灰樹花多糖對禽流感滅活疫苗預防效果的影響.docx

1、DOI：10.15955/j.issnlOOO-3924.2015.03.14上海農業(yè)學報2015,31(3):68-72ActaAgriculturaeShanghai文章編號:1000-3924(2015)03-068-05灰樹花多糖對禽流感滅活疫苗預防效果的影響丁海城周昌艷小，劉承初"('上海海洋大學食品學院，上海201306；2h海市農業(yè)科學院農產品質量標準與檢測技術研究所，上海201304；上海水產品加工保藏工程研究中心，上海201306)摘要：將正常的清潔級北京油雞分組飼喂添加不同百分比灰樹花多糖的飼料，分別在10日齡、25日齡和40日齡時注射禽流感H5N1滅活疫

2、苗免疫，并在注射免疫的第2天進行血液中禽流感病毒H5亞型抗體(AIV-H5Ab)水平、巨噬細胞吞噬活性和T淋巴細胞亞群(CD3收稿日期：2014-05-14基金項目：上海市科技興農項目滬農科攻字(2012)第2.7號;國家食用菌質量安全風險評估專項GJFP2015006作者簡介:丁海城(1989)，男，在讀碩士，主要從事糖生物學研究。E-mail:ding_haicheng通信作者,E-mail:changyanz/CD4*/CD8*)含量的測定，統(tǒng)計飼養(yǎng)過程中的飼料消耗以及油雞體重的增加量,計算不同分組的生產性能。試驗結果表明:灰樹花組分能提高AIV.H5Ab的水平，增強吞噬細胞的活性，增加

3、T淋巴細胞亞群的含量，提高北京油雞的生產性能，對AIV-H5亞型滅活疫苗的預防效果具有良好的促進作用。關鍵詞：灰樹花多糖;北京油雞;禽流感病毒;AIV-H5亞型;滅活疫苗;預防效果InfluenceofGrifolafrondosapolysaccharideonpreventiveeffectofavianinfluenzainactivatedvaccineDINGHai-cheng1,ZHOUChang-yan2*,LIUCheng-chui,3(1CollegeofFoodScienceandTechnology,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai2013

4、06,。死似；2InstituteforAgro-FoodQualityStandardsandTestingTechnology,ShanghaiAcademyofAgriculturalSciences,Shanghai201403,China；ShanghaiEngineeringResearchCenterofAquaticProductProcessing&Preservation,Shanghai201306,China)Abstract:CleanPekingyellowchickensweredividedintogroupsandraisedwiththefeedsc

5、ontainingdifferentpercentagesofGrifolafrondosapolysaccharide;theywereinoculatedwithavianinfluenzavirusH5N1inactivatedvaccinerespectivelyatagesof10,25and40days,andtheirsera'sAIV-H5Ablevels,macrophages*activitiesandT-cellsubpopulations(CD3*/CD4*/CD8+)weredeterminedonthenextdayafterinoculations；and

6、thedifferentgroups'feedconsumptions,bodyweightgainsandproductionperformanceswereanalyzed.TheresultsindicatedthattheG.frondosacomponentscouldraisetheAIV-H5Ablevel,enhancethemacrophages*activity,increasetheT-cellsubpopulations,improvetheproductionperfonnance,andinshort,promotethepreventiveeffectof

7、A1V-H5N1inactivatedvaccine.Keywords：Grifolafrondosapolysaccharide；Pekingyellowchicken；Avianinfluenzavirus；A1V-H5N1；Inactivatedvaccine；Preventiveeffect灰樹花(Grifolafrondosa)又名貝葉多孔菌、粟蘑，俗稱云蕈、日本稱舞茸，屬于擔子菌亞門層菌綱非褶菌目多孔菌科樹花菌屬，是一種新型的藥、食兼用的珍稀食用菌屬?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，作為灰樹花中主要活性成分的灰樹花多糖具有顯著的抗癌、保肝、降血壓、提高免疫力等諸多藥理學活性。禽流感(Aviani

8、nfluenza,AI)是由A型流感病毒引起的一種接觸性傳染病，嚴重威脅著世界各地的家禽業(yè)，特別是由H5、H7亞型病毒引起的高致病性禽流感，給家禽業(yè)造成了巨大的經濟損失，不僅如此，1997年發(fā)現(xiàn)的H5N1和2013年發(fā)現(xiàn)的H7N9亞型高致病性禽流感病毒能直接感染人，并導致死亡，對人類的身心健康造成嚴重危害，引起了全世界的高度關注2勿。為了能夠有效預防和快速控制高致病性禽流感疫情,許多國家和地區(qū)采取了撲殺、強制性免疫和生物安全相結合的防治措施，取得了良好的效果，世界衛(wèi)生組織專業(yè)也建議將免疫接種作為撲殺的補充手段。本研究將灰樹花多糖作為北京油雞的飼料添加劑來試驗灰樹花多糖對H5N1亞型滅活疫苗效果

9、的影響，以期為新型動物飼料添加劑的開發(fā)應用提供參考。1材料與方法1.1試驗動物1日齡清潔級雄性北京油雞300羽，健康狀況良好，由上海市農業(yè)科學院莊行養(yǎng)殖基地提供并飼養(yǎng)。飼養(yǎng)至1周齡時隨機分為5組，每組60只分籠飼養(yǎng)。1.2試驗樣品60目灰樹花粉，灰樹花子實體原材料經上海百信生物科技有限公司藥用粉碎機粉碎并過60目篩，經過測定其中多糖含量為8.49%。重組禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗(ReG株+Rel株)，由哈藥集團生物疫苗有限公司提供。1.3試驗方法供試雞在分組前均飼喂相同的常規(guī)全價飼料,1周齡時分組飼養(yǎng)，第1組飼喂含有1%灰樹花多糖組分的飼料，第2組飼喂含有0.5%灰樹花多糖的飼料，第3組

10、飼喂含有0.25%灰樹花多糖的飼料，第4組和第5組飼喂常規(guī)全價飼料。10日齡時首免，對第1組、第2組、第3組、第4組注射禽流感油乳劑滅活疫苗0.3mL/羽，第5組作為空白對照組,不注射免疫;25日齡時二免,0.3mL/羽;40日齡三免,0.5mL/羽。1.4雞禽流感病毒H5亞型抗體(AIV-H5Ab)水平測定分別在首免、二免和三免后的第1天每組隨機抽取10只,翼下靜脈采血,2000r/min離心10min,取血清，用ELISA試劑盒測定其中AIV抗體含量。ELISA試劑盒由上海勁馬實驗設備有限公司提供，批號：201309o1-5血液中巨噬細胞吞噬活性的測定分別于首免、二免和三免后的第1天每組隨

11、機取10只雞,側翅酒精消毒，按照體重以2mL/kg將印度min時和10min時從對側翅下靜脈取汁:生理鹽水(1：3)側翅靜脈注射,注射完畢立即計時,分別在2血20以，加入到含有2mL0.1%Na2CO3的溶液中，搖勻，以0.1%Na2CO3溶液做空白對照在600nm波長下測定OD值。然后將雞處死，取肝臟、脾臟，吸水紙吸凈表面水分，稱重，根據(jù)得到的數(shù)據(jù)計算吞噬指數(shù)a：_lgO2-蛆?！?_tt2°K為未經校正的吞噬指數(shù);。2為2時血液樣品的OD值;。久為時血液樣品的OD值;吞噬指數(shù):吞噬指數(shù):體重肝重+脾重1.6雞T淋巴細胞亞群(CD3+/CD4*/CD8+)含量測定分別在首免、二免和

12、三免后的第1天每組隨機抽取10只,翼下靜脈采血,2000r/min離心10min分離血清，用ELISA試劑盒測定血清中T淋巴細胞亞群(CD3/CD4+/CD8*)含量。ELISA試劑盒由卡邁舒(上海)生物科技有限公司提供，檢測范圍15.6-500.0pg/mL,批號：2013/07/26(96T)o1.7生產性能的測定分組飼喂之后，對每次免疫期間的飼料消耗量及供試雞體重進行稱量統(tǒng)計，根據(jù)每組飼料消耗量以及增加的體重進行生產性能的評估。數(shù)據(jù)分析及處理所得數(shù)據(jù)由Excel2010及SPSS13.0進行分析處理，以Mean土SE表示。1.82結果與分析2.1雞禽流感病毒H5亞型抗體(AIV-H5Ab

13、)水平按照ELISA試劑盒的操作要求,對采集的血清樣品中H5亞型抗體(AIV-H5Ab)的含量進行測定，結果如表1所示。根據(jù)所得的數(shù)據(jù)，首免后空白組的抗體量為(226.82±8.66)ng/L,超出了正常范圍且與其他免疫組差異不明顯，表明油雞在生長初期體內就已經含有少量的AIV-H5Ab抗體，具備一定的抗病毒能力。根據(jù)王志平的報道，可以判斷母體將一定的免疫能力傳遞給子代，使得子代在孵化成長之后就具有一定的抵抗H5N1病毒的能力。二免之后抗體含量較之前有所增加，增幅在21.07%T2.76%,三免后的抗體含量較二免增幅在11-08%33.47%，可以看出增幅明顯減緩，表明體液免疫趨于平

14、穩(wěn)。通過同批次的試驗結果可以看出，添加了灰樹花多糖的組較未添加的抗體量分別高0.80%-14.79%、26.36%-37.92%，其中二免后的第1、2組較其他幾組差異性顯著(P<0.05),三免后的第1、2、3組較其他組差異性顯著(P<0.05)，說明灰樹花組分的添加對提高血清中H5亞型抗體量起到了促進作用。表1血清樣品含禽流感病毒H5亞型抗體Table1ContentsofAIV-H5Abinserumsamples組別12345首免220.81 ±7.91a225.39±7.19a236.56±3.91a223.66±4.46a226.8

15、2 ±8.66a二免315.23±7.25a291.56±10.68ab279.72±7.28b276.82±9.73b274.61±8.91b三免420.74±17.83a410.11±14.07a397.15±21.36ab385.46±18.68b305.05±15.95b注洞列不同字母代表差異顯著(P<0.05)；H5亞型抗體含量在23.5-141.2ng/L為正常值。2.2血液中巨噬細胞的吞噬活性經過對采集到的樣品進行處理及測定，得到的相關數(shù)據(jù)經過計算，得到每個樣品組在

16、免疫注射后代表巨噬細胞吞噬性能的吞噬指數(shù)a(表2)。表2不同日齡北京油雞的吞噬指數(shù)aTable2Phagocyticindexes(a)ofPekingyellowchickensatagesindays組別10日齡25日齡40日齡18.16±0.96a9.81±2.73ab12.01±1.78c27.81±0.94a9.37土1.36ab11.59±2.12c37.34±1.97a9.51±2.26ab10.82±2.32b47.30±1.79a8.39±2.05a10.26±2.0

17、8ab58.02±1.08a9.79±1.36ab9.98±2.27a注:同列不同字母代表差異顯著(P<0.05)。表2可見,相同試驗組隨著飼養(yǎng)周期的延長吞噬指數(shù)a逐漸增大，其中注射疫苗且在飼料中添加灰樹花組分的第1、2、3組平均增長幅度為21.62%,陽性對照組平均增長幅度為18.60%，而陰性對照組的平均增幅為12.01%。由此可知，北京油雞的免疫能力隨著生長周期的延長而增強，同時也表明疫苗注射在一定程度上促進免疫系統(tǒng)的發(fā)育。同日齡的不同實驗組間比較可知，除10日齡外,25日齡和40日齡組中添加了灰樹花組分的組的吞噬指數(shù)分別較陽性對照組高13.35%16

18、.90%和5.45%17.06%，具有顯著性差異(戶<0.05),且總體上吞噬指數(shù)與灰樹花組分的添加量呈正相關，故認為灰樹花組分對吞噬指數(shù)的提高起到了促進作用，即對免疫系統(tǒng)的發(fā)育起到了一定的促進作用。2.3雞T淋巴細胞亞群(CD3+/CD4+/CD8+)的含置按照ELISA試劑盒的操作要求,對采集的血清樣品中T淋巴細胞亞群(CD3+/CD4+/CD8+)含量進行測定，結果見表3。表3不同日齡北京油雞T淋巴細胞亞群(CD3/CD4+/CD8+)含置注:同列不同字母代表差異顯著(P<0.05)。Table3T-cellsubpopulations(CD3+/CD4+/CD8+)cont

19、entsofPekingyellowchickensatagesindayspg*mL,組別10日齡25a齡40日齡1189.982±14.452ab386.673±31.721a421.546±36.527ab2180.603±22.066a377.676±28.667a418.748±31.622a3179.213±18.570a342.358±31.721a390.691±39.301a4166.372±13.551a375.726±37.766a396.565±40.

20、018ab5201.554±12.744ab394.281±35.338a457.345±33.323b根據(jù)試驗結果，相同試驗組的T淋巴細胞亞群含量隨著時間的推移而逐漸增高，但前2次采樣間隔增加比例(89.56%125.83%)比后兩次間隔(3.45%22.31%)差異較大,根據(jù)孫國慶等的研究可推測:在25日齡到40日齡期間的T淋巴細胞含量變化較小，增長幅度變緩。針對不同日齡的組間比較可知：陰性對照組的T淋巴細胞含量較注射過AIV疫苗的組要高，增幅為15.17%-18.03%,在一定程度上反應了AIV疫苗對T細胞免疫功能的抑制，與鄭世民等、羅玲等的研究一致。飼料中

21、添加了灰樹花的第1、2、3組相比于陽性對照組,除添加量為0.25%的第3組組含量較低之外,其余兩組均高于陽性對照組,但不具有顯著性差異(F>0.05),說明添加的灰樹花組分在一定范圍內對北京油雞的細胞免疫系統(tǒng)有促進作用。根據(jù)羅燕等的研究，推斷應為含有的灰樹花多糖對淋巴細胞轉化率起到了一定的促進作用，增強了機體的細胞免疫功能。2.4生產性能根據(jù)對北京油雞分組飼養(yǎng)后的飼料日消耗量以及體重的記錄，對每次免疫注射之間的相關數(shù)據(jù)進行整理，得到了北京油雞在不同時間段內的增加體重及飼料消耗量。根據(jù)表4,所有試驗組在710日齡期間的料重比較1125日齡和710日齡的料重比分別高0.13%3.70%和2.

22、56%T.06%,說明北京油雞在后期的生長過程中對飼料的利用率較高，也有可能是因為前期因北京油雞體型較小而采用托盤給料造成了一定的飼料浪費導致，故后期數(shù)據(jù)較前期數(shù)據(jù)更具有說服力。對比同階段不同分組的數(shù)據(jù)可知，陰性對照組的體重增加量比注射過AIV疫苗的其余4組都要高，反應出疫苗在一定程度上會影響雞自身的生長發(fā)育,這可能與其在免疫功能上的增強來對疫苗產生免疫特性有關。26T0日齡期間，第1、2、3組的料重比分別較陽性對照組和陰性對照組平均低1.08%和0.49%，說明飼料中添加的灰樹花組分對飼料的利用率有一定的促進作用,即灰樹花組分對提高料重比起到了促進的作用，但效果較小。表4不同時間段內北京油雞

23、的體重增加、飼料消耗以及料重比Table4Pekingyellowchickens'bodyweightgains,feedconsumptionsandratiosoffeedtoweightgainatgrowthstages組別710日齡H25日齡26-40日齡體重增加量/g飼料消耗量/g料重比體重增加量底飼料消耗量/g料重比體重增加量/g飼料消耗量/g料重比117.9068.643.835112.70418.823.716201.4736.963.659218.3069.853.817110.90418.543.774199.7733.103.671318.1871.323.9

24、22111.42421.393.782203.4752.173.698418.5170.563.811110.55420.773.806198.6738.113.716518.8772.113.821113.39422.713.728205.1757.643.6943結論與討論體液免疫是由B淋巴細胞介導的一種重要的特異性免疫反應，是機體抵抗傳染病的主霎因素之一。作為衡量禽類體液免疫功能的重要標志之一,外周血液中的抗體在機體內可以發(fā)揮多種免疫功能。本實驗結果表明灰樹花多糖能有效提高機體內H5亞型抗體的含量，并且H5亞型抗體含量與飼料中添加的灰樹花多糖含量成正比,說明灰樹花多糖對重組禽流感病毒H5

25、亞型二價滅活疫苗誘導的特異性免疫具有顯著地增強作用。巨噬細胞是動物機體天然抵抗力的一個重要組成部分，也是非特異性免疫不可或缺的成分,具有吞噬殺傷、抗原呈遞和合成分泌各種活性因子的功能，對機體的體液免疫和細胞免疫均有著非常重要的作用"°。因此，測定機體巨噬細胞的功能活性對研究機體的非特異性免疫功能具有非常重要的意義，試驗結果表明，巨噬細胞吞噬指數(shù)與添加的灰樹花含量呈正比且隨著飼養(yǎng)周期的延長而逐步升高，說明灰樹花多糖能有效的增強巨噬細胞的吞噬活性。CD3、CD4與CD8分子是T細胞重要的表面標志，其中CD3在未成熟胸腺細胞中就能被檢測到，是作為T細胞系發(fā)揮作用的最早信號,CD4

26、和CD8是絕大部分胸腺細胞表面都表達的分子。CD3分子是由多種跨膜蛋白組成的復合蛋白，在抗原的識別過程中起著傳遞信號的作用,CD4和CD8分子作為TCR的輔受體參與對MHC分子遞呈抗原的識別，其中CD4*T細胞能識別MHCII類分子遞呈的抗原，而CD8+T細胞能識別MHCI類分子呈遞的抗原皿心。實驗結果表明灰樹花多糖能有效的提高血液中T淋巴細胞亞群(CD3'/CD4+/CD8+的含量)，對機體的細胞免疫功能具有較強的增強作用。生產性能是衡量飼料利用率的指標之一，同時也是判斷一個動物品種優(yōu)良與否的重要指標。試驗數(shù)據(jù)表明灰樹花多糖能提高油雞的生產性能，且在生長后期的增長率比生長前期高。注射

27、了重組禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗的分組生長性能較陰性對照組低，也說明禽流感疫苗引起的一系列免疫反應對機體的正常生長造成了一些影響,與此前魯梅等對肉雞的相關研究有悖,推測可能的原因是疫苗的種類不同及實驗對象不同導致。綜上所述,在飼料中添加一定量的灰樹花組分，一定程度上會增強雞的巨噬細胞的吞噬能力，刺激淋巴細胞的增殖分化，通過抗體補體的作用使中性粒細胞的吞噬能力進一步加強。T淋巴細胞亞群的含量與添加的灰樹花組分成正相關，也表明灰樹花組分對促進免疫系統(tǒng)的發(fā)育,增強機體的免疫抗性有良好的促進作用，但同時也發(fā)現(xiàn)疫苗在一定程度上會影響北京油雞的體重增長，這可能與其需要將部分營養(yǎng)物質與能量分配給免疫系統(tǒng)進行發(fā)育而有關。而且少量的灰樹花組分會提高飼料的利用率，促進機體在特異性免疫反應的同時對飼料有良好的吸收利用效率。所以，一定量的灰樹花組分可以促進機體非特異性免疫的反應強度，增強抵抗力，同時對生產性能的提高也有較好的促進作用。參考文獻1劉安,臧立華，孫慶濟,灰樹花多糖抗腫瘤作用的臨床觀察J.山東輕工業(yè)學院學報,2008,22(2):4345.2JSuarezDL,Perdueml,CoxN,etal.ComparisonsofhighlyvirulentH5N1influenzaAvirusesisolat