食品微生物檢驗大腸桿菌全部

1、.第三章 大腸菌群測定 一、大腸菌群檢驗(一)檢驗方法(二)培養(yǎng)基 (三)檢驗時應注意事二、大腸菌群的衛(wèi)生學意義 大腸菌群是評價食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標之一，目前已被國內(nèi)外廣泛應用于食品衛(wèi)生工作中。該菌群主要來源于人及溫血動物糞便，一般多用來作為食品中的糞便污染指標。過去我國在大腸菌群的檢驗方面經(jīng)驗不多，對該菌群的認識也不夠充分。1974年全國修訂食品衛(wèi)生細菌檢驗方法座談會和1976年全國食品衛(wèi)生標準會議建議以大腸菌群作為糞便污染指標菌，并提出進行有關大腸菌群方面的科研工作。為此，我們成立了大腸菌群科研協(xié)作組，對犬腸菌群的檢驗方法(包括快速檢驗方法)及其衛(wèi)生學意義進行了廣泛的科學研究和實踐，取得

2、了一定成績，為制訂大腸菌群檢驗方法提供了科學依據(jù)。 在這次修訂l976年版食品衛(wèi)生檢驗方法的過程中，大腸菌群科研協(xié)作組又于19831985年對大腸菌群檢驗方法進行了實驗研究，并作了對比觀察，同時對國內(nèi)常用的大腸菌群快速檢測方法也進行了研討，為這次修訂國家標準食品衛(wèi)生檢驗方法微生物學部分中的大腸菌群測定提供了科學依據(jù)。 大腸菌群不是細菌學上的分類命名，而是根據(jù)衛(wèi)生學方面的要求，提出來的一組與糞便污染有關的細菌，這些細菌在生化及血清學方面并非完全一致。其定義為：系指一群需氧及兼性厭氧、在37能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。有些科學工作者又用靛基質(zhì)、甲基紅、VP、檸檬酸鹽、硫化氫、明膠、動

3、力和445乳糖分解等試驗，將這群細菌再分為大腸艾希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。不論分法如何，對大腸菌群的判定，均應以上述定義為基礎。一、大腸茵群檢驗(一)檢驗方法 1乳糖發(fā)酵試驗。以無菌操作采取樣品，采取量及稀釋倍數(shù)，依據(jù)國家或當?shù)匦l(wèi)生標準要求及樣品污染情況而定。將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在l m J以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，lm1及1mI以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種3管，置36±l溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2小時，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性；如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進行。 2分離培養(yǎng)。將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分

4、別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍瓊脂平板上，置36±l溫箱內(nèi)，培養(yǎng)1824小時，然后取出，觀察菌落形態(tài)，并作革蘭氏染色和證實試驗。 3證實試驗。在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落l2個進行革蘭氏染色，同時圖3-I大腸菌群檢驗程序 (=)培養(yǎng)基 1乳糖膽鹽發(fā)酵培基成分：蛋白胨 豬膽鹽(或牛，羊膽鹽) 乳糖、004溴甲酚紫水溶液 蒸餾水pH74制法：將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶于水中，并放入一個小倒管，高壓滅菌11515分鐘。20g5g 1 Og25m11 000m1校正pH，加入指示劑，分裝每管l 0ml，附注：雙料乳糖膽鹽發(fā)酵培基除蒸餾水外，其他成分加倍。用途：乳糖發(fā)酵試驗用。原理：細菌分解糖類是依靠細菌

5、細胞所產(chǎn)生的各種酶類的作用，細菌產(chǎn)生的分解糖接種乳糖發(fā)酵管，置36±1溫箱內(nèi)培養(yǎng)24±2小時，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣，革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌，即可報告為大腸菌群陽性。 4報告。根據(jù)證實為大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN檢索表，報告每l 00ml(g)大腸菌群的最可能數(shù)。 5檢驗程序。見圖3-1類的酶，隨細菌種類不同而異，可以此來鑒別細菌。 乳糖是雙糖，細菌分解雙糖的酶大多是胞外酶。乳糖被乳糖酶水解成葡萄糖和半乳糖，葡萄糖可直接被細菌利用，而半乳糖則需在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為葡萄糖后再被利用。 糖發(fā)酵試驗主要是測定細菌分解糖類以后所產(chǎn)生的酸，以培基pH降低(指示劑變色)作為觀察結

6、果的指標。 大腸桿菌等細菌在酸性環(huán)境中，由于甲酸脫氫酶的作用，可使甲酸分解成CO2和H2，在培基中產(chǎn)生大量氣體，進入倒管中，以便觀察。 注：常用于供發(fā)酵試驗的各種糖類、醇類和糖苷類(見表3-1)· 2伊紅美藍瓊脂培基成分：蛋白胨10g 乳糖 10g磷酸氫二鉀 2g瓊脂 17g 2伊紅Y溶液 20ml 065美藍溶液 10ml 蒸餾水 1000ml pH7.1 制法：將蛋l(fā)白胨、磷酸鹽和瓊脂溶解于蒸餾水中，校正pH，分裝于燒瓶內(nèi)，高壓滅菌12115分鐘備用。臨用時加入乳糖，并加熱溶化瓊脂，冷至50一55，加入伊紅和美藍溶液，搖勻，傾注平板。 原理：大腸菌群細菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，使伊紅與美藍

7、結合而成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，有時還可產(chǎn)生金屬光澤。黑色程度與光澤產(chǎn)生情況與伊紅、美藍二者比倒有關。不發(fā)酵乳糖的細菌(如沙門氏菌、志賀氏菌)則為無色菌落。 3乳糖發(fā)酵培基 成分：蛋白胨 20g 乳糖 10g O04溴甲酚紫水溶液 25ml 蒸餾水 1000mlpH74 制法：將蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示劑，按檢驗要求分裝30ml、10ml或3ml，并放入一個小倒管，高壓滅菌11515分鐘。 附注： (1)雙料乳糖發(fā)酵管除蒸餾水外，其他成分加倍。 (2)30ml和10ml乳糖發(fā)酵管專供醬油及醬類檢驗用3ml乳糖發(fā)酵管供大腸菌群證實試驗用。 4蛋白胨水 成分：蛋白胨(或胰蛋白胨

8、) 20g 氯化鈉 5g 蒸餾水 1 000ml pH74表3-1 供發(fā)酵試驗用的糖類、醇類和糖苷類化學上的分類名稱戍糖(C5H10O5)已糖(C6H12O6)雙糖類(C12H22O11)蘭糖類(C6H10O5)3多糖類(C6H10O5)x阿拉伯糖arabinoSe木糖 xylose鼠李糖 rhamnose葡萄糖glucose dextrose果糖 fructose,levulose甘露糖 mannose半乳糖galactose麥芽糖 moltose乳糖lactose蔗糖sucrose草搪 trehalose纖維二糖 cellobiose木蜜糖 melibiose棉子糖 raffinose落葉

9、松糖 melizitose菊糖inulin淀粉starch肝糖glucogen 糊精 dextrin（一）供發(fā)酵試驗用的各種糖類(二)供發(fā)酵試驗的各種醇類和糖苷類化學上的分類名稱三元醇C3H5(0H)3四元醇C4H6(0H)4五元醇類C5H7(OH)6六元醇類C6H8(OH)8環(huán)己六醇(CHOH)6糖苷類甘油 glycerol赤絲藻醇erythritol側金盞花醇 adonitol阿拉伯膠醇 arabitol甘露醇 mannitol衛(wèi)矛醇 dulcitol山梨醇 sorbitol肌醇 inositol水楊苷 salicin七葉苷 aesculin松柏苷 coniferlin 制法：按上述成分配

10、制，分裝小試管，高壓滅菌12l15分鐘 附注：蛋白胨內(nèi)應含有豐富的色氨酸。每批蛋白胨買來后，應先用已知菌種鑒定后方可使用。（玫瑰吲哚)圖3-2靛基質(zhì)的產(chǎn)生及呈色的機理圖 原理：細菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基質(zhì)，與對二甲氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲跺而呈紅色(見圖3-2)。 (三)檢驗時應注意事項 1檢驗步序。大腸菌群的檢驗步序采用三步法(乳糖發(fā)酵試驗、分離培養(yǎng)和證實試驗)。第一步乳糖發(fā)酵試驗是樣品的發(fā)酵結果，不是純菌的發(fā)酵試驗，所以初發(fā)酵陽性管，經(jīng)過平板分離和證實試驗后，有時可能成為陰性。大量檢驗數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗步序的符合率，初發(fā)酵與證實試驗相差較大，不同食品三步序的符合情況也

11、不一致(見表3-2)，所以在大腸菌群檢驗步序方面，應結合食品類別、污染情況以及樣品中菌相的差異分別予以考慮。在食品檢驗上，除個別情況外，一般來說，如果平板上有較多典型大腸菌群菌落，革蘭氏染色為陰性桿菌，即可做出判定。如平板上典型菌落甚少或均不夠典型，則應多挑菌落做證實試驗，以免出現(xiàn)假陰性。只做一步初發(fā)酵，對表3-2檢驗步序與檢出率的關系種樣品名稱檢出陽性率（B/A）*100%（C/B）*100%類初發(fā)酵 (A)平板分離 (B)復發(fā)酵 (C)（C/A）*100%食品羊肉熟肉灌腸生牛奶甜煉乳奶粉醋醬油冰棍雪糕冰磚汽水炊具(碗) 483 298 540 450 163 77118 3l3 743 1

12、2 109 483 218 540 439 140 74 41 265 493 12 109 483 215 539 439 100 74 38258460 12 109 lOO 73.2 100 97.16 85.9 96.1 34.7 84.7 66.4 100 100 100 72.1 99.8 97.6 61.3 96.1 32.2 82.4 61.9 100 100 100 98.8 99.8 100 71.4 100 92.7 97.4 93.3 lOO100合計3306 2814 2727 85 825 96.9某些食品來說，誤差是比較大的。這樣做，會有相當部分的合格樣品被作為不

13、合格樣品處理應予注意。 2抑菌劑。大腸菌群檢驗中經(jīng)常使用的抑菌劑有膽鹽洗衣粉、十二烷基硫酸鈉煌綠、龍膽紫，孔雀綠等。抑菌劑雖可抑制樣品中的一些雜菌，而有利于大腸菌群的生長和挑選，但對大腸菌群中的某些菌株有時也產(chǎn)生一些抑制作用。有些抑菌劑用量甚微，稱量時稍有差誤，即可對抑菌作用產(chǎn)生影響；有的抑菌劑當牌號、規(guī)格改變時，也可影響抑菌效果，而需重新測定抑菌的有效劑量。這些情況均給抑菌劑的使用帶來不利條件我們曾對膽鹽等三種抑菌劑進行大腸菌群檢驗效果的觀察(見表33)。目前我國在食注:(一)表示不加抑菌劑：()內(nèi)數(shù)字系品大腸菌群檢驗方面采用膽鹽作為抑菌劑，豬、牛、羊三種膽鹽對大腸菌群的檢驗效果，經(jīng)實驗觀察

14、無何明顯差異，可相互替代。但其他膽鹽的檢驗效果則不一致(見表34)，故不宜相互替代。目前由于膽鹽不易購買，有的實驗室以3號膽鹽、混合膽鹽、去氧膽酸鈉或兔膽鹽等代替豬膽鹽加入培基中，這會影響大腸菌群酶檢驗結果，應予注意。在膽鹽用量上，實驗表明1、O.5和0.25%三個劑量無何差異。所以目前乳糖發(fā)酵管采用的膽鹽劑量(05)是適宜的，在稱量時稍有差誤，亦不致影響大腸菌群的檢出。注：分母表示接種株教，分予表示產(chǎn)氣株數(shù)3挑選菌落。大腸菌群是一群腸道桿菌的總稱，大腸菌群菌落的色澤、形態(tài)等方面較大腸桿菌更為復雜和多樣，而且與大腸菌群的檢出率密切相關。所以在實際工作中。表36 茵落形態(tài)與檢出率的關系注：（ ）

15、內(nèi)數(shù)字系%為了提高大腸菌群的檢出率，應當熟習大腸菌群的菌落色澤和形態(tài)。在檢驗方法中我們選用伊紅美藍平板為分離培基，在該平板上，大腸菌群菌落呈黑紫色有光澤或無光澤，檢出率最高；紅色、粉色菌落檢出率較低。菌落形態(tài)的其他方面(如菌落大小、光滑與粗糙、邊緣完整情況、隆起情況、濕潤與干燥等)雖亦應注意，但不如色澤方面更為重要(見表35、36)。另外，挑取菌落數(shù)與大腸菌群的檢出率有密切關系，在實際工作中，由于工作量較大，通常只挑取一個菌落，但影響大腸菌群檢出率的因素較多，如食品種類、菌落色澤和形態(tài)、細菌種類等，所以只挑一個菌落，由于機率問題，很難避免假陰性的出現(xiàn)，尤其當菌落呈不典型時(見表3一7)。所以挑

16、菌落一定要挑取典型菌落，如無典型菌落則應多挑幾個，以免出現(xiàn)假陰性。4產(chǎn)氣量。在糖發(fā)酵試驗工作中，經(jīng)常可以看到在發(fā)酵倒管內(nèi)存有極微小韻氣泡(有時比小米粒還小)，類似這樣的情況能否算作產(chǎn)氣陽性呢"這是許多食品檢驗工作者經(jīng)常遇到的問題。大腸菌群協(xié)作組在這方面進行了實驗觀察。結果表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生小于米粒的氣泡。一般來說，產(chǎn)氣量與大腸浦群檢出率呈正相關，但隨樣品種類而有不同，有小于米粒的氣泡，亦可有陽性檢出。另外，對未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)醇管是否均應作陰性處理，根據(jù)大量工作實踐來看，對這種情譬況應予慎重考慮。在日常工作中，經(jīng)?？梢杂龅皆诔醢l(fā)酵時產(chǎn)酸無氣，但復發(fā)酵卻證實為大腸菌群陽性。有時倒管內(nèi)雖無氣體，但在液面及管壁卻可以看到緩緩上浮的小氣泡。所以對未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵管如有疑問時，可以用手輕輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應作進一步觀察這種情況的陽性檢出率可達半數(shù)以上(見表38)。5MPN檢索表。最可