噬菌蛭弧菌分子生物學特性的研究

1、噬菌蛭弧菌分子生物學特性的研究中國醫(yī)學細菌中心弧菌噬菌體研究室 秦生巨一、前言噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus,以下簡稱蛭弧菌)是60年代中期Stolp 等1發(fā)現的一類細菌寄生菌。它比通常的細菌要小，有似細菌病毒（噬菌體）的作用，但不是病毒，具有細菌的特性。“寄生”和“裂解（溶菌）”宿主細菌是蛭弧菌獨特的生物學特性。這一生物學特性引起了人們極大的興趣和關注。20多年來，美國、蘇聯、日本、法國、以色列、印度等30多個國家和地區(qū)的許多實驗室對這類菌進行了研究。1982年，秦生巨等在我國首次發(fā)現并及時報道了對蛭弧菌的研究。自從蛭弧菌發(fā)現以來，國內外許多研究人員對蛭弧菌

2、的生物學、生態(tài)學、生理學、分類學、生物化學、分子生物學及其與生物間的拮抗作用進行了研究。特別是70年代后期，對蛭弧菌分子生物學方面的研究更為廣泛和細致，發(fā)現蛭弧菌在分子生物學方面亦具有許多獨特的特性：蛭弧菌不能利用碳水化合物，但分解蛋白質的能力極強，它是利用多肽及氨基酸作為能源和碳源的；蛭弧菌生長代謝過程中乙醛酸循環(huán)不明顯，以不完全的三羧酸循環(huán)為主要代謝途徑；蛭弧菌蛋白質含量極為豐富，可達干重的60%65%，DNA含量為5%，含有典型的嘌呤和嘧啶；蛭弧菌DNA合成的前體物質，全部來自宿主菌細胞，大約70%來源于宿主DNA，30%來源于RNA；蛭弧菌可直接利用單核苷酸作前體物質，合成其核酸；蛭弧

3、菌ATP（每消耗1g ATP所得細胞千重）值高達20%30%；蛭弧菌在吸附、侵染、穿入等的整個生命周期中，需要多種酶類的參加；蛭弧菌的鞭毛，粗且?guī)?，早期有人認為，鞭毛鞘是由細胞壁外膜組成，對尿素十分敏感。近年來，許多實驗室對蛭弧菌的噬菌特性以及利用蛭弧菌清除自然環(huán)境河水中的某些腸道致病菌方面，做了許多卓有成效的探索工作。目前已證實，蛭弧菌對沙門菌屬、志賀菌屬、埃希菌屬、假單胞菌屬、歐文菌屬、變形桿菌屬、弧菌屬等均有很高的裂解活性，特別是對沙門菌屬和志賀菌屬。進一步研究發(fā)現，蛭弧菌對自然河水中的ElTor霍亂弧菌、不凝集弧菌、傷寒沙門菌、大腸桿菌、細菌總數、浮游球衣菌、大腸菌群等均有顯著的凈化

4、作用。本文就蛭弧菌的形態(tài)結構、化學組分、能量代謝、生命周期以及蛭弧菌生物拮抗作用等方面的研究闡述如下。二、 蛭弧菌的形態(tài)（一）一般形態(tài) 蛭弧菌革蘭染色，于普通光學顯微鏡下呈陰性弧、桿菌。相差顯微鏡下，可見到蛭弧菌積極追捕宿主呈跳躍式的運動。電子顯微鏡觀察、蛭弧菌以弧、桿狀為主（圖1）。其菌體長約為0.81.2m,寬約為0.250.40m。菌體一端附著一根端生鞭毛，極少數有23根。蛭弧菌的鞭毛比其它細菌鞭毛為粗，直徑約為2128nm，長一般為菌體的1040倍，通常呈波狀?？拷w的最初3個“波段”的“波長”遞減，遠端“波段”的“波長”相當穩(wěn)定。這種結構與其侵襲功能直接相關，并被認為是蛭弧菌的又一

5、特征。Shilo等發(fā)現，與蛭弧菌鞭毛相對的菌體另一端（頭部）有釘狀的纖毛結構存在，通常23根，最多可有6根，纖毛直徑為4.510nm，長為0.81.5m，呈直線形或三角彎曲狀。圖（1）蛭弧菌Bd39電鏡照片蛭弧菌的形狀結構，不同菌株各有差異。而且培養(yǎng)基的選擇及培養(yǎng)條件許多因素均可影響蛭弧菌形態(tài)特征的發(fā)育。（二）超微結構 蛭弧菌細胞壁通常有內外兩層組成，內層覆于細胞膜，其上有數個分散的顆粒，直徑約為610 nm。蛭弧菌胞漿中?？捎^察到致密小體，長約150300nm，寬約70120nm，呈片狀結構，據推測這可能是細胞膜內陷而形成的。核區(qū)非常明顯，周圍包繞著數個核糖體顆粒。在蛭弧菌的菌體中還可見到間

6、體及其他許多內含物，有人認為間體的存在與蛭弧菌附著宿主有關。當蛭弧菌在深紅紅螺菌中生長發(fā)育時，常見形成異形結構的“孢囊體”，長約為1.2µm，寬約為0.6µm，孢囊體外壁和內膜都很厚，外壁可厚達3040nm。蛭弧菌的鞭毛結構是獨特的，它由鞭毛鞘和軸心組成，鞘壁厚約7.5nm，軸心直徑約13nm。Abram等3早期認為，蛭弧菌的鞭毛鞘是由細胞壁外膜延伸而組成的，但是當6 mol/L尿素存在時，鞭毛鞘極易被溶解破壞，而細胞壁不受影響。推測組成鞭毛鞘的物質可能對尿素比較敏感，使鞭毛鞘腫脹，直至破裂。有人認為，蛭弧菌鞭毛的結構與其他革蘭陰性細菌的鞭毛結構基本相似，但至今尚未發(fā)現蛭弧

7、菌鞭毛基部有類似于其他革蘭陰性菌鞭毛基部所具有的L環(huán)結構（圖3）。圖3 蛭弧菌鞭毛基部L環(huán)結構模式 蛭弧菌的纖毛基部起源于細胞膜，有612個環(huán)狀結構，有的分散，有的成簇集結在一起。有人稱這一結構為“感染錐子”或“吸附器（固著器）”。這一結構的存在，與蛭弧菌的寄生特性有關，對蛭弧菌進入宿主細胞時機械性鉆孔也有積極作用。三、蛭弧菌的化學組成 蛭弧菌具有典形的革蘭陰性細胞的化學組分。在這之前，曾有人誤認為蛭弧菌細胞中不存在肽聚糖。Tinelli等研究報道，蛭弧菌和其他革蘭陰性細胞一樣，含有典型的肽聚糖成分，并測得蛭弧菌的肽聚糖成分由胞壁酸、葡萄糖胺及其他13種氨基酸組成，同其他原核細胞壁肽聚糖組分和

8、結構類似，其甘氨酸：谷氨酸二異丙基氟磷酸：胞壁酸：谷氨酰肽比例為2：1：1：1：1。在腐生的蛭弧菌中分離到核糖及rRNA，Bd6-5-S在蛀螺菌中繁殖，則可產生含有氨基糖和可溶性胞壁酸的亞微粒子。Murray報到，鋅離子對蛭弧菌細胞壁及細胞膜結構的穩(wěn)定性很重要，在缺乏鋅離子的情況下，細胞壁將會變得十分疏松。蛭弧菌細胞膜的研究發(fā)現，其甘油磷脂成分主要是由磷脂酸乙醇胺和磷脂酰甘油組成，他們中主要成分為15碳支鏈脂肪酸。外膜中的類脂A是利用宿主細胞的類脂A，并經過一定的修飾，插入自身細胞的脂多糖結構而形成。脂多糖主要是由葡萄糖、宕藻聚糖、十九烷酸組成。此外，還含有一些其他脂肪酸、戊糖、酮脫氧鋅酸及磷

9、脂。在蛭弧菌外膜中存在類OmpF蛋白。 蛭弧菌的蛋白質含量豐富，可達細胞干重的60%65%，DNA的含量為5%，含有典型的嘌呤和嘧啶，DNA的G+C比例，大多數菌株為50.2±0.8%50.8±0.9%，兼性寄生蛭弧菌DNA的G+C比例較低，為42.7±1.0%42.8±0.9%。以蛭弧菌Bd109為例，蛭弧菌中主要大分子物質的比例見表1。在蛭弧菌BdA3.12和Bd109中，發(fā)現脫氧胞苷酸、尿苷酸、核糖、腺膘呤和鳥嘌呤。到目前為止，除了蛭弧菌DNA的基因位置和裝配結構尚不清楚外，還尚未發(fā)現蛭弧菌DNA結構成分的特殊性。 表1 蛭弧菌109和大腸桿菌ML

10、35大分子及含量成分蛭弧菌 大腸桿菌µg/1010細胞 千重（%） µg/1010細胞 千重（%）蛋白質 320 54 2200 54RNA 100 17 830 21 DNA 65 11 110 2.8 脂類 880 14 320 8 多糖 20 3.4 240 6 肽葡聚糖 5 0.8 40 1 干重 590 4000 Thomashow2報道,蛭弧菌鞭毛主要是由蛋白質、磷脂和脂多糖組成,其鞭毛軸心由多肽組成。鞭毛鞘易溶于Triton X-100。蛭弧菌鞭毛鞘不同于細胞外膜，具有特殊的生化性質，有鞭毛磷脂高達54%58%，蛋白質的含量僅為23%28%。與典型的細胞外膜的

11、磷脂、蛋白質的含量有明顯差異。這種高磷脂/蛋白質的比率揭示鞭毛鞘中具有磷脂雙層結構。同時，與細胞膜的磷脂雙層結構相比，具有較大的“流動”性，這可能為鞭毛的運動功能提供了物質結構基礎。組成鞭毛軸心的多肽主要由分子量為28kDa和29.5kDa的亞基組成，28kDa亞基位于菌體近端，29.5 kDa亞基位于菌體遠端。 蛭弧菌Bd.bdukiz的研究中，發(fā)現含有磷脂，其脂質中有的鞘脂類是其它細菌研究中極為罕見的。四、蛭弧菌的菌能量代謝 蛭弧菌嚴格耗氧，在宿主細胞中生長，所需氧壓在533Pa以下，其呼吸率為20×10-12m1O2/細胞（35，1h）。當蛭弧菌裂解菌體時，呼吸相應的增高。精氧

12、酸、谷氧酸等氨基酸對呼吸有明顯的促進作用。蛭弧菌在綜合培養(yǎng)基上能產生細胞色素a（吸收峰605nm）、b(吸收峰559、528、426nm)、c(吸收峰522、524nm)。BdA3.12細胞色素c的索瑞帶的吸收峰在607nm,其余在421423之間。蛭弧菌Bd6-5-S含有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH2）、煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（DNAPH2）細胞色素氧化酶，DADH2氧化酶的氧化率為DNDPH2氧化酶的2倍。NADH2氧化酶活性受氰化鉀和疊氮鈉所抑制，但不能被魚藤酮及4：1一氧化碳和氧氣混合物所抑制。NADH2氧化酶不受上述任何抑制劑的抑制。在蛭弧菌Bd6-5-S抽提物中，谷氨酸、-酮戊二

13、酸、琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸、丙酮酸、乙酸、-磷酸甘油、煙酰胺腺呤核苷酸及煙酰胺腺嘌呤核苷磷酸不改變耗氧量，但NADH2及NADPH2與耗氧量有關。有人報道，在細胞抽屜提物的微粒中存在三磷酸腺苷酶（ATP酶），同時還存在催化ATP與32P相互轉換的酶類物質。由于砷化物、疊氮化合物和2，4-二硝基苯酚對這種轉換無抑制作用，因此，這種轉換途徑可能受氨基酸氧化所催化。氧化NADPH2可能有兩種途徑：由黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）或黃素單核苷酸（FMN）所刺激，產生過氧化氫，對氰化鉀不敏感；通過細胞色素產生過氧化氫，對氰化鉀敏感。研究中發(fā)現，有些蛭弧菌含有豐富的觸酶，但不是所有蛭弧菌都含有觸酶。 蛭弧

14、菌Bd6-5-S中含有三羧酸循環(huán)所需的異檸檬脫氫酶，-酮戊二酸脫氫酶、延胡索酸水解酶、蘋果酸脫氫酶及琥珀酸脫氫酶等。但未發(fā)現其糖酵解途徑，不能利用碳水化合物及乙醇。蛋白質、多肽、氨基酸及核酸是主要的碳源和能量來源。Mitchel發(fā)現，一株海洋蛭弧菌可利用宿主大腸桿菌細胞壁為唯一的碳源。Seidler等5檢查了7株蛭弧菌，結果發(fā)現這些菌株都含有丙氨酸、谷氨酸、蘋果酸，異檸檬酸脫氫酶、延胡索酸水解酶、腺苷酸激酶、醌還原酶以及四唑氧化酶。但不同的菌株所含的酶類具有不同的理化性質，這一結果用于蛭弧菌分類是實際指導意義的。 Rittenberg等10通過U-14C標記宿主細胞，測得蛭弧菌在細胞內生長時r

15、ATP值為18.525.9。一般細菌rATP值為10。達到這樣高效果的部分原因，是因為蛭弧菌具有直接從宿主細胞吸收核苷酸的能力。因而貯存了高能磷酸鍵。在電子轉運系統中，每對電子轉運產生了3分子ATP（P/O值為3），底物磷酸化作用幾乎可以忽略，主要是三羧酸循環(huán)及電子轉運系統中產能。但其中還是含有低水平的糖酵解酶。在蛭弧菌能量代謝過程中，ATP酶是起主要作用的，約60%80%存在于可溶成分中，對二環(huán)已基碳二亞胺（DCCI）敏感，能被其抑制，細胞膜上的ATP酶對DCCI具有抗性，參與蛭弧菌氨基酸及磷酸的轉運，對DCCI的抗性主要是由于ATP酶與膜連接后產生的。 Hespll等6對蛭弧菌三羧酸循環(huán)及

16、糖酵解途徑中各種酶活性進行了分析（表2）。最初糖酵酶活性與大腸桿菌及蛭弧菌Bd109中的三羧酸循環(huán)中的酶活性相關。當蛭弧菌進入宿主細胞90min時，三羧酸循環(huán)中的酶活性增加約10%，而糖酵解酶活性下降25%60%；110180min時，三羧酸循環(huán)酶的活性增加50%60%，而糖酵解酶下降到接近0。而磷酸葡萄糖異構酶及甘油醛磷酸脫氫酶的活性較高。由于蛭弧菌嚴重耗氧，因此這二種酶可能與蛭弧菌生物合成有關，而并非是用于能量代謝。表2 蛭弧菌Bd109和大腸桿菌ML35細胞提取液中酶的活性酶的種類 大腸桿菌 蛭弧菌 需氧 厭氧 需氧葡糖激酶 48 50 2.4磷酸葡糖異構酶 42 204 109磷酸果糖

17、激酶 77 212 13果糖磷酸醛縮酶 142 198 9.5磷酸丙糖異構酶 141 177 33甘油醛磷酸脫氫酶 944 1193 690丙酮酸激酶 345 190 7.5檸檬酸合酶 1467 86 3360異檸檬酸脫氫酶 305 25 893延胡索酸酶 158 - -蘋果酸脫氫酶 5597 52 2200ß-半乳糖苷酶 3100 2810 -五、蛭弧菌的生命周期 蛭弧菌為細胞內寄生菌，整個生活周期可分為：識別、侵染、吸附（攻擊）；穿入宿主細胞、生長發(fā)育、裂解宿主、釋放子代蛭弧菌（圖4）。 圖4 蛭弧菌生活周期模式（本圖引自：Philp H（1980）.J Theor Biol）a

18、：蛭弧菌侵染宿主細胞；b：穿入宿主細胞壁；c：進入宿主細胞質，鞭毛脫落； d：蛭弧菌在此攝取營養(yǎng)，經過1到數小時生長，蛭弧菌小體延長；e-f：蛭弧菌生長分化，鞭毛形成；g：宿主細胞裂解，子代蛭弧菌釋放；-：蛭弧菌腐生生活周期（一） 識別宿主 蛭弧菌的化學趨避運動是識別宿主菌細胞的重要方式，當蛭弧菌從宿主細胞內釋放之后，處于極度的饑餓狀態(tài)，約50%在10 h內失活，但當有能源及碳源存在時，其存活略有提高。如培養(yǎng)液中宿主細胞含量在1.5×105個/ml時，蛭弧菌50%以上通過自由碰撞吸附于宿主細胞上。進一步研究發(fā)現，蛭弧菌并非是運用化學趨避性直接感染宿主的，而是蛭弧菌在含有L-天氡氨酸、

19、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸及L-蘇氨酸等氨基酸及化合物的環(huán)境中，通過化學趨向運動，尋找碳源和能源，緩和“饑餓”狀態(tài)，這樣蛭弧菌在其宿主菌所需的營養(yǎng)物質周圍集聚，而宿主菌也向其營養(yǎng)物質接近，局部環(huán)境中的宿主菌濃度升高，因此，蛭弧菌增加了對宿主侵染和吸附的機會。（二） 吸附 一般來說，開始時蛭弧菌與宿主細胞激烈碰撞，以沒有鞭毛的一端（頭部）直接吸附到宿主細胞上，頭部與宿主通過一系列的反應，菌體也高速轉動，速率100r/s以上，在此之后，蛭弧菌通過宿主細胞的細孔（附著位點）進到細胞壁和細胞膜之間，或直接進入細胞質中。侵入過程非?？?，幾秒種內即可完成。有時可有很多個蛭弧菌同時吸附

20、于同一宿主，有人發(fā)現，蛭弧菌吸附宿主是可逆的。蛭弧菌與宿主菌的比例在1:10100時，蛭弧菌吸附率最高。早期研究認為，蛭弧菌僅僅對生活的革蘭陰性宿主細胞有吸附能力，進一步研究發(fā)現，蛭弧菌對死的宿主菌和革蘭陽性菌同樣有吸附作用，但吸附率較低。秦生巨等近來研究發(fā)現，蛭弧菌對熱死（100、80、15min）或三氯甲烷處理致死的宿主細胞吸附略著高于對活菌的吸附率，前者是后者的35-265倍。原因尚不完全清楚，有待進一步研究。但Murray報道，去掉宿主細胞壁外層結構，有利于蛭弧菌的吸附。因此推斷，其外層結構中具有防御蛭弧菌侵入的物質，加熱或三氯甲烷處理宿主可能使這些天然屏障被破壞。目前已知蛭弧菌的吸附

21、作用受pH值、O2壓、溫度等許多環(huán)境條件的影響。有人推測蛭弧菌吸附于宿主菌時，它們之間存在一個“連接鍵”，由特定的“吸附器（固著器）”所介導。Varon等報道，蛭弧菌Bd109、BdGB對大腸桿菌和鼠傷寒沙門菌突變株（含有核心抗原，缺乏O抗原側鏈）的吸附比對它們的野生株更容易。但抗原缺乏過多，其吸附能力卻減弱。他們認為在宿主菌中存在吸附“受體”，位于R抗原中。但Huang重復了這項研究，并未能得到類似結果。Schelling等8進一步的研究發(fā)現，蛭弧菌對宿主的吸附性確實存在受體，他認為“受體”存在于宿主細胞壁脂多糖中的核心多糖上，與O側鏈無關，但Bd.bukiz的吸附識別反應不需要宿主脂多糖參

22、與。（三）穿入 蛭弧菌吸附宿主細胞之后，幾分鐘內就可破壞細胞壁，穿入宿主細胞，此時鞭毛消失，整個過程最長為60min，穿入方式：有人認為，由于蛭弧菌高速運轉，使得蛭弧菌在宿主細胞壁上機械打孔穿入細胞壁。其動力主要來源于特殊的鞭毛結構。Burnhgm報道9，蛭弧菌在穿入前，宿主細胞的吸附附著位點在細胞內壓力作用下使局部凸起，蛭弧菌在自身動力的驅使下，首先進入凸出部分，破壞細胞壁，進入宿主細胞。亦有人認為，蛭弧菌吸附宿主細胞后，在細胞壁上鉆孔，頭部與宿主原生物質體連接在一起，宿主細胞壁結構遭到破壞，導致內外滲透壓的平衡失調，從而引起宿主壁及原生質體的膨脹，最后導致蛭弧菌在吸附位點細胞壁與原生質體緊

23、密結合，這時，整個蛭弧菌菌體被動地進入膨脹的細胞壁與原生質之間（周質）。完成穿入過程。有人發(fā)現，用蛋白質合成抑制劑，如鏈霉素、嘌呤素及氯霉素等，可抑制蛭弧菌的穿入。據此認為，蛭弧菌穿入時宿主細胞壁破壞還有誘導酶的產生，誘導物存在于宿主細胞內。當蛭弧菌吸附于宿主細胞壁。Fackeell等報到，蛭弧菌穿入宿主細胞時，至少有溶菌酶、胞壁酸酶及酯酶等，Bd6-5-S還可釋放兩種多肽酶，分子分量為40kDa及100kDa。Michael等研究證明，當蛭弧菌穿入宿主時，聚糖酶及多肽酶的活性很高，短時間內溶解宿主菌10%15%的肽聚糖。聚糖酶溶解肽聚糖中的氨基糖，多肽酶水解肽聚糖中的二氨基庚二酸、大約30%

24、二氨基庚二酸殘基被水解。穿入過程結束時，這兩種酶的活性明顯降低或消失。與此同時在脂多糖中25%的葡萄糖胺被一種分子量小于2kDa的酶水解，該酶在穿入結束時，也不起任何作用。為此，許多人認為，酶是蛭弧菌穿入宿主細胞壁的主要因子。作者認為，蛭弧菌穿入宿主的機制是極為復雜的，可能是多種因素聯合作用的結果。（四）蛭弧菌的生長發(fā)育 1、蛭弧菌小體的形成及其特性 蛭弧菌穿入過程完成之后，對宿主細胞的結構進行一系列的修飾和改造，形成一個適合蛭弧菌生長的環(huán)境蛭弧菌小體。當蛭弧菌進入宿主周質間后，宿主細胞肽聚糖的60%70%的葡萄糖胺及胞壁酸發(fā)生去乙?；饔?。從而由對溶菌酶敏感轉成不敏感，保護菌體肽聚糖不被穿入

25、時釋放的酶繼續(xù)破壞。除此之外，宿主菌細胞壁的修飾過程中，還有非蛋白質大分子與肽聚糖共價連接，同時肽聚糖中的Braun脂蛋白大量丟失。蛭弧菌進入周質間，長鏈脂肪酸（60%棕櫚酸、20%油酸）通過羧酯鍵等聯接于宿主肽聚糖上，由于?；饔玫姆磻?，蛭弧菌小體外膜具有更強的抗?jié)B透壓的能力，從而起到穩(wěn)定蛭弧菌小體的作用。另有報到，蛭弧菌進入周質間，除了對宿主肽糖的修飾以外，二氨基庚二酸還可與宿主肽聚糖結合，而賴氨酸、鳥氨酸、胍氨酸和2，4-二氨丁酸則不能發(fā)生類似反應。蛭弧菌在大腸桿菌、惡臭假單胞菌、蔓延螺菌中生長時，均發(fā)生上述反應。該反應在熱死的宿主細胞上仍然能發(fā)生，且不受能量產生系統抑劑，蛋白和RNA合

26、成抑制劑及細胞壁合成抑制劑的影響，并且大約1/3的二乙丙基纖維素可與宿主細胞外二乙丙基纖維素交換。推測二乙丙基纖維素的修飾作用是完全由蛭弧菌自身的胞外酶催化的酶促反應來完成的。蛭弧菌還通過自身合成系統對宿主細胞肽聚糖進行修飾、改造，使其更適合自身生長的需要。蛭弧菌小體有4層特征性的結構：蛭弧菌小體壁；由宿主細胞組成的膜狀結構；蛭弧菌細胞壁及細胞膜。這些結構的通透性可調節(jié)其內外物交換，與蛭弧菌生長直接相關。Cover等22、23報到，蛭弧菌進入宿主菌60min時，蛭弧菌小體的體積增長到最大，超過底物細胞菌體。這時，蔗糖可任意通過底物細胞，但對寡聚糖有效通過無改變。在蛭弧菌小體細胞中，對親水分子通

27、透性也無改變。宿主細胞疏水性增高。疏水性的增加受到氯霉素的抑制，這與蛭弧菌合成相應的蛋白有關。在蛭弧菌小體形成初期，外膜蛋白對通透性具有重要的調節(jié)作用，Braun，脂蛋白丟失，隨后宿主細胞OmpA蛋白也逐步消失，但OmpF蛋白卻存在。這些變化，對蛭弧菌代謝過程中物質轉換提供了有利的條件。 2、核酸代謝 蛭弧菌在宿主細胞中生長時，可直接利用單體前體物質合成生物大分子，從而大大提高了其生物合成的速度。其核酸的合成，是直接利用單核苷酸作前體物質開始合成的途徑。Pritchard報到，蛭弧菌Bd109在大腸桿菌周質間生長時，對氨甲喋呤無明顯反應，而蛭弧菌Bd109突變株生長在酵母浸膏浸出物，及蛋白胨培

28、養(yǎng)基上的生長率及細胞得量受到氨甲喋呤的強烈抑制；但若培養(yǎng)基中加入胸腺嘧啶，或胸腺嘧啶核苷，或5-P-胸苷時，其抑制作用消失。大腸桿菌在缺乏四氫葉酸時，受氨甲喋呤的影響，產生異常高的蛋白/DNA比率。蛭弧菌在此宿主上生長細胞得量顯著減少，但總的DNA量高于大腸桿菌中DNA的量。5-P-胸苷可以除去上述抑制作用；同時，蛭弧菌也存在著胸腺嘧啶脫氧核苷酸合成酶、胸腺嘧啶核苷磷酸及胸腺嘧啶激酶，具有從頭合成DNA的潛在能力。Rittenberg研究發(fā)現，在宿主細胞周質中生長的蛭弧菌，首先利用宿主內源性磷，盡管外源性磷也進入周質。這一選擇性同樣適合于脂磷及核酸磷，內源性5-P-胸苷有效地被蛭弧菌用作DNA

29、合成前體，而外源性的胸腺嘧啶利用率極低，對外源性的胸腺嘧啶及尿嘧啶核苷幾乎是不利用。而對外源性的5-磷酸單核苷酸可直接用于蛭弧菌核酸的生物合成，宿主細胞核酸中的高能磷酸鍵的能量保存于蛭弧菌中，供其生長代謝需要。 通過2-14C標記尿嘧啶檢查，發(fā)現50%標記物摻入蛭弧菌核酸，剩下的部分以核酸堿基形式釋放，宿主大腸桿菌50S及30S的核糖體及23S和16S的核糖體核酸在90min內幾乎全部降解，90min后蛭弧菌RNA開始合成，其活性及標記物在堿基中的比例與宿主菌核酸相似。蛭弧菌DNA中的放射性標記量高于大腸桿菌，而且它們的胞嘧啶與胸腺嘧啶比例不變。當加入外源性的單磷酸核苷酸后，放射性摻入蛭弧菌量

30、明顯降低。加入核苷酸及堿基不影響蛭弧菌中放射性摻入量。從而說明，蛭弧菌RNA的合成，主要是通過降解宿主細胞RNA成單核苷酸后而以其作為前體物質開始的，并且宿主的RNA降解物可作為蛭弧菌DNA合成的前體物質。Rosson等18、19報道，蛭弧菌生長于2-14C標記DNA的大腸桿菌周質中，約30%的放射性以單磷酸核苷及堿基形式釋放到培養(yǎng)基中，其余摻入蛭弧菌，在60min時，僅10%的大腸桿菌DNA被溶解，其余DNA被降解成0.5Mda的片斷并入蛭弧菌小體中,先形成單鏈,然后形成雙鏈DNA片斷。蛭弧菌DNA的合成前體物質，大約70%來源于宿主菌的DNA，30%來源于宿主菌的RNA。進一步研究證明，宿

31、主菌DNA的降解及溶解主要是由蛭弧菌合成的DNA酶所致。Hespell等11、12、17對RNA的代謝過程進行了深入的研究，認為蛭弧菌在周質中生長時，利用宿主菌的RNA合成自身的RNA及DNA，同時約20%40%的RNA降解成堿基及核糖-1-磷酸殘基。核糖-1-磷酸進一步為蛭弧菌所代謝，作為能量的來源，及非核酸性細胞成分的生物合成的底物。在必要時，核糖也可用于其單磷枝核苷的合成。由于蛭弧菌在缺乏四氫葉酸的大腸桿菌中生長時，蛭弧菌子代細胞DNA的總量高于宿主大腸桿菌DNA的總量；蛭弧菌突變株在酵母浸出物及蛋白胨培養(yǎng)基上生長時，受到氨甲喋呤的強烈抑制。因此認為，在蛭弧菌中可能存在從小分子合成單體前

32、體物質，然后再合成DNA的途徑，甚至存在全新的合成脫氧胸腺嘧啶核苷酸的途徑。Rosson在研究中發(fā)現，蛭弧菌能夠使嘧啶相互轉化，并且合成5-三磷酸嘧啶核苷酸，其途徑與腸道菌相似，蛭弧菌在宿主細胞周質中生長與其突變株在培養(yǎng)基上生長時，這一途徑略有差異?，F已查明，由5-單核苷酸形成三磷酸核苷酸的酶濃度很高。并且，所有催化胸腺嘧啶補救途徑的酶（除胸腺嘧啶激酶之外）均在野生菌株中存在。通過代謝抑制的實驗觀察，確立了蛭弧菌嘧啶代謝的途徑（圖6），并發(fā)現幾乎蛭弧菌所有的非來源于底物細胞的DNA均來源于底物細胞的RNA。但沒有發(fā)現從氨基酸直接開始合成嘧啶的途徑。然而到目前為止，尚沒有足夠的證據否定這種途徑的

33、存在。圖6 蛭弧菌的嘧啶代謝途徑此圖為大腸桿菌、沙門菌的嘧啶代謝全過程。圖中附有數字箭頭表示蛭弧菌嘧啶代謝過程中已證實同樣存在此途徑，相同的數字表示酶相同；空箭頭表示蛭弧菌嘧啶過程中可能存在的途徑，但未被證實。酶：1、胸苷合成酶；2、胸苷磷酸化酶；3、胸苷激酶；4、脫氧胸苷酸激酶；5、二磷酸核苷激酶；6、胞苷脫氧酶；7、尿苷磷酸化酶；8、尿苷激酶；9、尿苷一磷酸焦磷酸化酶；10、核苷二磷酸還原酶。dR-1-P脫氧核糖1-磷酸；T胸腺嘧啶；TdR脫氧胸苷；U：尿苷；UdR脫氧尿苷；UR尿嘧啶；CR胞苷；CdR脫氧胞苷Rudy24，38，41對單核苷酸的轉運作了專門的研究，結果證明，蛭弧菌在侵入宿

34、主細胞前后，均能有效地轉運單核苷酸，轉運機制相同。耗能主動轉運單核苷酸是蛭弧菌固有的途徑，并非進入周質后而形成的。 3、其它大分子的合成 蛭弧菌在周質中生長，其核酸蛋白質、脂類等均是主要從底物細胞同類大分子的降解單體開始合成的。Rittenberg等10認為，底物細胞的肽聚糖不能用于合成蛭弧菌的肽聚糖，而是用于維持蛭弧菌小體的穩(wěn)定，蛭弧菌肽聚糖的合成是由小分子開始的。此外，蛭弧菌的其它一些部分合成如下。（1）脂多糖的合成：在非周質中生長的蛭弧菌的脂多糖，是由葡萄糖、中性糖、巖藻糖胺、氨基糖、十九烷酸及其它脂肪酸、戊糖、酮脫氧辛酸、磷酸等組成。在周質中生長的蛭弧菌，其脂多糖的組成兼有非周質中生長

35、的蛭弧菌脂多糖及宿主大腸桿菌脂多糖的特性。由宿主細胞脂多糖來源的各種脂肪酸占蛭弧菌脂多糖脂肪酸的大部分，并且兩者脂多糖中的脂肪酸比例相等。蛭弧菌從宿主細胞脂多糖中獲得的葡萄胺占其脂多糖總已糖胺殘基的1/3，然而大腸桿菌脂多糖中的核心抗原及O抗原在蛭弧菌中未檢出。因此有人提出，蛭弧菌脂多糖中的類脂A直接來源于宿主細胞。當蛭弧菌依次在兩個不同的宿主細胞中生長時，這兩個宿主細胞脂多糖中的類脂A的主要成分。有人重復了上述實驗，也證明了上述的觀點，宿主來源于類脂A完全可以摻入蛭弧菌的脂多糖結構。從于大腸桿菌周質中生長的蛭弧菌脂多糖中分離到的類脂A具有兩種Rf值，一種與大腸桿菌脂多糖中的類脂A相同（Rf1

36、）；另一種與在非周質間生長的蛭弧菌類脂A Rf值相同（Rf2）。說明在周質中生長的蛭弧菌的類脂A 部分由宿主菌來源，且結構沒有發(fā)生明顯改變。但兩種Rf值的類脂A均含有來源于宿主細胞的葡萄糖胺。Rf1的類脂A中的脂肪酸約65%來源于宿主菌的類脂A；Rf2的類脂A中的脂肪酸60%是蛭弧菌自身合成。來源于宿主細胞的脂肪酸N-?；癘-?；I分布與其類脂A中該鍵的分布相同。據此可知，在周質中生長的蛭弧菌的類脂A，一部分是自身合成；一部分是由宿主菌細胞直接提供。在摻入蛭弧菌的過程中，二糖單位及N-、O-、?；I不發(fā)生改變。這為進一步詳細闡明蛭弧菌脂多糖的合成提供了實驗依據。（2）外膜蛋白OmpF的合成：

37、蛭弧菌是否能合成OmpF，長期以來一直是個有爭議的問題。Fairbands等認為，蛭弧菌在周期中生長時，直接利用宿主菌中的外膜蛋白“蛋白I”或“矩陣蛋白”摻入蛭弧菌外膜。Diredrich等認為，摻入的是宿主菌細胞的OmpF蛋白或OmpC蛋白（缺乏OmpF時）。Bachmann等實驗發(fā)現，“蛋白I”或所謂“矩陣蛋白”由OmpF及OmpC組成。Guerrini等用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗分析了蛭弧菌中的外膜蛋白情況。結果為：當宿主細胞中含有OmpF時，其周質中生長的蛭弧菌也具有OmpF電泳譜，當宿主中不含有OmpF譜帶。因此，他們推斷蛭弧菌的外膜蛋白直接存在于宿主細胞。Guerrini等認

38、為，蛭弧菌缺乏編碼膜蛋白（MP）的基因。Diredrich等發(fā)現，蛭弧菌可生長于缺乏OmpF的宿主細胞。從而認為，OmpF對蛭弧菌的生活周期并不重要。Rayner等 25通過詳細的實驗研究發(fā)現，用三硝基甲苯X-100（Triton X-100）處理生長于含有OmpF的大腸桿菌周質的蛭弧菌外膜，在蛭弧菌中含有一遷移率（SDS-丙烯胺梯度凝膠電泳）幾乎與大腸桿菌OmpF相同的OmpF蛋白。當凝膠中加入尿素后，兩者遷移率同。但他們同時在缺乏OmpF的宿主細胞中生長的蛭弧菌及非周質中生長的蛭弧菌的外膜中發(fā)現了蛋白，而且多肽譜與大腸桿菌的OmpF的多肽譜無同源性。因此，他們認為蛭弧菌自身可以合成OmpF

39、蛋白。具體合成步驟至今尚不清楚有待于進一步探討。（3）關于蛭弧菌大分子的生物合成：Thomaschow等15，16，26指出，生活于周質間的蛭弧菌多聚體的合成，主要是通過降解宿主細胞相應的大分子成為單體，然后直接不變地或改變很少地摻入蛭弧菌，用于其生物大分子的合成。這樣，大大節(jié)省了合成所需的能量，為蛭弧菌高效生長提供了物質基礎。（4）蛭弧菌的成熟與分裂：當蛭弧菌進入宿主細胞之后，進行了一系列的生理形態(tài)變化：鞭毛消失；菌體延長。當蛭弧菌在宿主中生長后期，菌體成熟，鞭毛重新形成，多個子代蛭弧菌形成。Ruby等到、將蛭弧菌小體用EDTA（乙二胺四乙酸）及菌體裂解酶處理，使蛭弧菌釋放。當蛭弧菌釋放時，

40、所有的DNA合成停止，分化成具有侵染力的子代蛭弧菌。蛭弧菌在侵入宿主后約60min，由起動信號開始其DNA合成，在每個DNA合成周期結束后，由宿主菌的另一信號啟動第二輪DNA合成。子代蛭弧菌DNA合成后，隨著其它大分子的合成，裝配分化成多個子代蛭弧菌細胞。研究中發(fā)現，生長期的蛭弧菌具有很強的適應性，在任何時候都可以分化，不需要外源性的碳源和能源，完全是依賴蛭弧菌自身。蛭弧菌正常的周質生長期是在其“調節(jié)”物質耗盡時開始的。（五）宿主細胞的裂解 蛭弧菌對宿主細胞的裂解特性，長時間以來，一直被人們關注。對蛭弧菌的裂解機制也進行了大量的研究工作。1978年Thomashow等 15，16提出的“蛭弧菌

41、穿入、穩(wěn)定、裂解”模型較有代表性。參與這一過程的主要酶包括：聚糖酶，蛋白酶，N-脫酰基酶、?；D移酶，Braun去脂蛋白酶（可能是蛋白酶），裂解經修飾的肽糖酶，脂酶，溶菌酶等。聚糖酶及脂蛋白酶只是在蛭弧菌“穿入”時有活性，而蛋白酶在蛭弧菌的大部分生活期間有活性，但活力不斷下降。這三種酶在蛭弧菌“鉆孔”中起了作用。N-脫?；?、?；D移酶的作用是維持蛭弧菌小體的穩(wěn)定，能使之抗?jié)B透壓，不被破壞。去Braun脂蛋白酶主要是通過修飾底物細胞壁，使聚糖酶作用消失，而完成這一功能。當蛭弧菌在周質中生長時成熟后，蛭弧菌合成一種新的酶，其功能是完全裂解修飾的肽聚糖，其作用位點于肽聚糖中不可缺少的氨基糖連接鍵。

42、從而釋放子代蛭弧菌。六、蛭弧菌突變菌株的研究早期研究認為，蛭弧菌是胞內寄生物。1975年Starr指出，蛭弧菌與宿主細胞不僅僅是寄生的關系，而且還存在共同生的關系。并且發(fā)現蛭弧菌存在依賴于宿主菌生長和非依賴宿主菌生長的兩種菌株。因此，蛭弧菌可被認為有“依賴共生（S-D）”及“非依賴共生（S-C）”或“非依賴共生條件突變株（Sd-comp+）”兩種。非依賴共生條件突變株最早于1963年分離得到，稱為“非依賴宿主”菌。然而，這些命名均不能準確描述蛭弧菌突變株的性質。因為一株“非依賴宿主菌”蛭弧菌可以在無宿主菌細胞的培養(yǎng)基中生長，并不意味著它本身不具備在宿主細胞中生長的能力。Varon蛭弧菌突變株新

43、命名方式，把它們分為：Sin comp+，具有兼性生長特性突變株；Sin comp-，非共生性突變株；Sd comp-，條件性突變株，在合適的溫度環(huán)境中，可以不依賴于宿主生長，但在限制溫度的環(huán)境中，只能在宿主菌細胞內生長。蛭弧菌突變株Bd109J研究表明，從Sd comp+中分離出的Sin突變株大多數為comp+，從Sin comp-中分離到comp-。Sin comp+在有機培養(yǎng)基中對Sin comp+的選擇不利，在含有大腸桿菌的緩沖液中對Sd comp-的選擇不利。Junn等對溫度敏感的蛭弧菌Bd109D突變株進行了研究，這些突變株通過乙基甲烷磺酸誘變劑處理而獲得，回復突變率為10 610

44、-9。通過電境、溫度漂移、一步生長試驗、吸附動力及大分子通透性等研究，發(fā)現其生活周質中的許多途徑被中斷。如蛭弧菌Bd109D153推動吸附能力，Bd109D3和Bd109D48不能穿入宿主細胞，Bd109D4和Bd109D152推動在細胞內生長的能力。在限制溫度下，Bd109D153盡管仍然高速運轉，但對宿主細胞的吸附受到抑制。在38.5時,蛭弧菌Bd109D153吸附于大腸桿菌宿主細胞壁,同其野生菌株吸附在枯草桿菌(革蘭陽性菌,非特異性宿主細胞)上一樣,隨后不穿入細胞,從其吸附的細胞上脫落.揭示蛭弧菌有早期階段,存在“兩期吸附”的現象。目前所知，野生菌株幾乎都在宿主細胞內生存的。但對其衍生菌

45、株（兼性及不依賴于宿主細胞）的研究，特別是對其突變株的研究用于描述蛭弧菌代謝機制是具有重要的意義和指導實踐價值的。七、蛭弧菌生物拮抗作用的研究（一） 蛭弧菌的噬菌特性 蛭弧菌在含在特定宿主的雙層瓊脂平板上，可裂解宿主，形成類似噬菌體的噬斑，現已研究證明，蛭弧菌是一類專門的以捕食細菌為生的寄生物。它可以同時裂解不同科屬的革蘭陰性細菌的大部分，一些菌株還可以裂解革蘭陽性菌。蛭弧菌對沙門菌屬等裂解活性很強，司穉東等研究報道，蛭弧菌對沙門菌屬、志賀菌屬、弧菌屬、埃希菌屬、假單胞菌屬中的24株不同科屬細菌的裂解率為75%99.6%，有部分陽性菌株也可被蛭弧菌裂解，但枯草桿菌不能被蛭弧菌裂解。秦生巨檢查了

46、蛭弧菌Bd81、Bd98對69株弧菌（其中包括霍亂弧菌古典型2株；霍亂弧菌E1 Tor生物型57株；不凝集弧菌10株）的裂解作用，結果證明，蛭弧菌Bd81，Bd98對蛭弧菌裂解率分別為81.2%和78.3%。而且還發(fā)現，蛭弧菌Bd81、Bd98對57株E1 Tor霍亂弧菌的裂解作用，沒有噬菌體型及血清型的選擇。秦生巨和解桂如進一步檢查了蛭弧菌Bd81、Bd98對206株（其中標準菌株5株；地方菌株201株）傷寒沙門的裂解效果發(fā)現弧菌Bd81、Bd98對206株傷寒沙門菌裂解高達96.6%和99.02%，且對噬菌體型及不同的耐藥菌株亦無特殊性的選擇。 蛭弧菌不僅對細菌有強力的裂解作用，而且對某些

47、病毒亦有良好的破壞力，對腸道病毒有著很高的裂解活性。有人認為，蛭弧菌不僅與RNA病毒，而且與DNA病毒相互作用后，可導致病毒明顯的失活，這一現象很有實踐意義。另外，蛭弧菌對植物病原菌同樣有著很強的侵染力，如大豆疫假單細胞菌、水稻白葉枯病黃單細胞菌、白菜軟腐病菌等有較強的裂解作用。另據報道，蛭弧菌對雞白痢病菌感染亦很明顯，目前有人試圖利用蛭弧菌預防雞白痢病。秦生巨還報道，蛭弧菌對水生物致病菌也有裂解效果，如蛭弧菌對生產珍珠的河蚌致病菌（嗜水氣單細胞菌）裂解率可高達90%以上。為此人們認為，蛭弧菌有可能被用來防治人類、動、植物病菌所帶來的危害。（二） 蛭弧菌對河水中細菌的凈化作用據報到，同時加入沙

48、門菌、志賀菌的河水中，蛭弧菌可顯著的影響沙門菌和志賀菌的生存時間。經蛭弧菌作用后，在河水20和40時，沙門菌的生存時間為2537d；志賀菌為1929d。Lepin等也發(fā)現，蛭弧菌對污水中的沙門菌屬有重要的消除作用。Venosa報到，蛭弧菌還能清除污水中的浮游球衣菌。秦生巨等在滅菌湖水，模擬自然條件的河水以及自然環(huán)境河水中，觀察了蛭弧菌對霍亂弧菌、不凝集弧菌、傷寒沙門菌、大腸桿菌、志賀菌等的凈化作用。結果證明，蛭弧菌Bd81，Bd98在滅菌湖水中，7d時，可清除湖水中的92.8%97.4%福氏志賀菌，對照組僅減少20%。在模似自然條件河水中，9d時，蛭弧菌B81可使霍亂弧菌由2.5×1

49、07/ml減少到363個/ml，而未加蛭弧菌對照組中的霍亂弧菌僅由1.7×107個/ml減少到2.0×104個/ml。自然環(huán)境河水中，蛭弧菌可使自然河水中的不凝集弧菌與對照組相比較，提前18d消失；實驗21d時，自然河水中的不凝集弧菌由6.8×106個/ml減少到27個/ml，相同時間內，對照組河水中不凝集弧菌僅由4.46×106個/ml相應減少到1.88×103個/ml。Lambna等報到，蘇聯普希諾污水處理廠，對蛭弧菌在污水自凈過程中的參與作用進行了研究。結果證明，由于蛭弧菌裂解作用，可降低污水中異養(yǎng)性革蘭陰性桿菌及大腸桿菌的數量。但他認為

50、，這種作用受溫度的影響，水溫在26時凈化效果最佳，目前，已普遍認為，有可能利用蛭弧菌控制或減少致病菌對環(huán)境水源的污染，預防一些常見疾病的發(fā)生，尤其是腸道傳染病的發(fā)生和流行，保護人體健康。（三）蛭弧菌的預防作用實驗證明，蛭弧菌對動物是不致病的，有人以109個蛭弧菌的劑量對小鼠，豚鼠和家兔等動物無毒性作用；就是用于猴腎、HeLa細胞組織培養(yǎng)亦不引起任何細胞病變。秦生巨等指出，蛭弧菌菌劑外用有預防某些外傷感染及動物角、結膜炎的效果。近來，呼蘭、劉秉陽實驗證實，蛭弧菌對小鼠角、結膜有保護作用。八、結束語 蛭弧菌的發(fā)現至今已28年了，發(fā)表文章500余篇，研究者對它的生物學、生理學、生態(tài)學、生物化學、分類

51、學以及蛭弧菌凈化環(huán)境水源方面進行了大量的研究工作。在分子生物學方面，也進行了許多有成效的研究，并發(fā)表論60余篇。近年來，分子生物學特性的研究進展很快，但作者認為，以下兩方面問題必須深入研究。一方面，“蛭弧菌-蛭弧菌噬菌體-宿主菌”這一獨特的“三位一體”的寄生體系，應引起人們的注意。蛭弧菌噬菌體可以侵染蛭弧菌，并在蛭弧菌體內復制子代；蛭弧菌又可以侵染宿主細胞，同樣是在宿主細胞內復制子代。而且已知蛭弧菌DNA的合成80%來自宿主，蛭弧菌噬菌體DNA的合成則全部來自蛭弧菌。這一過程顯然是需要分子生物學技術基因重組。若能利用這一現象，對工業(yè)生產及生物制劑的研究可能是有積極意義的，應引起研究者的重視。另

52、一方面，現已證實，蛭弧菌是自然水體生物凈化的極為重要的生物因子之一。國內外許多實驗結果表明，蛭弧菌在實驗條件、模似自然條件和自然環(huán)境河水中對許多致病菌有顯著清除作用，但是，如何將蛭弧菌凈化水體中致病菌加以推廣應用到預防腸道病等實際工作去，還需進一步探索。目前，國內外已有實驗室正在致力于這項研究。蛭弧菌對致病微生物的作用，不僅局限于人類，對環(huán)境水源中的致病微生物等同樣有顯著的凈化效果。為此，如擴大蛭弧菌的研究范圍，尤其是蛭弧菌在環(huán)境保護中的應用，應引起有關部門的重視。 參考文獻 1 Stolp H,et al. Phytopathol Z 1962;45:364. 2 Thomashow LS,et al. J Bacteriol 1985;163:1038. 3 Abram D,et al. J Bacteriol 1970;104:948. 4 Steiner S,et al. J Bacteriol 1973;116:1199. 5 Seiddler S,et al. J Bacteriol 1969;100:769. 6 Hespell RB,et al. J Bacteriol 1976;128:677. 7 Varon M,et al. J Bacteriol 1969;99:136. 8 Schelling ME,et al. Abstr An