柑桔黃龍病菌通用實時熒光PCR檢測方法

1、185四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局 發(fā)布2006-08-15實施2006-08-04發(fā)布小麥蚜蟲抗藥性測定技術(shù)規(guī)范The technical rule for mornitoring resistance of wheat aphis to insecticidesDB51/T 6112006DB51四川省地方標(biāo)準(zhǔn)ICS備案號：目 次1 主要內(nèi)容與適用范圍1872 規(guī)范性引用文件1873 術(shù)語和定義1874 儀器設(shè)備1875 實驗設(shè)計方法1886 試蟲的標(biāo)準(zhǔn)化1887 藥劑的標(biāo)準(zhǔn)化1888 藥劑處理方法1899 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法18910 抗藥性水平確定19011 建立數(shù)據(jù)庫190附錄A （資料性附錄

2、） 小麥蚜蟲抗藥性測定數(shù)據(jù)原始報表191前 言本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省農(nóng)業(yè)廳提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局批準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省農(nóng)業(yè)廳植物保護(hù)站負(fù)責(zé)起草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：彭麗年、張中明、蔣 凡、岳利華、李倫、楊啟洪。小麥蚜蟲抗藥性測定技術(shù)規(guī)范1 主要內(nèi)容與適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了小麥蚜蟲抗藥性測定技術(shù)、儀器設(shè)備、試驗設(shè)計方法、試蟲的標(biāo)準(zhǔn)化、藥劑的標(biāo)準(zhǔn)化、藥劑處理方法、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法、抗藥性水平確定。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于小麥蚜蟲的抗藥性測定，適用于以觸殺作用為主要作用方式的殺蟲劑的抗藥性測定。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引

3、用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)。然而，鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB 4285 農(nóng)藥安全使用標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8321 農(nóng)藥合理使用準(zhǔn)則NY/T 612-2002 小麥蚜蟲測報調(diào)查規(guī)范FAO,1980,FAO Plant Production and Protection Paper 21,Recommended Methods for Measurment of Pest Resistance to Pesticides3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1 抗藥

4、性 (Insect resistance to insecticides)是指昆蟲能忍受殺死正常種群大部分個體的殺蟲劑藥量的能力，并在種群中逐漸發(fā)展。3.2 點(diǎn)滴法 (Topical application)又稱局部施藥法，是一種用微量點(diǎn)滴器將藥液滴于昆蟲特定部位的定量處理方法。3.3 毒力 T(oxicity of insecticide)是指藥劑損害生物體的能力，即藥劑對靶標(biāo)生物的毒性。是在嚴(yán)格實驗控制條件下，藥劑對生物毒性的量度指標(biāo)，一般用反應(yīng)中值如LD50等表示。3.4 致死中量(LD50) (Median lethal dose)指在觀察時間內(nèi)，藥劑殺死種群(供試目標(biāo)昆蟲)50%時所

5、需要的藥劑劑量(g/頭或g/g)。3.5 敏感種群 (Susceptable populations)在未接觸過某種藥劑的地區(qū)采集或在室內(nèi)經(jīng)多代隔離飼養(yǎng)獲得的群體。3.6 敏感基線 (Susceptable toxicity baseline)用敏感種群測得的對某種藥劑的毒力曲線。4 儀器設(shè)備2恒溫養(yǎng)蟲室或光照培養(yǎng)箱毛細(xì)管微量點(diǎn)滴器：容積0.03L0.05L冰箱天平(萬分之一)玻璃儀器：容量瓶(10mL、25mL、50mL)、稱量瓶、移液管或加液器、燒杯、直徑5 cm塑料培養(yǎng)皿等。其它：毛筆、濾紙等。5 實驗設(shè)計方法5.1 測定方法采用室內(nèi)毒力測定的方法，比較種群敏感度。采用的反應(yīng)中值是以死亡

6、率為指標(biāo)的致死中量(LD50)。5.2 濃度設(shè)計測定前根據(jù)資料先做預(yù)備實驗，在16 84 的試蟲死亡時的藥量范圍，按照等比或等差級數(shù)設(shè)置6個濃度梯度，使藥量跨越中值的兩側(cè)。藥量間的死亡百分率應(yīng)比較均勻，如果差異太大，可不按等比或等差數(shù)列，抽去或插入適當(dāng)?shù)乃幜俊Ｔ陬A(yù)備實驗的基礎(chǔ)上，做正式實驗。 5.3 供試蟲數(shù)及重復(fù)每個濃度設(shè)34次重復(fù)，每重復(fù)處理3040頭蚜蟲，共處理90160頭蚜蟲。6 試蟲的標(biāo)準(zhǔn)化6.1 田間采蟲方法采取對角線取樣法。在小麥穗期隨機(jī)選取10塊未施藥麥田，每塊田對角線5點(diǎn)取樣，每點(diǎn)采集100頭無翅雌成蚜共采5000頭帶回室內(nèi)飼養(yǎng)一代，備用。6.2 飼養(yǎng)條件恒溫養(yǎng)蟲室或光照培養(yǎng)

7、箱。溫度(T)：22 24 ；相對濕度(RH)：75 80 ；飼料：小麥葉片。6.3 蟲態(tài)及性別無翅雌成蚜。7 藥劑的標(biāo)準(zhǔn)化7.1 藥劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)90 。7.2 溶劑丙酮：A·R。7.3 藥液配制7.3.1 配制方法 先將原藥稀釋為較低濃度的中間藥液(母液)，然后再進(jìn)一步配成不同藥量的供試藥液。母液配制：稱取一定的原藥(精確至0.0002 g)，置于容量瓶中，用溶劑溶解稀釋至刻度定容，搖勻備用。供試藥液配制：根據(jù)實驗設(shè)計配制6個藥液質(zhì)量濃度，待用。7.3.2 計算方法a)原藥取用量X1 (g)按式(1)計算:X1=C×V×10-6.(1)P式中：X1原藥取用量，單位

8、g；C母液質(zhì)量濃度，單位g/mL；V母液體積，單位mL；P原藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)，單位。b)供試藥液質(zhì)量濃度X2(g/mL)按式(2)計算:X2=C.(2)A式中：X2 供試藥液質(zhì)量濃度，單位g/mL；C 母液質(zhì)量濃度，單位g/mL；A 稀釋倍數(shù)。c)每頭蟲受藥量X3(g/頭)按式(3)計算：X3=V1× X2.(3)1000式中：X3 每頭蟲受藥量，單位g/頭；V1 點(diǎn)滴量，單位LX2供試藥液質(zhì)量濃度，單位g/mL8 藥劑處理方法8.1 方法采用毛細(xì)管微量點(diǎn)滴法。毛細(xì)管體積為0.03 L0.05 L。8.2 步驟選擇健康無翅雌成蚜，用毛筆挑起放在濾紙上，每張放5頭，用干凈的毛細(xì)管微量點(diǎn)滴器將

9、藥液定量點(diǎn)滴在供試蚜蟲腹部背面，點(diǎn)滴時毛細(xì)管應(yīng)盡量貼近蟲體再擠出液滴，先點(diǎn)滴對照丙酮液，再由低濃度向高濃度逐一點(diǎn)滴藥液。用毛筆輕輕將點(diǎn)滴后的蚜蟲掃入養(yǎng)蟲盒內(nèi)，加蓋放好。8.3 觀察將處理好的蚜蟲置于溫度(T)2225 ，相對濕度(RH)75%85%的條件下，5h后用手持放大鏡(10倍)檢查蚜蟲死亡數(shù)。死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)是以毛筆輕觸蟲體，蟲體完全不動即為死亡。如果對照死亡率大于10%，應(yīng)重做。9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法9.1 致死中量單位g /頭。9.2 計算校正死亡率處理組校正死亡率X4()、X5()用式(4)、式(5)計算：X4()Y1Y2 ×100(4)Y1 或：X5()Y3Y4 ×

10、;100(5)1Y4 式中:X4()、X5()處理組校正死亡率；Y1對照組存活率，單位為百分?jǐn)?shù)(%)；Y2處理組存活率，單位為百分?jǐn)?shù)(%)；Y3處理組死亡率，單位為百分?jǐn)?shù)(%)；Y4對照組死亡率，單位為百分?jǐn)?shù)(%)。9.3 求毒力回歸方程和致死中量采用機(jī)率值分析法。采用抗藥性統(tǒng)計數(shù)據(jù)處理及管理系統(tǒng)(簡稱IRM系統(tǒng))統(tǒng)計計算，直接輸入點(diǎn)滴量(L)、各組濃度(g /mL)、總蟲數(shù)和死亡蟲數(shù)，得出直線回歸方程(LDp)、r 值、卡方值(X2)、LD50(g/頭)、LD95(g/頭)、LD99(g/頭)、標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)及LD50置信限(95)等。10 抗藥性水平確定10.1 抗性指數(shù)抗藥性的確定采用比

11、較群體對藥劑的敏感度(反應(yīng)中值)的方法，求出抗性指數(shù)，按式(6)計算。小數(shù)點(diǎn)后保留一位數(shù)。X6 R .(6)S式中：X6 抗性指數(shù)；R 測定種群LD50值；S 敏感基線LD50值。10.2 抗性水平標(biāo)準(zhǔn)抗性指數(shù)15，為相對敏感；抗性指數(shù)5.110，為低抗水平；抗性10.140，為中抗水平；抗性指數(shù)40.1160，為高抗水平；抗性指數(shù)160，為極高抗水平。11 建立數(shù)據(jù)庫建立小麥蚜蟲抗藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)庫，將測定的所有原始數(shù)據(jù)及計算結(jié)果按時間、地點(diǎn)建立檔案，長期保存。附錄A （資料性附錄）小麥蚜蟲抗藥性測定數(shù)據(jù)原始報表No：試蟲學(xué)名:存藥方式:采蟲地點(diǎn):致死中量:采蟲時間:測定時間:飼養(yǎng)代數(shù):作物生育期:試蟲蟲態(tài):稀釋溶劑:寄主作物:觀察時間:測前飼料: 飼養(yǎng)情況:測后飼料:測定方