改變，并進(jìn)行半定量分析(不同方法打擊后脊髓受損面積比及神經(jīng)元計數(shù))。1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，術(shù)后行為學(xué)評分、脊髓最大受損面積比和脊髓前后角神經(jīng)元計數(shù)，根據(jù)數(shù)據(jù)資料的特征，采用完全隨機(jī)設(shè)計的單因素方差分析，組間進(jìn)行兩兩比較。2 結(jié)果 Results 2.1 實驗動物數(shù)量分析 選用30只雌性SD大鼠，隨機(jī)分為5組，在實驗過程中，由于麻醉劑量過大和術(shù)后感染導(dǎo)致

32、2只大鼠死亡，死亡后立即選2只體質(zhì)量接近的大鼠按原來造模方法造模后補(bǔ)上。2.2 模型穩(wěn)定性 脊髓損傷模型研究眾多，包括脊髓撞擊損傷模型、脊髓缺血損傷模型、脊髓壓迫損傷模型等等，然而臨床中由于車禍撞擊或地震等重物撞擊脊柱造成的脊髓損傷更為多見，故經(jīng)典的Allens重物墜落法建立的脊髓損傷模型，其臨床相似性高。而本實驗基于經(jīng)典Allens法的基本原理進(jìn)行改良，模型更接近臨床，并與穩(wěn)定性高的NYU打擊模型進(jìn)行比較，來證實本實驗?zāi)Ｐ偷姆€(wěn)定性，結(jié)果可靠，可控制好，操作簡便，易于復(fù)制。2.3 兩種打擊器制備的脊髓損傷模型脊髓外觀形態(tài) 造模時，正常脊髓節(jié)段呈乳白色透亮條索狀，后正中溝明顯，且伴有血管走行，打

33、擊后，硬脊膜完整，硬脊膜下出現(xiàn)不同程度水腫、淤血(見圖2a)；脊髓損傷術(shù)后1周，損傷局部組織間有不同程度的粘連，不同打擊器及不同打擊高度損傷后，受損脊髓段出現(xiàn)不同程度的淤血，但硬脊膜均保持完整，B2、C2組淤血明顯(見圖2b)。2.4 急性脊髓損傷動物模型的評估 術(shù)后常見癥狀 死亡：A組1只，因麻醉劑量過大，麻醉后死亡，又隨機(jī)抽取1只體質(zhì)量相近的正常雌鼠補(bǔ)上；B2組1只，術(shù)后見雙下肢浮腫、血尿明顯，并有自噬足指、眼睛紅色變淡、體質(zhì)量明顯減輕等表現(xiàn)，于術(shù)后5 d出現(xiàn)死亡，可能與術(shù)后泌尿系統(tǒng)感染、貧血有關(guān)；無尿便：B2、C2組損傷較重，大部分術(shù)后3 d均無尿便，需行人工按摩促排便；血尿：A組及大部

34、分B1、C1輕度損傷的大鼠均無血尿，而B2、C2組損傷較重者，部分出現(xiàn)不同程度的血尿，經(jīng)抗生素治療及加強(qiáng)術(shù)后護(hù)理后，基本恢復(fù)；傷口滲血：C2組出現(xiàn)一只傷口少量滲血，經(jīng)碘伏消毒紗布包扎后，第2天未見滲血。 行為學(xué)評分 BBB評分：A組術(shù)后1 d，部分大鼠運(yùn)動功能未完全恢復(fù)，術(shù)后3 d全部恢復(fù)到21分；余各組均出現(xiàn)不同程度的運(yùn)動功能障礙，其中B2、C2組術(shù)后1 d，大鼠后肢幾乎全癱，術(shù)后3-7 d均出現(xiàn)不同程度的功能恢復(fù)(見圖3a)，B1和C1、B2和C2同一時間點BBB評分比較，差異無顯著性意義(P > 0.05)，余各組組間BBB評分比較，差異有顯著性意義(P < 0.05)(見表

35、1)，說明同一打擊器，隨著打擊高度的增加，相應(yīng)BBB評分則降低。感覺評分：A組術(shù)后1 d，全部感覺功能正常；余各組均出現(xiàn)不同程度的感覺功能障礙，其中B2、C2組術(shù)后1 d肌力、肌張力、牽張發(fā)射消失，部分大鼠可見背部感覺部分存在，疼痛回收遲鈍，而B1、C1組術(shù)后1d肌力消失，肌張力、牽張反射、疼痛回縮反射、背部感覺存在，術(shù)后3-7 d均出現(xiàn)不同程度的功能恢復(fù)(見圖3b)，B1和C1、B2和C2同一時間點感覺評分比較，差異無顯著性意義(P > 0.05)，余各組組間感覺評分比較，差異有顯著性意義(P < 0.05)，見表2。 組織學(xué)觀察 尼氏染色后，A組見脊髓灰、白質(zhì)分界清晰，呈蝴蝶狀

36、，神經(jīng)元細(xì)胞核大、核仁明顯、數(shù)量較多，神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有明顯的斑塊狀或虎斑樣尼氏體；余各組在灰質(zhì)中央或兩側(cè)均有不同程度的淤血灶，組織破壞明顯(見圖4a)。損傷處可見灰質(zhì)神經(jīng)元腫脹，細(xì)胞間質(zhì)水腫，軸突有脫髓鞘改變，部分細(xì)胞呈空泡樣改變，神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，尼氏體模糊或消失(見圖4b)。 不同方法打擊后脊髓受損面積比 用Motic Med 6.0顯微圖像分析系統(tǒng)，選則手動分析法測得損傷處像素數(shù)與脊髓橫截面總像素數(shù)，從而計算出受損面積比。A組未見明顯受損區(qū)，比值為0；B1和B2、C1和C2組隨打擊的高度的增加而升高，組間差異有顯著性意義(P < 0.05)，B1和C1、B2和C2損傷面積比差異無顯

37、著性意義(P > 0.05)，見表3。CV-B1=0.141，CV-B2=0.113， CV-C1=0.184，CV-C2=0.093，證明兩種打擊器每次打擊的結(jié)果差異較小，穩(wěn)定性較好。 不同方法打擊后脊髓前、后角神經(jīng)元計數(shù) 用Motic Med 6.0顯微圖像分析系統(tǒng)，運(yùn)用免疫組化圖像分析法對前、后角神經(jīng)元陽性目標(biāo)進(jìn)行半定量分析；A組前、后角神經(jīng)元數(shù)目最多，尼氏體明顯；B1和B2、C1和C2組隨打擊的高度的增加而減少，組間差異有顯著性意義 (P < 0.05)，B1和C1、B2和C2損傷后前、后角神經(jīng)元及尼氏體半定量分析差異無顯著性意義(P > 0.05)，見表4。3 討論

38、 Discussion脊髓損傷模型的建立是脊髓損傷臨床和基礎(chǔ)研究的前提，目前，國內(nèi)外脊髓損傷動物模型種類繁多，各有其優(yōu)缺點，但尚未有一種標(biāo)準(zhǔn)化、可靠性高、重復(fù)性好、操作簡單的脊髓損傷模型，而且動物個體間存在差異性，以至于無法實行某種客觀化、標(biāo)準(zhǔn)化損傷模型。理想的脊髓損傷模型應(yīng)當(dāng)滿足以下幾個條件，即臨床相似性高、可調(diào)控性好、實際操作簡單、重復(fù)性好，易于復(fù)制和推廣。Allens重物墜落法所建立的脊髓損傷模型，因其臨床相似性高，可控性好，易于復(fù)制而被國內(nèi)表1 各組大鼠脊髓撞擊損傷術(shù)后BBB評分比較(±s，n=6，分)Table 1 Comparisons of the Basso, Bea

39、ttie and Bresnahan scores after spinal cord injury in each rat表注：同一時間點：與A組比較，aP < 0.05；與B1組比較，bP < 0.05；與B2組比較，cP < 0.05。A組為假手術(shù)組；B1，B2為自制打擊器5，10 cm組；C1，C2組為NYU打擊器1.25，2.5 cm組。組別1 d3 d5 d7 dA組20.33±0.8221.00±0.0021.00±0.0021.00±0.00B1組3.83±0.75a5.00±0.89a7.83

40、77;0.75a10.67±0.82aB2組1.00±0.63ab1.50±0.45ab2.00±0.63ab3.17±0.75abC1組3.75±0.76ac5.00±0.84ac8.00±0.63ac10.50±0.84acC2組0.75±0.52ab1.33±0.68ab2.17±0.82ab2.67±0.75ab表2 各組大鼠脊髓撞擊損傷術(shù)后Reuter評分比較(±s，n=6，分)Table 2 Comparisons of the Reuter

41、scores after spinal cord injury in each rat表注：同一時間點：與A組比較，aP < 0.05；與B1組比較，bP < 0.05；與B2組比較，cP < 0.05。A組為假手術(shù)組；B1，B2為自制打擊器5，10 cm組；C1，C2組為NYU打擊器1.25，2.5 cm組。組別1 d3 d5 d7 dA組0.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.00B1組5.00±1.05a4.25±1.08a3.17±0.93a2.17±0.68a

42、B2組8.00±0.89ab6.75±1.08ab6.08±1.43ab4.75±1.17abC1組5.25±0.94ac4.50±1.00ac3.67±1.17ac2.50±0.77acC2組8.17±0.75ab7.25±0.76ab6.42±0.74ab5.42±1.11ab表3 不同方法打擊后各組脊髓受損面積比的比較(±s，n=6)Table 3 Comparison of the damaged area ratio of spinal cord afte

43、r striking using different approaches in each group表注：同一時間點，與A組比較，aP < 0.05；與B1組比較，bP < 0.05；與B2組比較，cP < 0.05。*本項CV > 80%。A組為假手術(shù)組；B1，B2為自制打擊器5，10 cm組；C1，C2組為NYU打擊器1.25，2.5 cm組。組別脊髓受損面積比A組0.000±0.000B1組0.078±0.011a*B2組0.382±0.043ab*C1組0.087±0.016ac*C2組0.409±0.038a

44、b*表4 不同方法打擊后各組脊髓前角、后角神經(jīng)元計數(shù)比較(±s，n=6)Table 4 Comparisons of the number of spinal cord anterior and dorsal horn neurons after striking using different approaches in each group表注：同一時間點，與A組比較，aP < 0.05；與B1組比較，bP < 0.05；與B2組比較，cP < 0.05。A組為假手術(shù)組；B1，B2為自制打擊器5，10 cm組；C1，C2組為NYU打擊器1.25，2.5 cm組。

45、組別前角神經(jīng)元計數(shù)后角神經(jīng)元計數(shù)A組865.67±251.96690.50±31.27B1組524.00±151.44a297.00±173.05aB2組139.67±74.78ab99.67±61.90abC1組516.67±188.86ac292.83±86.51acC2組133.83±83.44ab71.33±33.18ab外學(xué)者認(rèn)可及廣泛運(yùn)用，但其打擊瞬間脊髓容易偏移導(dǎo)致脊髓受力不均，硬脊膜容易破損，未能較好定量分析，同時椎板摘除時，容易損傷脊髓血管、神經(jīng)；而NYU打擊模型是目前基于經(jīng)典

46、Allens原理進(jìn)行改良最好的相對標(biāo)準(zhǔn)化的脊髓損傷模型，但因價格昂貴，未能廣泛普及，且該系統(tǒng)相對復(fù)雜，在實際操作中，對不熟練的操作者，亦頗有難度。本實驗亦基于經(jīng)典Allens原理，撞擊損傷模型更接近于臨床，并改良了Allens法打擊不準(zhǔn)及硬脊膜破裂等不足，并通過與相對標(biāo)準(zhǔn)化的NYU打擊模型造模效果進(jìn)行對比，驗證其穩(wěn)定性及可靠性，顯然這種方法是規(guī)范的；在模型建立過程中，本實驗對Allens法進(jìn)行以下幾點改良：麻醉：術(shù)前麻醉過量容易使大鼠死亡，故按體質(zhì)量換算的麻醉劑量應(yīng)先給2/3，必要時再適當(dāng)補(bǔ)注，安全性較高；椎板摘除術(shù)：摘除椎板時，可用小神經(jīng)剝離子擋開暴露的脊髓，再用小咬骨鉗進(jìn)行充分暴露，防止因

47、操作造成的損傷脊髓；小墊片：打擊前先用一小墊片貼附于暴露的脊髓表面，使撞針打擊處受力均勻，防止撞擊或移動套管時使硬脊膜破裂；精確打擊：撞擊針與引導(dǎo)的針筒套內(nèi)徑相近，能夠?qū)崿F(xiàn)精確打擊，同時針管外標(biāo)有刻度，可制備出不同損傷程度的脊髓損傷模型；時間控制：打擊后停留5 s中，可模擬臨床脊柱骨折存在的持續(xù)性擠壓作用，而且5 s損傷程度適中，病理改變與臨床相似34，又能保證造模打擊時間的一致性；暴露與固定：基于NYU固定裝置及對暴露脊髓周圍軟組織的擋開裝置原理，本實驗改良的Allens法，采用切口撐開器使目標(biāo)脊髓暴露更加清楚，避免周圍組織的遮擋作用，同時在打擊前讓助手雙手固定住脊髓損傷節(jié)段，可保證脊髓不會

48、因動物呼吸運(yùn)動及打擊瞬間抖動而導(dǎo)致打擊偏移，進(jìn)一步提高模型的穩(wěn)定性。為進(jìn)一步提高實驗的穩(wěn)定性，本實驗建立脊髓損傷模型選用體質(zhì)量相近的雌性大鼠，原因有二，一方面雌性大鼠脊椎骨硬度相對較小，容易行椎板摘除術(shù)，可防止因操作使脊髓受到額外損傷；另一方面體質(zhì)量相近的雌鼠能保證脊髓橫截面及灰質(zhì)前后角大小的一致性，可減少半定量分析所導(dǎo)致的誤差；此外，國內(nèi)自制脊髓損傷模型的打擊沖量多在20-100之間30，35，且本課題組前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，自制打擊器在5 cm和10 cm打擊高度時，術(shù)后1 d大鼠出現(xiàn)輕度和重度運(yùn)動功能障礙，用NYU打擊器在1.25 cm和2.50 cm打擊高度時，術(shù)后1 d大鼠亦出現(xiàn)輕度和重度

49、運(yùn)動功能障礙，故本實驗進(jìn)行對照試驗進(jìn)一步研究其相關(guān)性，并通過與相對標(biāo)準(zhǔn)化的NYU打擊模型造模效果進(jìn)行比較，從而來證實本實驗造模方法的穩(wěn)定性和可靠性。結(jié)果顯示，脊髓損傷后各組均出現(xiàn)不同程度的感覺、運(yùn)動功能障礙，B1、C1組損傷較輕，且其評分結(jié)果較為接近，B2、C2組損傷較重，二者評分結(jié)果亦比較接近，損傷越重，感覺及運(yùn)動功能障礙越明顯；在形態(tài)學(xué)上，尼氏體是神經(jīng)細(xì)胞特征性結(jié)構(gòu)36，當(dāng)神經(jīng)元受到損傷時，神經(jīng)胞體內(nèi)的尼氏體就會明顯減少。尼氏焦油紫法染色，能夠很好地顯示尼氏體的變化，染色穩(wěn)定，操作簡便，能較好地反映神經(jīng)元變化特點，并可對神經(jīng)元進(jìn)行半定量分析31-32，故尼氏染色結(jié)果顯示，A組前、后角神經(jīng)元

50、數(shù)目最多，尼氏體明顯；B1和B2、C1和C2組隨打擊的高度的增加而減少，尼氏體模糊或消失；B1和C1、B2和C2損傷后前、后角神經(jīng)元計數(shù)差異無顯著性意義，脊髓損傷后神經(jīng)元數(shù)目的減少，可能是原發(fā)性和繼發(fā)性損傷后，細(xì)胞壞死和凋亡的結(jié)果37-41；在脊髓損傷面積比計算中發(fā)現(xiàn)，損傷程度與該比值呈正比。行為學(xué)評分、尼氏染色形態(tài)學(xué)觀察、神經(jīng)元半定量計數(shù)分析以及脊髓損傷面積比4個方面的結(jié)果均顯示該模型的穩(wěn)定性較好，有利于模擬臨床脊髓撞擊損傷模型的研究或基礎(chǔ)研究。目前，國內(nèi)外脊髓損傷動物模型種類繁多，然而脊髓撞擊損傷模型更接近人類疾病的模式。因此，本實驗設(shè)計的改良Allens打擊模型可制備出不同損傷程度的脊髓

51、損傷模型，臨床相似性高，穩(wěn)定性較好，操作簡單，易于復(fù)制，且價格低廉，可為脊髓損傷機(jī)制研究及藥物治療提供穩(wěn)定的動物模型。致謝：感謝團(tuán)隊邵航、陳芬芬、邱友利等師兄師姐們對實驗的幫助，感謝實驗室各位老師的悉心指導(dǎo)。作者貢獻(xiàn)：實驗設(shè)計為吳楊鵬和張俐，實驗實施為吳楊鵬和范筱，實驗評估為吳楊鵬和張俐，資料收集為吳楊鵬和范筱。吳楊鵬成文，張俐審校。利益沖突：所有作者共同認(rèn)可文章內(nèi)容不涉及相關(guān)利益沖突。倫理問題：實驗過程中對動物的處置符合2009年Ethical issues in animal experimentation相關(guān)動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的條例。文章查重：文章出版前已經(jīng)過CNKI反剽竊文獻(xiàn)檢測系統(tǒng)進(jìn)行3

52、次查重。文章外審：文章經(jīng)國內(nèi)小同行外審專家雙盲外審，符合本刊發(fā)稿宗旨。作者聲明：第一作者吳楊鵬對于研究和撰寫的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)責(zé)任。論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)(包括計算機(jī)數(shù)據(jù)庫)記錄及樣本已按照有關(guān)規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。4 參考文獻(xiàn) References1 Iwamoto S, Higashi A, Ueno T, et al. Protective effect of sivelestat sodium hydrate (ONO-5046) on ischemic spinal cord injury. Int

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