氯化兩面針堿的體內(nèi)抑瘤作用及機(jī)制

1、氯化兩面針堿的體內(nèi)抑瘤作用及機(jī)制        【摘要】  目的研究氯化兩面針堿對S180荷瘤小鼠的的抗腫瘤作用及機(jī)制。方法以荷瘤小鼠實體瘤瘤重為實驗指標(biāo)評價氯化兩面針堿對S180移植性肉瘤的抑制作用，免疫組織化學(xué)方法檢測腫瘤組織中的p53、Bcl-2和Bax蛋白。結(jié)果氯化兩面針堿 2.5，5和10 mg·kg-1劑量對S180肉瘤生長的抑制率分別為1.95%，27.3%和42.9%，p53、bcl-2蛋白的表達(dá)率明顯低于對照組，bax蛋白表達(dá)率高于對照組。結(jié)論氯化兩面針堿對小鼠S180肉瘤有抑

2、制作用，其機(jī)制可能與影響癌基因的表達(dá)有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  兩面針 氯化兩面針堿 抗腫瘤 中藥Abstract：ObjectiveTo investigate the anti-tumor effect of Nitidine chloride in vivo on Sarcoma180（Sl80）mice and its mechanism. MethodsThe antitumor effect of Nitidine chloride was evaluated by tumor weight. The expressions of p53、bcl-2 and bax prote

3、ins in the tissue were studied by immunohistochemistry. ResultsNitidine chloride significantly inhibited the growth of tumor, the inhibitory rate at the dose of 2.5，5，10mg · kg- 1 was 1.95%，27.3% and 42.9% respectively. The expression of p53，bcl-2 proteins was decreased obviously in the Nitidin

4、e chloride group as compared to control group, and the expression of bax was increased. ConclusionNitidine chloride has significant antitumor effect in vivo, and its influence on oncogene may be one of its anti-tumor mechanism.Key words：Zanthoxylum nitidum(Roxb.)DC;   Nitidine chloride;

5、60; Anti-tumor;  Traditional Chinese medicine氯化兩面針堿（Nitidine Chloride）是從廣西特有藥用植物兩面針Zanthoxylum nitidum (Roxb)DC的根中分離到的具有抗腫瘤活性的生物堿，據(jù)1報道，對LEWIS肺癌、人體鼻咽癌、肝癌、慢性粒細(xì)胞白血病等均有抑制作用。本課題組前期研究也證實2，氯化兩面針堿在體外能顯著抑制口腔鱗癌KB細(xì)胞的增殖，可導(dǎo)致細(xì)胞周期G2/M期阻滯，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為較系統(tǒng)地研究氯化兩面針堿的抗腫瘤活性，本實驗采用小鼠移植性肉瘤S180模型，評價氯化兩面針堿的體內(nèi)抗腫瘤活性，并研究氯化兩面針

6、堿對原癌基因和抑癌基因的影響，探討其可能的作用機(jī)制，為氯化兩面針堿的進(jìn)一步研究及開發(fā)利用提供依據(jù)。1  材料與儀器1.1  試劑和儀器氯化兩面針堿由廣西中醫(yī)藥研究所分離提純（純度95%），陽性對照藥環(huán)磷酰胺（CTX）購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司（批號07010821）；BCL-2，Bax，p53兔抗小鼠多克隆抗體購自SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY 公司：即用型二步法（非生物素）PV6001兔二步法檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備廠；病理組織切片機(jī)、病理圖像分析儀：德國Leica公司。1. 2 動物昆明小

7、鼠，SPF級，雌雄各半，體重（20±2）g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（桂）2003-0003。小鼠S180肉瘤荷瘤鼠購自廣西中醫(yī)藥研究所，由本實驗室接種保存。2 方法 2.1 小鼠S180肉瘤造模方法及檢測指標(biāo) 從S180傳代小鼠腹腔抽取乳白色瘤液以生理鹽水稀釋，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×1010·L-1。臺朌藍(lán)染色，鏡檢細(xì)胞存活率95%。取待接種小鼠消毒腋下皮膚，于超凈工作臺上將瘤細(xì)胞懸液以每只0.2 ml接種于小鼠右側(cè)腋窩皮下，30 min內(nèi)接種完畢。接種完成小鼠于動物房飼養(yǎng)，自由攝食飲水。接種24 h后開始給藥，分別設(shè)對照組（

8、腹腔注射生理鹽水），氯化兩面針堿高、中、低劑量組（分別腹腔注射氯化兩面針堿10，5，2.5 mg·kg-1），CTX組（腹腔注射CTX20 mg·kg-1），每組10只，1次/d。給藥10 d結(jié)束后，次日處死全部動物，剝離瘤塊，生理鹽水沖洗，濾紙吸干后稱重。腫瘤生長抑制率：抑瘤率（%）=（對照組平均瘤重-實驗組平均瘤重）/對照組平均瘤重×100%。2.2 光鏡觀察取各組S180 小鼠的瘤體，用中性福爾馬林固定，取材，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色。普通光學(xué)顯微鏡下分別觀察以下指標(biāo)：瘤細(xì)胞生長情況；瘤組織浸潤程度；核分裂數(shù)；血管數(shù)目；壞死程度。2.3 免疫組織化學(xué)法&#

9、160;剝離的瘤組織用中性福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，按試劑盒說明進(jìn)行染色，用PBS 代替一抗做陰性對照。結(jié)果判定：每批染色陽性對照片應(yīng)顯示為陽性，陰性對照片應(yīng)顯示為陰性，否則整批片重染。免疫組化染色半定量分析文獻(xiàn)3，在每個切片上、下、左、右、中各隨機(jī)選取一個400倍視野，觀察、計算陽性細(xì)胞數(shù)，計算總細(xì)胞數(shù)不少于1 000個。Bax、Bcl-2陽性定位于細(xì)胞漿或細(xì)胞核；p53陽性定位于細(xì)胞核。鏡下觀察各組免疫組化片進(jìn)行綜合評分。    陽性表達(dá)率： 陽性表達(dá)率為0計0分； 陽性表達(dá)率25%計1分； 陽性表達(dá)率為26%50%計2分； 陽性表達(dá)率為51%75%計

10、3分； 陽性表達(dá)率75%計4分。    表達(dá)強(qiáng)度： 陽性信號強(qiáng)烈，呈棕褐色，小塊狀，計為3分； 陽性信號中等，呈棕色，粗顆粒狀，計為2分； 陽性信號較弱，呈淡棕色，細(xì)顆粒狀，計為1分； 無陽性信號，計為0分。每個視野的染色得分為該視野各級染色強(qiáng)度得分與該強(qiáng)度陽性率得分的乘積之和，一個樣本的綜合得分取該樣本5個視野的染色得分均值。1         2.4 統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)用±s表示，用SPSS 10.0 行單因素方差分析。3 結(jié)果3.1 氯化兩面針堿對小鼠移植瘤生長的抑制作

11、用 實驗前期各組運動活動正常，精神狀態(tài)良好，食欲正常。接種后第3天，對照組和藥物組荷瘤鼠腋下移植瘤肉眼可見如黃豆大小。至第7天開始對照組小鼠瘤體生長迅速，小鼠活動減少。實驗后期，對照組出現(xiàn)運動少、毛發(fā)干燥、無光澤，消瘦明顯。藥物治療各組運動精神狀態(tài)較前為差，毛色白、有光澤，消瘦不明顯，飲食正常，瘤體生長較慢。至實驗結(jié)束時各組小鼠均無死亡。由表1可見氯化兩面針堿對小鼠移植性肉瘤S180的生長有較強(qiáng)的抑制作用，氯化兩面針堿中、高劑量組的腫瘤重量明顯降低，呈現(xiàn)很好的量效關(guān)系。與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其中高劑量組的腫瘤抑制率接近50%，與CTX相近，抑瘤效果較好。表1  氯

12、化兩面針堿對小鼠S180肉瘤的抑制作用（略）3.2 瘤組織病理形態(tài)學(xué)觀察對照組瘤細(xì)胞生長旺盛，細(xì)胞較密集或呈大片狀，核分裂數(shù)多，浸潤較深，部分至脂肪、肌層，血管較豐富，壞死范圍較小。氯化兩面針堿各組及陽性對照組上述各指標(biāo)程度較輕，有不同程度的壞死，間質(zhì)顯著增多，且有大量淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤。見圖12。3.3 免疫組織化學(xué)法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) S180小鼠肉瘤組織中氯化兩面針堿各組p53表達(dá)與對照組比較明顯下降；氯化兩面針堿組Bcl-2表達(dá)較對照組弱，而對照組中陽性表達(dá)較強(qiáng)，說明氯化兩面針堿各組p53，Bcl-2在S180肉瘤組織中的表達(dá)有下調(diào)的趨勢；氯化兩面針堿各組Bax的陽性表達(dá)與對照組

13、比較明顯增強(qiáng)，說明氯化兩面針堿可以上調(diào)S180肉瘤組織中Bax的蛋白表達(dá)。表2  免疫組織化學(xué)染色綜合評分（略）4 討論本實驗觀察不同濃度的氯化兩面針堿對小鼠S180肉瘤的抑制作用，氯化兩面針堿中、高劑量組的腫瘤重量明顯降低，其中高劑量組的腫瘤抑制率接近50%，與CTX相近。表明氯化兩面針堿在動物體內(nèi)有較強(qiáng)的抑瘤作用。 p53基因是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因，也是目前腫瘤疾病中最常發(fā)生變化的基因。研究表明，p53基因在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)、合成、細(xì)胞分化、凋亡等環(huán)節(jié)起著非常重要的作用4，5。p53分為野生型和突變型兩種。正常細(xì)胞中含野生型p53 基因及其p53

14、蛋白，在DNA 損傷修復(fù)中有著重要的作用，是DNA 損傷后進(jìn)行應(yīng)答和修復(fù)的分子物質(zhì)，對細(xì)胞分裂和增生起負(fù)調(diào)節(jié)作用，能維持細(xì)胞的的正常生長、抑制惡性增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。突變型p53蛋白抑癌功能喪失，通過正信號調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入增殖周期，最終使細(xì)胞生長和分化調(diào)節(jié)失控，導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)分裂和癌變。常規(guī)免疫組化方法檢測到的是突變型p53蛋白。近年來的研究表明，惡性腫瘤的發(fā)生不僅與癌基因激活和抑癌基因突變或缺失有關(guān)，還與腫瘤細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)。許多基因可通過自身編碼的蛋白發(fā)揮誘導(dǎo)或抑制凋亡的作用，其中Bcl-2家族基因便是與細(xì)胞凋亡關(guān)系比較密切的一組相關(guān)基因，Bcl-2基因能阻遏多種損傷和刺激引起的凋亡

15、，延長細(xì)胞的生存期。Bax是Bcl-2基因家族的一個成員， Bcl-2蛋白的活性可被Bax蛋白調(diào)節(jié)5，6，Bax蛋白不僅能和Bcl-2蛋白形成異源二聚體（Bax / Bcl-2）抑制凋亡，而且其自身還能形成同源二聚體（Bax/Bax）誘導(dǎo)凋亡，因此，Bax和bcl-2二者的相對水平(即Bax / Bcl-2 )影響細(xì)胞凋亡的發(fā)生，Bax / Bcl-2越高，細(xì)胞越易凋亡。Bax蛋白過度表達(dá)時，Bax同源二聚體增多，其對誘導(dǎo)凋亡的刺激因素更加敏感，但Bax蛋白單獨并不足以啟動凋亡途徑，Bax蛋白只是作為p53的下游應(yīng)答蛋白，與Bcl-2，p53共同參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡69。  &

16、#160; 本實驗應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測了氯化兩面針堿對S180荷瘤鼠肉瘤組織中p53，Bcl-2，Bax、蛋白表達(dá)的影響。實驗顯示，對照組腫瘤細(xì)胞中突變型p53，Bcl-2和Bax均有不同程度的表達(dá)，氯化兩面針堿突變型p53，Bcl-2表達(dá)較對照組弱，Bax表達(dá)較強(qiáng)。實驗結(jié)果提示，氯化兩面針堿可能通過某種機(jī)制直接或間接的抑制p53 基因的突變，促使突變的p53 基因發(fā)生逆轉(zhuǎn)，恢復(fù)損傷的DNA 修復(fù)能力，或者通過某種機(jī)制抑制突變型p53 表達(dá)，從而達(dá)到抑制腫瘤的作用，并改變Bax/Bcl-2的比值，改變凋亡的凋定點，使得凋亡力量在細(xì)胞內(nèi)占主導(dǎo)優(yōu)勢，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，但通過怎樣的方式進(jìn)行調(diào)節(jié)還

17、需進(jìn)一步研究。【】  1楊倉良.毒藥本草M.北京：中醫(yī)藥出版社,1993:431.2劉華鋼，王博龍，秦三海，等.氯化兩面針堿體外誘導(dǎo)人口腔鱗癌KB細(xì)胞G2/M期阻滯及凋亡的研究J .時珍國醫(yī)國藥,2007,18(9):2104.3Sinicrope FA, Ruan SB, Cleary KR, et al. Bcl-2 and p53 oncoproteins expression during colorectal mmorigenesisJ.Cancer Res, 1995, 55 (2):237.4EI-Aneed, Anas. Current strategies in c

18、ancer gene therapyJ. European Jouanal of Pharmacology. 2004,498 (3):1.5Almudévar E, Puras A, De Miguel C, et al. Value of the expression of p21RAS, p53, Bcl-2 oncoproteins and Ki-67(MIB-1) antigen of cellular proliferation in the diagnosis and prognosis of thyroi J. An Sist Sanit Navar. 2000, 23 (2): 247.6Zhu L，Wang ZR，Zhou LM，et al. Effects and Mechanisms of Isorhamnetin on Lung CarcinomaJ.Space Medicine&Medical Engineering, 2005,18(5):381.7Kamesaki H. Mechanisms involved in chemotherapy-induced apoptosis and their implications in cancer chemotherapy J. Int J He