質(zhì)粒DNA的提取、純化與鑒定

1、分子生物學(xué)實驗報告題目：質(zhì)粒DNA的提取、純化與鑒定姓名：學(xué)號： 班級： 時間：一、實驗?zāi)康模?. 學(xué)習(xí)并掌握凝膠電泳進行 DNA的分離純化的實驗原理。2. 學(xué)習(xí)并掌握凝膠的制備及電泳方法。3. 學(xué)習(xí)并掌握凝膠中DNA的分離純化方法。4. 掌握堿變性提取發(fā)的原理及各種試劑的作用。5. 掌握堿變性法提取質(zhì)粒DNA的方法。二、實驗原理：1. 質(zhì)粒DNA的提取一一堿變性提取法：提取和純化質(zhì)粒DNA勺方法很多，目前常用的有：堿變性提取法、煮沸 法、羥基磷灰石柱層析法、EB-氯化銫密度梯度離心法和 Wizard法等。其中， 堿變性提取法最為經(jīng)典和常用，適于不同量質(zhì)粒 DNA勺提取。該方法操作簡 單，易于

2、操作，一般實驗室均可進行。提取質(zhì)粒 DNA純度高，可直接用于酶 切、序列測定及分析。EB-氯化銫密度梯度離心法，主要適合于相對分子質(zhì) 量與染色體DNA相近的質(zhì)粒，具有純度高、步驟少、方法穩(wěn)定，且得到的質(zhì) 粒DNA多為超螺旋構(gòu)型等優(yōu)點，但提取成本高，需要超速離心設(shè)備。少量提 取質(zhì)粒DNA還可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的質(zhì)粒DNA中常含 有RNA但不影響限制性核酸內(nèi)切酶的消化、亞克隆及連接反應(yīng)等。堿變性法提取質(zhì)粒DNA-般包括三個基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞以擴增質(zhì) 粒；收集和裂解細(xì)胞；分離和純化質(zhì)粒 DNA。在細(xì)菌細(xì)胞中，染色體 DNA以雙螺旋結(jié)構(gòu)存在，質(zhì)粒 DNA以共價閉合環(huán) 狀形式

3、存在。細(xì)胞破碎后，染色體 DNA和質(zhì)粒DNA均被釋放出來，但兩者變 性與復(fù)性所依賴的溶液pH值不同。在pH值高達12.0的堿性溶液中，染色 體DNA氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性；共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵斷裂，但兩條互補鏈不完全分離。當(dāng)用 pH值4.6的KAc(或NaAc)高鹽 溶液調(diào)節(jié)堿性溶液至中性時，變性的質(zhì)粒DNA可恢復(fù)原來的共價閉合環(huán)狀超 螺旋結(jié)構(gòu)而溶解于溶液中；但染色體 DNA不能復(fù)性，而是與不穩(wěn)定的大分子 RNA蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起形成纏連的、可見的白色絮狀沉淀。這種沉 淀通過離心，與復(fù)性的溶于溶液的質(zhì)粒 DNA分離。溶于上清的質(zhì)粒 DNA可 用無水乙醇和鹽溶液，減

4、少 DNA分子之間的同性電荷相斥力，使之凝聚而形 成沉淀。由于DNA與 RNA生質(zhì)類似，乙醇沉淀DNA勺同時，也伴隨著RNA沉 淀，可利用RNase A將 RNA降解。質(zhì)粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶 性蛋白，可通過酚 / 氯仿抽提除去，最后獲得純度較高的質(zhì)粒 DNA。2. 凝膠電泳進行DNA分離純化：電泳(electrophoresis) 是帶電物質(zhì)在電場中向著與其電荷相反的電極 方向移動的現(xiàn)象。各種生物大分子在一定 pH 條件下，可以解離成帶電荷的 離子，在電場中會向相反的電極移動。凝膠是支持電泳介質(zhì)，它具有分子篩 效應(yīng)。含有電解液的凝膠在電場中，其中的電離子會發(fā)生移動，移動的

5、速度 可因電離子的大小形態(tài)及電荷量的不同而有差異。利用移動速度差異，就可 以區(qū)別各種大小不同的分子。因而，凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化 DNA 片段，是分子生物學(xué)的核心技術(shù)之一。凝膠電泳技術(shù)操作簡單而迅速，分辨率高，分辨范圍廣。此外，凝膠中DNA的位置可以用低濃度熒光插入染料如溴化乙錠 (ethidium bromide , EB) 或SYBR Gold染色直接觀察到，甚至含量少至 20pg的雙鏈DNA在紫外激發(fā) 下也能直接檢測到。需要的話，這些分離的 DNA條帶可以從凝膠中回收，用 于各種各樣目的的實驗。分子生物學(xué)中，常用的兩種凝膠為瓊脂糖 (agarose) 和聚丙烯酰胺凝膠。 這兩種凝

6、膠能灌制成各種形狀、大小和孔徑，也能以許多不同的構(gòu)型和方位 進行電泳。聚丙烯酰胺凝膠分辨率高，使用于較小分子核酸(5 500bp)的分離和蛋白質(zhì)電泳。它的分辨率非常高，長度上相差 1bp 或質(zhì)量上相差 0.1% 的DNA都可以彼此分離，這也是采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行 DNA序列分析 的分子基礎(chǔ)。雖然它能很快地進行電泳，并能容納較大的DNA1樣量，但是與瓊脂糖凝膠相比，在制備和操作上繁瑣。瓊脂糖是從海藻中提取的長鏈狀 多聚物，由B -D-吡喃半乳糖與3,6-脫水-L-吡喃半乳糖組成，相對分子質(zhì) 量為104-105。瓊脂糖加熱至90C左右，即可溶化形成清亮、透明的液體， 澆在模版上冷卻后形成凝膠

7、，其凝固點為40-45 C。瓊脂糖凝膠相對于聚丙烯酰胺凝膠分辨率低，但它的分離范圍更大(50 至百萬 bp) ，小片段DNA(50-20000bp)最適合在恒定輕度和方向的電場中水平方向的瓊脂糖凝膠 內(nèi)電泳分離。瓊脂糖凝膠電泳易于操作，適用于核酸電泳，測定DNA勺相對分子質(zhì)量，分離經(jīng)限制酶水解的 DNA片段，進一步純化DNA等。瓊脂糖凝膠電泳是一種常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而帶 有負(fù)電荷，在電場中向正極移動。DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳遷移率主要取 決于6個因素：樣品DNA分子的大小、DNA分子的構(gòu)象、瓊脂糖濃度、電泳 所用電場、緩沖液和溫度。三、主要儀器和材料試劑：1. 儀器和材料

8、：恒溫振蕩培養(yǎng)箱，高速冷凍離心機，旋渦振蕩器，水浴鍋，1.5mL離心管， 50mL離心管，不同型號的吸頭，微量移液器，微波爐，電泳儀，制膠槽， 電泳槽，梳子，錐形瓶，電子天平，手套，紫外燈， Eppendorf 管等。 菌體：E.coli DH5a受體菌，具有Amp標(biāo)記的質(zhì)粒pUC192. 實驗試劑：LB培養(yǎng)基，抗生素(氨芐青霉素)，溶液I,溶液U,溶液川，RNase A 母液，TE緩沖液，飽和酚，氯仿/異戊醇混合液，酚/氯仿/異戊醇(PCI) 混合液，預(yù)冷無水乙醇，TAE電泳緩沖液(10X)，上樣緩沖液(6X)， 瓊脂糖，溴化乙錠(EB),DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物 DNAMarker入/Hi

9、nd IH， 5mol/L pH 5.2 的醋酸鈉。四、實驗步驟：1. 菌體培養(yǎng)：(1) 配制 40mL 液體 LB 培養(yǎng)基(加入 5%葡萄糖)、 100mL 固體 LB培養(yǎng)基、并準(zhǔn)備足量的移液管、200卩l(xiāng)微量移液器頭、1000卩l(xiāng)微量移液器頭、50mL離心管、1.5mL離心管，滅菌備用。(2) 向液體LB培養(yǎng)基移取32卩l(xiāng)氨芐青霉素，混合均勻。(3) 將提前活化的E.coli DH5a受體菌，接種于液體LB培養(yǎng)基中。將錐形瓶放入恒溫震蕩培養(yǎng)箱中，37°C, 200r/min培養(yǎng)12-16h2. 質(zhì)粒DNA勺提?。?1) 稱量50mL離心管重量 W1取30mL菌液于已稱重的 50m

10、L離心 管中，配平后 6000r/min離心5min。(2) 棄上清，向離心管中加入5mL溶液I,渦旋振蕩， 6000r/min 離心5min。(3) 棄上清并稱重 W，求 W=WW。(4) 按照1.0mL/100mg菌體的量加入溶液I,充分渦旋振蕩，冰浴5min，再按照2.0mL/100mg菌體的量加入溶液U,溫和顛倒混勻，冰浴2min，然后再按照1.5mL/100mg菌體的量加入溶液川，溫和顛倒混勻，冰浴10min，平衡后12000r/min離心15min。(5) 取上清至新50mL離心管內(nèi)，記錄體積，加入兩倍體積的冰乙醇，混勻后在-20 C環(huán)境下保存 30min。取出后12000r/mi

11、n離 心15min，棄上清，加入5mL703乙醇，12000r/min 離心5min， 棄上清，加入 5mL70匯醇，12000r/min 離心5min，棄上清， 37 C放置 5-10min。(6) 取出離心管，加入ImLTE溶液得到粗提物，加入RNase A 液,使溶液濃度為 150卩g/mL , 37 C保存60-120min。3. 質(zhì)粒DNA勺純化：(1) 取500卩l(xiāng)粗提物于1.5mL離心管中，加入等體積的Tris飽和酚， 混勻，12000r/min 離心 10min。(2) 轉(zhuǎn)移上清(體積V)至新管，加入等V1的酚：氯仿：異戊醇溶液， 混勻，12000r/min 離心 5min。(

12、3) 轉(zhuǎn)移上清(體積V0至新管，加入等 V2的氯仿：異戊醇溶液，混 勻，12000r/min 離心 5min。1(4) 轉(zhuǎn)移上清(體積V3)至新管，加入10V3的3MNaAc溶液(pH5.2), 再加入2V4 (屯+診)的冰乙醇，混勻，-20 C保存30-60min ,取出后 12000r/min 離心 15min。(5) 棄上清，加入 500卩l(xiāng) 70%乙醇，10000r/min 離心2min,再加入 500 卩 l 70% 乙醇，10000r/min 離心 2min, 37C保存 5-10min。(6) 取出離心管，向一只離心管中加入 25卩l(xiāng)TE溶液，溶解沉淀后， 轉(zhuǎn)移入另一只離心管中，

13、再取25卩l(xiāng) TE溶液加入第一只離心管中， 溶解后再移入另一只離心管中，得到 50卩l(xiāng)純化質(zhì)粒DNA4. DNA純度檢測：(1) 取40mLTA(1X)于300mL錐形瓶中，加入0.4g瓊脂糖，放入微 波爐內(nèi)使其熔化，60C時倒入準(zhǔn)備好的制膠槽中。(2) 取5.0卩l(xiāng)純化DNA加入1.0卩l(xiāng)上樣緩沖液，混合，進行點樣。(3) 點樣完畢后，100V, 200mA條件下電泳 30min。(4) 電泳完畢后，進行EB染色，用凝膠成像儀拍照，得到實驗結(jié) 果。五、實驗結(jié)果：凝膠成像儀拍照如下:圖1 DNA純度檢測凝膠成像結(jié)果 (1號泳道：DNA marker入/Hind川；2號泳道：超螺旋 狀態(tài)的pUC

14、19質(zhì)粒DNA 3號泳道：線性的 pUC19質(zhì)粒DNA 4號泳道：空泳道；5至9泳 道：7至11組pUC19質(zhì)粒DNA羊品；10號泳道：入DNA本組點樣在第9泳道，照片顯示各種雜質(zhì)去除得較為徹底，得到了較高 純度的超螺旋狀態(tài)的pUC19質(zhì)粒DNA六、討論：1. 為獲得高純度的質(zhì)粒DNA必須徹底去除雜蛋白、染色體 DNA和RNA在整個質(zhì)粒提取過程中出去染色體 DNA的關(guān)鍵步驟是加入溶液U、溶液川 的變性和復(fù)性環(huán)節(jié)，應(yīng)控制好變性和復(fù)性的時機。加入溶液I時，可劇 烈震蕩，使菌體沉淀轉(zhuǎn)變成均勻的菌懸液，此時細(xì)胞尚未破裂，染色體 不會斷裂；加入溶液U時，菌液變粘稠、透明，無菌塊殘留；加入溶液 川時，會立

15、即出現(xiàn)白色沉淀。加入溶液U和溶液川后，應(yīng)緩慢上下顛倒 離心管數(shù)次，切忌在旋渦振蕩器上劇烈振蕩，否則染色體DNA會斷裂成小片段，不形成沉淀，而溶解在溶液中，與質(zhì)粒DNA混合在一起，不利于質(zhì)粒DNAS純。因此，操作時一定要緩慢柔和，采用上下顛倒的方法， 既要使試劑與染色體DNA充分作用，又不破壞染色體的結(jié)構(gòu)。2. 酚具有腐蝕性，能損傷皮膚和衣物，使用時應(yīng)小心。皮膚如不小心沾到 酚，應(yīng)立即用堿性溶液、肥皂或大量清水沖洗。3. 為最大限度去除上清，可在倒掉部分上清后，再將離心管放入離心機稍 作離心，使殘留在管壁的液體集中到離心管底部， 再用移液器移除液體。4. 注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)?/p>

16、品槽底部的凝膠刺穿。也 不要快速按出吸頭內(nèi)的樣品，避免擠出的空氣將樣品沖出樣品孔。5. 本次實驗中，原應(yīng)滅菌之前加入培養(yǎng)基內(nèi)的葡萄糖由于操作疏忽而忘記 加入，隨后按照老師指示配制100mL10%勺葡萄糖溶液一起滅菌，待滅菌 后再將葡萄糖溶液加入培養(yǎng)基中。6. 培養(yǎng)菌體所用勺 14 個錐形瓶有 2個錐形瓶中沒有菌體生長跡象， 另外有2 個錐形瓶內(nèi)菌體生長較少。 原因可能是接種時操作失誤， 例如可能是接 種環(huán)挑取菌種后離酒精燈火焰太近或者挑取菌種前沒有充分冷卻，也有 可能是接種時接入勺菌量過少等。7. 在純化DNA加入冰乙醇的步驟中，2只離心管在加入的DNA羊品量相同的情況下，出現(xiàn)了從-20 C環(huán)

17、境下取出后2只離心管內(nèi)液體體積相差較多的 情況，分析后發(fā)現(xiàn)量較少的 1 只離心管內(nèi)加入的各種試劑的量是合適的。 可能的原因：在用移液器移取冰乙醇時下按力度太大，吸入過多液體；2 只離心管分別由 2 名組員加液，操作上可能出現(xiàn)個人之間的誤差。8. 本次實驗得到的質(zhì)粒DNA較少，最主要原因是選擇了菌體生長較少的培養(yǎng)基，僅得到較少的粗提物，導(dǎo)致最終純化得到的質(zhì)粒DNA也較少。七、附注：培養(yǎng)基及實驗試劑配方：1. LB(Luria Broth )培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基：1%蛋白胨(typtone )，0.5%酵母粉(yeast extract )， 1%NaC。用 NaOH調(diào) pH至 7.2, 121

18、°C滅菌 20min備用。LB固體培養(yǎng)基：除以上LB培養(yǎng)基成分外，還需要添加1.5%2嘛脂， 121C滅菌20min備用。LB半固體培養(yǎng)基：在 LB液體培養(yǎng)基中加入 0.75%瓊脂，121 C滅菌 20min 備用。2. 氨芐青霉素：母液濃度為100卩g/卩l(xiāng)，工作濃度為50100卩g/mL。3. TE緩沖液：10mmol/L Tris-HCI(pH 8.0)，1mmol/L EDTA4. 氯仿/異戊醇混合液：按氯仿：異戊醇為24： 1 (V/V)的比例在氯仿中加 入異戊醇。5. 酚/氯仿/異戊醇(PCI)混合液：飽和酚：分析純的酚溶化后經(jīng)160C重蒸后，加入0.1% (V/V)的抗氧化 8-羥基喹啉，再加入等體積的 0.1mol/L Tris-HCl(pH 8.0) 緩沖液反復(fù)抽 提，使之飽和，并使其pH為8.0，亦可購買商品化的飽和酚。按酚與氯仿 / 異戊醇為 1： 1 的比例混合飽和酚與氯仿 /異戊醇混合液，即 得酚/ 氯仿/ 異戊醇( PCI) (25:24:1 )混合液。6. 6X上樣緩沖液：30%t油，0.25%溴酚藍(bromophenol blue, BPB , 0.25% 二甲苯氰 FF。7. 溶液I: 50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris-HCI(pH8.